Bu çalışma, çeşitli mikroorganizmalar ve hücreler üzerindeki farklı fotodinamik etkileri incelemek için basit, çok yönlü ve kolay bir sistemdir. Bu sistemde, LED deney tasarımına bağlı olarak farklı düzenlemelere sığdırılabilir. PDT'nin farklı koşulları, bir deneyde 96 delikli bir plakada veya hatta 384 delikli bir plakada hesaplanabilir.
Bu teknik, mantar keratitini tedavi etmek için kullanılabilir, çünkü küresel olarak, yoğun tedavilere rağmen yaklaşık 150.000 kişi gözlerini kaybeder. Başlamak için, bir LED şeridinden dört yeşil LED'i kesin ve bunları 96 delikli bir plakanın üç kuyucuğuyla hizalayın. LED'in akıcılık hızını bir ışık gücü ölçerle 540 nanometrede ölçün.
Işınlama sırasında plakanın yanına monte edilen bir elektrikli fan ile sabit sıcaklığı 25 santigrat derecede koruyun. Steril bir döngü ile, bir agar plakasından tek bir Candida albicans kolonisi seçin ve üç mililitre YPD ortamı içeren sterilize edilmiş bir cam tüpe ekleyin. Maya kültürünü büyütmek için tüpü 14 ila 16 saat boyunca 155 RPM dönme hızında 25 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra geceleme kültürünü YPD ortamı ile 0,5 OD 600 değerine kadar seyreltin. Log büyüme aşamasına ulaşmak için dört saat boyunca 155 RPM'de rotasyonla 30 santigrat derecede inkübe edin. Log fazı kültürünün seyreltilmesini taze YPD ortamıyla 0,65 OD 600 değerine kadar tekrarlayın, böylece mililitre başına yedinci koloni oluşturan birimlere yaklaşık bir kez 10 kat elde edin.
Aynı zamanda, 1X PBS'de% 4'lük bir gül bengal stok çözeltisi hazırlayın. Filtre 0.22 mikrometre filtre ile sterilize edin. Bir mililitre log fazı kültürüne 111 mikrolitre% 2 gül bengal çözeltisi ekleyin ve hücrelerdeki RB emilimini anlamak için oda sıcaklığında farklı zaman noktalarında ortak kültür ekleyin.
Oda sıcaklığında 2 1/2 dakika boyunca 16, 100 kez G'de santrifüj yapın ve ko-kültürü bir mililitre 1X PBS ile üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, Candida albicans kültürünü bir mililitre 1X PBS'de yeniden askıya alın. Her koşul için, kültürü 96 kuyucuklu bir plakada üç farklı kuyuya dağıtın.
Kuyucukları LED dizisiyle hizalayın. Işığa maruz kalan gruplarda, elektrikli fanı ve ışığı açın. Işınlamadan sonra, bir kuyucuktan 20 mikrolitre ko-kültür çözeltisi alarak ve 180 mikrolitre 1X PBS içeren bir tüpe ekleyerek iki kez on kat seri seyreltme gerçekleştirin.
Daha sonra, plaka üzerinde sayılabilir koloniler elde etmek için her seri seyreltmenin 20 mikrolitresini bir YPD agar plakasının bir çeyreğine bırakın. Floresan mikroskopi, Candida albicans'ın kırmızı floresan altında gül bengal ile anında boyandığını gösterdi. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, hücrelerin çoğu gül bengal ile boyandı, bu da hücrelere zamana bağlı bir şekilde girdiğini gösteriyordu.
Ayrıca, gül bengalinin ışıkla aktivasyonu, hücrelerde serbest radikaller ve singlet oksijen üreterek hücre ölümüyle sonuçlanır. Gül bengal veya ışınlama yokluğunda, hücre ölümü gözlenmedi. Candida albicans, yeşil ışık ışınlamasından sonra, hafif doza bağımlı bir şekilde% 0.2 gül bengal varlığında inhibe edildi.
Öncelikle 96 delikli plakanın LED'in merkezi ile hizalanması önemlidir. İkincisi, ayrı kolonilerin karışmasını önlemek için kullanılan agar plakası iyice kurutulmalıdır. Plaka üzerinde yetişen Candida albicans, PDT'nin hücrelerin gen ekspresyonunu nasıl etkilediğini cevaplayabilen gen analizi için daha fazla gönderilebilir.
Bu teknikler, PDT'nin kanser hücreleri, bakteriler, mantarlar veya virüsler gibi farklı hücre tipleri üzerinde kolay, ucuz ve çok yönlü bir platformla nasıl çalıştığını incelemenin yolunu açar.
