Yeni nanoemülsiyon aşısı, hastalık taktik tedavisinde büyük avantajlara sahiptir. Bu set etkileri, benzersiz tümör kopisizmi, spesifik taktiklerin tanımlanması ve düşük sistemik toksisite gibi özelliklerle en aza indirilir. Protokolün, yeni T hücresi ektipi peptid mukozal aşılarının gelecekteki gelişimi için teknik ve teorik ipuçları sağlayacağını tahmin ediyoruz.
Bir miligram monofosforol lipit A'yı 100 mikrolitre DMSO ile karıştırarak başlayın. Beş dakika boyunca vorteks yapın ve oda sıcaklığında dört saat boyunca çözünmeye bırakın. Kantitatif olarak TWEEN 80 ve I-OVA'yı ekleyin.
Bileşenleri karıştırın ve skualen ekleyin. Daha sonra, hazırlanan karışıma 100 mikrolitre MPLA çözeltisi ekleyin. Nano emülsiyon aşısını hazırlamak için, karışık çözeltiyi toplam hacmin yaklaşık% 70'inde su damlacıklarına ekleyin ve şeffaf ve kolay akan bir karışım elde etmek için hafifçe karıştırın.
İn vitro testler için, BEAS2B epitel hücrelerini canlandırmakla başlayın. Su banyosunu açın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın. Dondurulmuş hücre şişelerini, 37 santigrat derecede temperlenmiş bir su banyosunda hızla çözün.
Çözüldükten sonra, hücreleri hızlı bir şekilde 15 mililitrelik steril bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve tam büyüme ortamının iki mililitresini ekleyin. Tüpü beş dakika boyunca 129 G'de santrifüjleyin. Supinatantı çıkarın ve hücreleri tam büyüme ortamının iki mililitresinde yeniden askıya alın.
Hücreleri bir kez daha santrifüj ettikten sonra, supinantı çıkarın ve hücreleri yeniden askıya almak için altı mililitre tam büyüme ortamı ekleyin. Daha sonra hücreleri bir T25 kültür şişesine aktarın ve% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücre yoğunluğu% 80 ila% 90'a ulaştığında, kültür ortamını atın ve hücreleri iki mililitre PBS ile iki kez yıkayın.
Hücreleri bir ila iki dakika boyunca sindirmek için bir mililitre% 0.25 tripsin ekleyin. Hücrelerin yuvarlanması gözlendiğinde, tripsini nötralize etmek için hemen dört mililitre tam büyüme ortamı ekleyin. Numuneleri 15 mililitrelik steril bir santrifüj tüpünde karıştırın ve aspire edin.
Numuneleri beş dakika boyunca 129 G'de santrifüj edin. Supinatant'ı çıkarın ve hücreleri bir mililitre RPMI 1640 tam ortamda yeniden askıya alın. Hücre sayımı için hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini kullanın ve hücreleri mililitre başına 10 ila beşinci hücrelere bir kez seyreltin.
Daha sonra BEAS2B hücrelerini, 100 mikrolitre RPMI 1640 tam ortamda 96 kuyucuk plakasında kuyu başına 10 ila dördüncü hücreler arasında bir kez daha bir yoğunlukta plakalayın ve plakaları daha önce gösterildiği gibi 24 saat boyunca önceden inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, supinatantı atın ve 96 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre RPMI 1640 ekleyin. I-OVA nano emülsiyonunun her birine 100 mikrolitre, BNE ile karıştırılmış I-OVA ve kontrol olarak BNE ile çeşitli son konsantrasyonlarda tam bir büyüme ortamı ile önceden seyreltilmiş I-OVA ekleyin ve 37 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin.
Kuluçka tamamlandığında, ortamı çıkarın ve plakayı karanlık bir yere aktarın. Plakanın her bir kuyucuğuna 90 mikrolitre tam büyüme ortamı ve 10 mikrolitre CCK8 çözeltisi ekleyin. Plakayı iki saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Her bir kuyucuğun emilimini 450 nanometrede bir enzim etiketli plaka okuyucu kullanarak ölçün. Üç gün boyunca I-OVA, I-OVA plus BNE ve I-OVA NE ile farelerin nazal bağışıklamasını gerçekleştirmek için 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın. Deneysel kontrol olarak BNE ve PBA'yı kullanın.
Daha sonra, yaklaşık üç milimetre kalınlığında burun dokusu örneklerini makasla kesin ve% 4 paraformaldehit içine yerleştirin. Akciğer dokularını çıkarın ve burun ve tüm akciğer dokularını 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin. TEM ve AFM, yüzey zeta potansiyelinin temel özelliklerinin ve nano aşının partikül boyutunun değerlendirilmesinde kullanılır.
Musin stabilite analizlerinde I-OVA NE'nin partikül boyutları, polidispersite indeksleri, zeta potansiyelleri ve elektroforez hareketliliği gösterilmiştir. BEAS2B hücrelerinin göreceli canlılığı, 24 saat boyunca farklı peptid konsantrasyonları I-OVA, BNE + I-OVA ve I-OVA NE'ye maruz kalan kültürlerde% 80'den fazladır. I-OVA EN grubunda belirgin bir mukozal toksisite, doku hasarı, kanama veya inflamatuar hücre infiltrasyonu yoktu.
Epitelyal BEAS2B hücreleri, su çözeltisininkinden daha fazla I-OVA NE etiketli FITC yakaladı. I-OVA NE in vitro sürekli salınım etkisi IV-IS sistemi kullanılarak analiz edildi. I-OVA NE aşısı, I-OVA'nın sulu çözeltisine kıyasla sürekli bir salınım etkisine sahipti.
I-OVA NE grubunda, yüzde sağkalım süresi diğer gruplara göre daha yüksektir ve tümör hacmi anlamlı derecede daha küçüktür, bu da diğer gruplardan daha iyi bir önleyici koruma etkisine sahip olduğunu düşündürmektedir. Terapötik modelde, medyan sağkalım süresi farklı gruplar arasında anlamlı olarak farklıydı. I-OVA NE grubunun tümör hacmi, I-OVA grubundakinden anlamlı olarak daha küçüktü.
Karışımın eşit şekilde karıştırılması bu prosedürde önemlidir. Aksi takdirde nanoaşıların verimliliğini azaltacaktır.
