Bu çalışma, Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], Ulusal Cheng Kung Üniversitesi [K111-B094], [K111-B095], Ulusal Cheng Kung Üniversitesi Hastanesi, Tayvan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].

1. C. glabrata'nın kültürlenmesi
NOT: Deneyler için flukonazol de dahil olmak üzere çoğu antifungal ajana dirençli, çoklu ilaca dirençli bir C. glabrata (C2-1000907) kullanılmıştır. Farklı suşlar arasında farklılıklar olabileceğinden, deneysel koşulların spesifik suşa uyarlanması gerekebilir. Tüm deneyler, tutarlılık için 25 ° C'de (doğal enfeksiyonu taklit ederek) yetiştirilen log faz Candida'yı kullandı. C. glabrata'nın hif eksikliği, 37 ° C'de hif oluşturan C. albicans ile karşılaştırıldığında miktar tayinini basitleştirir10.
<ol><li>C. glabrata'nın log faz kültürünü hazırlamak için, bir agar plakasından tek bir koloni seçin ve bunu 3 mL steril maya pepton dekstroz (YPD) ortamı içeren bir cam test tüpüne aktarın (bkz. Çalkalayarak 25 ° C'de 14-16 saat inkübe edin (155 rpm, ortama hava iletimini artırmak için 45 ° açı).</li>
	<li>İnkübasyondan sonra, kültürü steril teknik kullanarak taze YPD ile 0.1 OD600'e seyreltin. 25 °C'de 6 saat boyunca 155 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. OD600'ü ölçerek C. glabrata'nın günlük fazını doğrulayın. 1 × 10 7-1.5 × 10 7 hücre/mL'ye karşılık gelen 0.65-1.00'ı hedefleyin.</li>
</ol>2. Etidyum bromür, flukonazol ve fotodinamik tedavi ile minyon kolonilerin indüksiyonu
<ol><li>Etidyum bromür minyon koloni indüksiyonu<ol><li>Bir maya süspansiyonunu YPD ile 3 mL'likbir nihai hacme kadar 0.1 (5 × 106 hücre / mL) OD 600'e ayarlayın, ardından 30 μL etidyum bromür stoğu ekleyin (10 mg / mL) (100 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyon için Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Maya süspansiyonunu gece boyunca (16-18 saat) 25 °C, 155 rpm, 45° açıyla inkübe edin. 0,65 (1 × 107 hücre/mL) OD600'e ayarlayın. Kuyucuk başına 180 μL PBS'ye 20 μL ayarlanmış maya süspansiyonu ekleyerek 96 oyuklu bir plakada 10 katlı bir seyreltme serisi gerçekleştirin. Bu, 10-1 ila 10-5 arasında değişen altı seyreltme oluşturur.</li>
		<li>4 seyreltme faktörü seçin (ör., 100, 101, 102 ve 103) ve YPD agar plakalarının (üçlü) 4 çeyreğinde her biri 3 damla (20 μL) plaka.</li>
		<li>Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) boyama11 için önceden seçilen seyreltmelerden 5-80 kolonili kadranları seçin (bkz. adım 3). 48 bit tam renkli optik tarayıcı kullanarak plakaları 1200 dpi'de tarayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Flukonazol minyon koloni indüksiyonu NOT: İşlemi hızlandırmak için, flukonazol kaynaklı minyon koloni oluşumu için T3 hücrelerini (3 RB-PDT tedavisinden sonra elde edilen normal ve minyon hücrelerin bir karışımı; bkz. adım 2.3) kullanın. Bunun nedeni, standart tedavinin tipik olarak daha yavaş oluşumla sonuçlanmasıdır.<ol><li>Adım 2.1.1'de açıklandığı gibi bir maya hücresi süspansiyonu hazırlayın ve ayarlayın.</li>
		<li>Gece boyunca (16-18 saat) 25 °C'de inkübe edin. OD600'ü tekrar 0.1'e ayarlayın.</li>
		<li>Ayarlanmış süspansiyonun 1 mL'sini steril 5 mL'lik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Steril bir pamuklu çubuğu (15 cm uzunluğunda, 0,9 cm x 2,6 cm uçlu, Malzeme Tablosuna bakın) maya süspansiyonuna batırın, tüp tabanı ile teması sağlayın ve fazla sıvıyı tüp duvarından çıkarmak için bükün.</li>
		<li>Mueller-Hinton agar kullanarak kaputtaki plakaları hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
		<li>Pamuğu agar üzerinde ileri geri sürün, iki kez 60° döndürün, ardından eşit kapsama alanı için çevresini temizleyin.</li>
		<li>Forsepsleri 1-2 saniye alev üzerinde sterilize edin, kısa bir süre soğumalarına izin verin, ardından boş diskleri almak için kullanın.</li>
		<li>Bir işaretleyici kullanarak plakayı üç eşit sektöre bölün. Her sektörün ortasına bir boş disk yerleştirin.</li>
		<li>Her diske (25 μg/disk) 12,5 μL flukonazol stoğu (2 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, kabarcıkları önlemek için iyice karıştırın ve 37 ° C'de 20-24 saat inkübe edin.</li>
		<li>TTC boyamayı gerçekleştirin (bkz. adım 3). 48 bit tam renkli optik tarayıcı kullanarak plakaları 1200 dpi'de tarayın.</li>
	</ol></li>
	<li>PDT minyon koloni indüksiyonu NOT: Farklı mantarlar, PDT'den sonra farklı sayıda minyon koloni üretebilir. Bazı suşlar hiç üretmeyebilir.<ol><li>aPDT sistemini hazırlayın. NOT: aPDT sistem cihazı için kurulum prosedürü, Hung ve ark.12 tarafından bildirilen yöntemi takip eder. Kısaca, aPDT sistemi, 520 nm'de bir tepe noktasına sahip yeşil bir LED dizisinden oluşur (Malzeme Tablosuna bakınız), 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğu ile iyi bir hizalama ile alttan ışık parlar.</li>
		<li>YPD ortamındaki maya hücresi süspansiyonunu 0.65 OD600'e (yaklaşık 1 × 107 hücre / mL) ayarlayın.</li>
		<li>1 mL maya süspansiyonunu 111 μL %2 gül bengal (RB, Şekil 1) ile karıştırın (Malzeme Tablosuna bakınız) yuvarlak kapaklı bir tüpte %0.2'lik bir nihai RB konsantrasyonu elde etmek için. Karışımı 25 °C'de 15 dakika inkübe edin ve 155 rpm'de 45°'lik bir açıyla döndürün.</li>
		<li>Karışımı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 16.100 x g'da 2.5 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı atın ve peleti yeniden süspanse etmek için tüpü davlumbaz zemininde beş kez hafifçe kazıyın.</li>
		<li>Tüm RB'yi çıkarmak için süspansiyonu 1x PBS ile dört kez yıkayın. Her yıkamayı, kapsamlı bir yeniden süspansiyon için kısa bir vorteksleme veya pipetleme ile peletin yeniden süspansiyonu takip eder.<ol><li>Son yıkamadan sonra 1000 μL PBS ekleyin. Çözelti açık pembe renktedir. Yıkanmış RB yüklü maya süspansiyonunun 200 μL'sini 96 oyuklu bir plakadaki (üç katlı) üç kuyucuğun her birine aktarın.</li>
		</ol></li>
		<li>96 oyuklu plakayı, aşağıdan yeşil ışık saçan LED ampullerle fotodinamik ışık sistemine yerleştirin. Eşit aydınlatma sağlamak ve paraziti önlemek için oda ışıklarını kapatın. 2 dakika boyunca 4.38 J /cm2 PDT dozunu vermek için LED ışık sistemini etkinleştirin; Sistemin kuyularla düzgün şekilde hizalandığından emin olun.</li>
		<li>Işınlamadan sonra, maya süspansiyonunu 96 oyuklu bir plakada seyreltin. 180 μL PBS içeren bir kuyucuğa 20 μL maya süspansiyonu ekleyin ve 10 kat seyreltme oluşturun. 10-1 ila 10-5 aralığına ulaşmak için kalan seyreltmeler için tekrarlayın.</li>
		<li>Maya hücresi konsantrasyon ayarına bağlı olarak dört seyreltme faktörü (örneğin, 10-2 ila 10-5) seçin.</li>
		<li>Her seyreltme faktörü için, YPD agar plakaları üzerinde kadran başına 3 damla (her biri 20 μL) plaka.</li>
		<li>Maya süspansiyonu tamamen emildikten sonra, agar plakaları tarafından yaklaşık 10 dakika ters çevirin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.</li>
		<li>T0'ı PDT tedavisi olmayan kontrol ebeveyni C. glabrata olarak tanımlayın. T0 mantarlarını yukarıda tarif edildiği gibi kütük büyüme aşamasında hazırlayın ve bunları %0,2 RB varlığında 4,38 J/cm2 yeşil ışığa maruz bırakın. Bu PDT koşulu sürekli olarak 3 ila 3.5 log mantar büyümesini engeller.<ol><li>Hayatta kalan mantarları T1 olarak belirtin ve in vitro olarak bir log büyüme aşamasına genişletildikten sonra tekrar aynı PDT dozuna maruz bırakın. İkinci PDT'den sonra hayatta kalan mantarlar T2 ve benzeri olarak gösterilir.</li>
		</ol></li>
		<li>Ertesi gün, koloni sayısı 5 ile 80 arasında olan kadranları seçin. Her kadrandaki koloni sayısını sayın ve titreyi aşağıdaki formülle hesaplayın: Koloni oluşturan birim (CFU)/mL = Koloni sayısı (üçlü ortalama) × Seyreltme faktörü × 50.</li>
		<li>TTC boyamayı gerçekleştirin (bkz. adım 3). Plakayı daha önce açıklandığı gibi tarayın (adım 2.2).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Mitokondriyal fonksiyon analizi (TCC boyama testi)
NOT: TTC bir redoks göstergesi ve bir elektron alıcısıdır. Beyaz bileşikler elektronlar11 tarafından parçalandığında kırmızıya döner. Tüm hücrelerin, bir agar plakası üzerinde kültürden sonraki 24 saat içinde mutlaka görünür koloniler oluşturmadığını unutmayın. Fonksiyonel mitokondriye sahip koloniler kırmızıya dönerken, fonksiyonel olmayan mitokondriye sahip olanlar beyaz kalır. Bu, farklı mitokondriyal işlevselliğe sahip koloniler arasında ayrım yapılmasına izin verir.
<ol><li>İşlemden sonra, kolay görselleştirme ve boyama için farklı koloniler elde etmek için YPD agar plakaları üzerindeki Candida süspansiyonlarını istenen hücre yoğunluğuna göre seyreltin.</li>
	<li>37 ° C'de 24 saatlik büyümeden sonra, tek bir hücreden görünür koloniler oluşur. 20 μL %20 TTC'yi doğrudan her koloninin merkezine pipetleyin.</li>
	<li>Tamamen emildikten sonra, koloniler tarafından yaklaşık 10 dakika TTC, 37 ° C'de 30-40 dakika inkübe edilir.</li>
</ol>4. Normal ve minyon C. glabrata'nın büyüme kinetiği
NOT: Üç maya suşu karşılaştırıldı: C. glabrata C2-1000907 T0 (PDT tedavisi olmayan klinik izolat), T3n (C. glabrata C2-1000907, ebeveyn hücrelerine benzer şekilde ortalama çapı 1.5 ± 0.8 mm olan 3 ardışık RB-PDT sergileyen kolonilerden sonra) ve T3p (3 ardışık RB-PDT'den sonra C. glabrata C2-1000907'nin minyon kolonileri).
<ol><li>YPD ortamındaki maya hücresi süspansiyonunu 3 mL'lik bir tüpte 0.1 (5 × 106 hücre / mL) OD600'e ayarlayın.</li>
	<li>Çok modlu mikroplaka okuyucuyu kullanarak statik kültürün OD600'ünü her 20 dakikada bir otomatik olarak ölçün (Malzeme Tablosuna bakın) 24 saat boyunca.</li>
</ol>

Candida glabrata'da Minyon Koloni Oluşumu ve İlaç Direncinin Analizi

<ol>
	<li>Soriano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+candidiasis:+current+clinical+challenges+and+unmet+needs+in+adult+populations.">Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations.</a> J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).</li><li>Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+candidiasis.">Invasive candidiasis.</a> Nat Rev Dis Primers. 4, 18026 (2018).</li><li>Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiologic+features,+clinical+characteristics,+and+predictors+of+mortality+in+patients+with+candidemia+in+Alameda+County,+California;+a+2017-2020+retrospective+analysis.">Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis.</a> BMC Infect Dis. 22 (1), 843 (2022).</li><li>Whittaker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+petite+mutation+in+yeast.">The petite mutation in yeast.</a> Subcell Biochem. 6, 175-232 (1979).</li><li>Hatab, M. A., Whittaker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+respiration-deficient+mutants+from+the+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).</li><li>Defontaine, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+resistance+to+azoles+associated+with+mitochondrial+DNA+deficiency+in+Candida+glabrata.">In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata.</a> J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).</li><li>Brun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+respiration+and+susceptibility+to+azole+antifungals+in+Candida+glabrata.">Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).</li><li>Bouchara, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+selection+of+an+azole-resistant+petite+mutant+of+Candida+glabrata.">In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata.</a> J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).</li><li>Badrane, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+diversity+and+unrecognized+antifungal+resistance+among+populations+of+Candida+glabrata+from+positive+blood+cultures.">Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures.</a> Nat Commun. 14 (1), 5918 (2023).</li><li>Shantal, C. -. J. N., Juan, C. -. C., Lizbeth, B. -. U. S., Carlos, H. -. G. J., Estela, G. -. P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+is+a+successful+pathogen:+An+artist+manipulating+the+immune+response.">Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response.</a> Microbiol Res. 260, 127038 (2022).</li><li>Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+dubliniensis+and+Candida+albicans+differentiation+by+colony+morphotype+in+Sabouraud-triphenyltetrazolium+agar.">Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar.</a> Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).</li><li>Hung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rose+bengal-mediated+photodynamic+therapy+to+inhibit+Candida+albicans.">Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans.</a> J Vis Exp. (181), e63558 (2022).</li><li>Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivity+of+bovine+whey+proteins,+peptides,+and+amino+acids+toward+triplet+riboflavin+as+studied+by+laser+flash+photolysis.">Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis.</a> J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).</li><li>Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+petite+induction+and+the+recovery+of+respiratory+competence+in+yeast+cells+exposed+to+ethidium+bromide.">Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide.</a> Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).</li><li>Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+petite+mutation+in+yeasts:+50+years+on.">The petite mutation in yeasts: 50 years on.</a> Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).</li><li>Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+the+yeast+mitochondrial+genome.">Inheritance of the yeast mitochondrial genome.</a> Plasmid. 31 (3), 229-241 (1994).</li><li>Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+effects+of+toluidine+blue-mediated+photodynamic+action+on+Vibrio+vulnificus.">Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).</li><li>Wong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indocyanine+green-mediated+photodynamic+therapy+reduces+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+drug+resistance.">Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance.</a> J Clin Med. 8 (3), 411 (2019).</li><li>Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+to+control+microbial+biofilms.">Photodynamic therapy to control microbial biofilms.</a> Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090 (2021).</li><li>Hung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+photodynamic+therapy+against+fungal+keratitis.">Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis.</a> Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Bu çalışma, PDT'yi Candida'da minyon koloni oluşumunu indüklemek için bildirilen ilk yöntem olarak ortaya koymakta ve etidyum bromür ve flukonazolün yerleşik etkilerini aşmaktadır. Bu yeni gözlem, virülansı azaltarak hem mantar eradikasyonu hem de direnç mekanizmalarının ortaya çıkması üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmektedir.
RB aracılı PDT, C. glabrata'nın büyümesini etkili bir şekilde inhibe ede...

Mantar enfeksiyonları, özellikle Candida albicans ve ilaca giderek daha dirençli Candida glabrata'nın neden olduğu enfeksiyonlar, ciddi bir küresel tehdit oluşturmaktadır1. Bu enfeksiyonlar, özellikle hastanede yatan hastalar ve bağışıklık sistemi zayıflamış olanlar için ölümcül olabilir. Artan antifungal direnç, özellikle Candida albicans2'den yüksek mortalite ile ciddi bir mantar enfeksiyonu olan invaziv kandidiyazisin kontrolünü tehdit eder. Dirençli suşlar etkili tedaviyi engelleyerek potansiyel olarak hem karmaşıklığı hem de ölüm oranlarını artırır. ABD'nin Kaliforniya eyaletine bağlı Alameda County'de C. glabrata en yaygın istilacı tür haline gelmiştir3. Candida türlerinin prevalansı ve dağılımındaki bu değişim, yerel sağlık uygulamaları, hasta demografisi, antifungal ajanların kullanımı ve Candida enfeksiyonları için risk faktörlerinin prevalansından etkilenebilir.
Fonksiyonel mitokondriden yoksun olan Candida'daki minyon mutantlar, bu organelin ilaç tepkisini, virülansı ve stres direncini nasıl etkilediğini ortaya koymaktadır 4,5. C. glabrata bu kolonileri kolayca oluşturur, polienlere karşı duyarlılık kazanırken onu azollerekaybeder 6. Azol duyarlılığı ve solunum fonksiyonu karmaşık bir şekilde bağlantılıdır ve mitokondriyal DNA kaybı yoluyla dirence yol açan azalmış solunumile 7. Azol direncine sahip C. glabrata'nın minyon kolonileri, flukonazol tedavisi gören bir kemik iliği nakli alıcısından8 insan dışkı örneklerinden ve kan dolaşımı enfeksiyonu olan hastaların kan kültürü şişelerinden9 izole edilmiştir. İlaç direnci, virülans ve stres tepkisindeki potansiyel etkileri, klinik önemlerini vurgulamaktadır. Ek olarak, farklı özellikleri onları mitokondriyal biyolojideki temel soruları araştırmak için değerli araçlar haline getirir5. Minyon mutantlarla ilgili araştırmalar devam ettikçe, hem klinik hem de temel araştırmalardaki uygulamalarının genişlemesi muhtemeldir.
Bu çalışma, fotodinamik tedavinin (PDT) C. glabrata'da minyon kolonileri indükleyebileceğini ve C. glabrata'yı etidyum bromür veya flukonazole maruz bırakmanın geleneksel tekniklerinin ötesine geçen yöntem yelpazesini genişletebileceğini keşfetti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Merck, Taipei, Taiwan</td>
			<td>Millex, SLGVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tube</td>
			<td>Neptune, San Diego, USA</td>
			<td>#3745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>T8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene round bottom tube</td>
			<td>Corning, AZ, USA</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning, AZ, USA</td>
			<td>Falcon, #352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan</td>
			<td>#16196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BRS, Tainan, Taiwan</td>
			<td>AG012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blank disk</td>
			<td>Advantec, Tokyo, Japan</td>
			<td>49005040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, UK</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluconazole, 2 mg/mL</td>
			<td>Pfizer, NY, USA</td>
			<td>BC18790248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green light emitting diode (LED) strip</td>
			<td>Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan</td>
			<td>5050</td>
			<td>Excitation wave: 500~550 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature. shake Incubators</td>
			<td>Yihder, Taipei, Taiwan</td>
			<td>LM-570D (R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth care cotton swabs</td>
			<td>Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan</td>
			<td>161357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller Hinton II agar</td>
			<td>BD biosciences, California, USA</td>
			<td>211438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OD600 spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom, London, UK</td>
			<td>Ultrospec 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>330000</td>
			<td>stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized glass tube</td>
			<td>Sunmei, Tainan, Taiwan</td>
			<td>AK45048-16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose Medium</td>
			<td>HIMEDIA, India</td>
			<td>M1363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of petite colonies in candida glabrate via rose bengal-mediated photodynamic therapy

Kandidemi hastalarında %40'lık bir mortalite oranıyla karşı karşıya kalan ilaca dirençli Candida ve minyon mutantları önemli bir tedavi zorluğu olmaya devam etmektedir. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), antibiyotikler/antifungallerden farklı olarak çoklu mantar yapılarını hedefler ve potansiyel olarak direnci engeller. Minyon kolonileri indüklemek için geleneksel yöntemler, ilaca duyarlılığı ve stres tepkilerini etkileyebilen etidyum bromür veya flukonazole dayanır. Bu çalışma, ilaca dirençli bir Candida glabrata izolatı ile mücadele etmek için yeşil ışık (tepe 520 nm) ve gül bengal (RB) ışığa duyarlılaştırıcı uygulamasını araştırdı. Bulgular, aPDT tedavisinin hücre büyümesini önemli ölçüde inhibe ettiğini (%≥99.9 azalma) ve mitokondriyal redoks indikatör boyamasının boyutunun azalması ve kaybıyla kanıtlandığı gibi minyon koloni oluşumunu etkili bir şekilde indüklediğini ortaya koydu. Bu çalışma, aPDT'nin in vitro olarak çok ilaca dirençli bir C. glabrata suşunda minyon kolonileri indükleyebileceğine dair ilk kanıtları sağlamakta ve dirençli mantar enfeksiyonlarıyla mücadele için potansiyel olarak dönüştürücü bir yaklaşım sunmaktadır.

Fungal infections, particularly those caused by Candida albicans and increasingly drug-resistant Candida glabrata, pose a serious global threat1. These infections can be deadly, especially for hospitalized patients and those with weakened immune systems. Rising antifungal resistance threatens the control of invasive candidiasis, a severe fungal infection with high mortality, especially from Candida albicans2. Resistant strains hinder effective treatment, potentially increasing both complexity and death rates. In Alameda County, California, USA, C. glabrata has become the most prevalent invasive species3. This shift in the prevalence and distribution of Candida species may be influenced by local healthcare practices, patient demographics, the utilization of antifungal agents, and the prevalence of risk factors for Candida infections.
Petite mutants in Candida, lacking functional mitochondria, reveal how this organelle affects drug response, virulence, and stress resistance4,5. C. glabrata readily forms these colonies, gaining sensitivity to polyenes while losing it to azoles6. Azole sensitivity and respiratory function are intricately linked, with diminished respiration leading to resistance via mitochondrial DNA loss7. Petite colonies of C. glabrata with azole resistance have been isolated from human stool samples from a bone marrow transplant recipient undergoing fluconazole treatment8 and from blood culture bottles of patients with bloodstream infections9. Their potential implications in drug resistance, virulence, and stress response highlight their clinical significance. Additionally, their distinct properties make them valuable tools for investigating fundamental questions in mitochondrial biology5. As research into petite mutants continues, their applications in both clinical and basic research are likely to expand.
This study discovered that photodynamic therapy (PDT) can induce petite colonies in C. glabrata, expanding the range of methods beyond the traditional techniques of exposing C. glabrata to ethidium bromide or fluconazole.

Yazar Spotlight: Antifungal Araştırmalar için İlaca Dirençli Candida'da Minyon Kolonileri İndüklemek İçin Yeni Bir Yaklaşım Olarak Fotodinamik Terapi

Rose Bengal Aracılı Fotodinamik Terapi ile Candida glabrate'de Minyon Kolonilerin İndüksiyonu

The research aims to use photodynamic therapy, also known as PDT, to fight against drug-resistant Candida infection. In this study, we are trying to answer how effectively PDT kills the fungi, and how the virulence of the fungi changes after the treatment. We found petite colonies from the after PDT.Present methods for inducing petite colonies rely on ethidium bromide or fluconazole, which may work through different pathways on drug resistance and the stress responses, compared to PDT. Recently, petite colonies of Candida have become a significant concern in the clinic because they may resist medication and increase mortality rates. Photodynamic therapy has become one of the antifungal treatments and our finding helps breach the gap between traditional methods used to study petite colonies.Our findings provide evidence that PDT can induce petite colonies in drug resistant Candida in-vitro, presenting a groundbreaking method to study petite colonies. We'll definitely delve deeper into this field. There are many questions to be answered.How and why do petite colonies form after PDT stress? Do different Candida species respond differently? I believe it's a never ending story to be explored.

Veriler, standart ± hata ile ortalama olarak sunulmuştur ve her grupta en az üç kopya olmak üzere üç bağımsız deneyden elde edilmiştir. Koloni sayımları, OD600 ölçümleri ve TTC boyama sonuçları dahil olmak üzere deneysel veriler, grafik ve istatistiksel yazılım kullanılarak grafiklendirildi ve istatistiksel olarak analiz edildi (bkz. Verilerin analizinde tek yönlü varyans analizi (ANOVA) veya t-testi kullanıldı ve p-değeri <0.05 olarak anlamlı kabu...

Watch this Scientific Journal Video about Photodynamic Therapy as a Novel Approach to Induce Petite Colonies in Drug-Resistant Candida for Antifungal Research at JoVE.com

Candida spp. ilaç direncinde minyon kolonilerin önemi tam olarak araştırılmamıştır. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), ilaca dirençli mantar enfeksiyonlarına karşı umut verici bir strateji sunmaktadır. Bu çalışma, gül bengal aracılı aPDT'nin Candida glabrata'yı etkili bir şekilde deaktive ettiğini ve küçük kolonileri indükleyerek benzersiz bir prosedür sunduğunu göstermektedir.

Facing a 40% mortality rate in candidemia patients, drug-resistant Candida and their petite mutants remain a major treatment challenge. Antimicrobial ...

Araştırma, ilaca dirençli Candida enfeksiyonuna karşı savaşmak için PDT olarak da bilinen fotodinamik tedaviyi kullanmayı amaçlıyor. Bu çalışmada, PDT'nin mantarları ne kadar etkili bir şekilde öldürdüğünü ve tedaviden sonra mantarların virülansının nasıl değiştiğini cevaplamaya çalışıyoruz. PDT'den sonra minyon koloniler bulduk.Minyon kolonileri indüklemek için mevcut yöntemler, PDT'ye kıyasla ilaç direnci ve stres tepkileri üzerinde farklı yollardan çalışabilen etidyum bromür veya flukonazole dayanır. Son zamanlarda, Candida'nın minyon kolonileri klinikte önemli bir endişe haline gelmiştir, çünkü ilaca direnebilir ve ölüm oranlarını artırabilirler. Fotodinamik terapi, antifungal tedavilerden biri haline geldi ve bulgularımız, minyon kolonileri incelemek için kullanılan geleneksel yöntemler arasındaki boşluğu aşmaya yardımcı oluyor.Bulgularımız, PDT'nin ilaca dirençli Candida'da in vitro olarak minyon kolonileri indükleyebileceğine dair kanıtlar sunmakta ve minyon kolonileri incelemek için çığır açan bir yöntem sunmaktadır. Kesinlikle bu alanı daha derinlemesine inceleyeceğiz. Cevaplanması gereken birçok soru var.PDT stresinden sonra minyon koloniler nasıl ve neden oluşur? Farklı Candida türleri farklı tepki verir mi? Keşfedilmesi gereken hiç bitmeyen bir hikaye olduğuna inanıyorum.

induction-petite-colonies-candida-glabrate-via-rose-bengal-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Induction of Petite Colonies in Candida glabrate via Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy

477 Görüntüleme.  National Cheng Kung University. Araştırma, ilaca dirençli Candida enfeksiyonuna karşı savaşmak için PDT olarak da bilinen fotodinamik tedaviyi kullanmayı amaçlıyor. Bu çalışmada, PDT'nin mantarları ne kadar etkili bir şekilde öldürdüğünü ve tedaviden sonra mantarların virülansının nasıl değiştiğini cevaplamaya çalışıyoruz. PDT'den sonra minyon koloniler bulduk.Minyon kolonileri indüklemek için mevcut yöntemler, PDT'ye kıyasla ilaç direnci ve stres tepkileri üzerinde farklı yoll...

Video: Yazar Spotlight: Antifungal Araştırmalar için İlaca Dirençli Candida'da Minyon Kolonileri İndüklemek İçin Yeni Bir Yaklaşım Olarak Fotodinamik Terapi