Este trabalho recebeu financiamento do Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], Universidade Nacional de Cheng Kung [K111-B094], [K111-B095], Hospital Universitário Nacional de Cheng Kung, Taiwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].

1. Cultura de C. glabrata
NOTA: Um C. glabrata multirresistente (C2-1000907) que é resistente à maioria dos agentes antifúngicos, incluindo fluconazol, é usado para os experimentos. As condições experimentais podem precisar ser adaptadas à cepa específica, pois podem existir variações entre diferentes cepas. Todos os experimentos usaram Candida em fase logarítmica cultivada a 25 ° C (imitando a infecção natural) para consistência. A falta de hifas de C. glabrata simplifica a quantificação em comparação com C. albicans, que forma hifas a 37 °C10.
<ol><li>Para preparar uma cultura em fase logarítmica de C. glabrata, pegue uma única colônia de uma placa de ágar e transfira-a para um tubo de ensaio de vidro com 3 mL de meio estéril de peptona dextrose de levedura (YPD) (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 14-16 h a 25 °C com agitação (155 rpm, ângulo de 45° para aumentar a transmissão de ar para o meio).</li>
	<li>Após a incubação, diluir a cultura com YPD fresco até um OD600 de 0,1 usando a técnica estéril. Incubar a 25 °C durante 6 h com agitação a 155 rpm. Verificar a fase logarítmica de C. glabrata medindo o OD600. Apontar para 0,65-1,00, o que corresponde a 1 × 10 7-1,5 × 107 células/mL.</li>
</ol>2. Indução de pequenas colônias por brometo de etídio, fluconazol e terapia fotodinâmica
<ol><li>Indução de colônias pequenas de brometo de etídio<ol><li>Ajuste uma suspensão de levedura para uma DO600 de 0,1 (5 × 106 células/mL) com YPD para um volume final de 3 mL e, em seguida, adicione 30 μL de estoque de brometo de etídio (10 mg/mL) (ver Tabela de Materiais) para uma concentração final de 100 μg/mL.</li>
		<li>Incubar a suspensão de levedura durante a noite (16-18 h) a 25 °C, 155 rpm, ângulo de 45°. Ajuste para um OD600 de 0,65 (1 × 107 células/mL). Realize uma série de diluição de 10 vezes em uma placa de 96 poços, adicionando 20 μL da suspensão de levedura ajustada a 180 μL de PBS por poço. Isso cria seis diluições que variam de 10-1 a 10-5.</li>
		<li>Selecione 4 fatores de diluição (por exemplo, 100, 101, 102 e 103) e 3 gotas de 3 (20 μL) cada um em 4 quadrantes de placas de ágar YPD (triplicado).</li>
		<li>Incubar as placas durante a noite a 37 °C. Selecione quadrantes com 5-80 colônias das diluições escolhidas anteriormente para a coloração de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC)11 (consulte a etapa 3). Digitalize as chapas a 1200 dpi usando um scanner óptico colorido de 48 bits.</li>
	</ol></li>
	<li>Indução de colônias pequenas de fluconazol NOTA: Para agilizar o processo, use células T3 (uma mistura de células normais e pequenas obtidas após 3 tratamentos RB-PDT; consulte a etapa 2.3) para a formação de colônias pequenas induzidas por fluconazol. Isso ocorre porque o tratamento padrão geralmente resulta em uma formação mais lenta.<ol><li>Prepare e ajuste uma suspensão de células de levedura conforme descrito na etapa 2.1.1.</li>
		<li>Incubar durante a noite (16-18 h) a 25 °C. Ajuste o OD600 para 0.1 novamente.</li>
		<li>Transfira 1 mL da suspensão ajustada para um tubo estéril de 5 mL.</li>
		<li>Mergulhe um cotonete estéril (15 cm de comprimento, com ponta de 0,9 cm x 2,6 cm, consulte a Tabela de Materiais) na suspensão de levedura, garantindo o contato com o fundo do tubo e torcendo para remover o excesso de líquido da parede do tubo.</li>
		<li>Prepare as placas no exaustor usando ágar Mueller-Hinton (consulte a Tabela de Materiais).</li>
		<li>Passe o algodão para frente e para trás no ágar, gire 60° duas vezes e, em seguida, limpe o perímetro para uma cobertura uniforme.</li>
		<li>Esterilize as pinças sobre uma chama por 1-2 s, deixando-as esfriar brevemente, depois use-as para pegar os discos vazios.</li>
		<li>Divida a placa em três setores iguais usando um marcador. Coloque um disco vazio no centro de cada setor.</li>
		<li>Adicione 12,5 μL de estoque de fluconazol (2 mg / mL, consulte a Tabela de Materiais) a cada disco (25 μg / disco), misture bem para evitar bolhas e incube a 37 ° C por 20-24 h.</li>
		<li>Execute a coloração TTC (consulte a etapa 3). Digitalize as chapas a 1200 dpi usando um scanner óptico colorido de 48 bits.</li>
	</ol></li>
	<li>Indução de colônias pequenas PDT NOTA: Diferentes fungos podem produzir diferentes números de colônias pequenas após a PDT. Algumas cepas podem não produzir nenhum.<ol><li>Prepare o sistema aPDT. NOTA: O procedimento de configuração para o dispositivo do sistema aPDT segue o método relatado por Hung et al12. Resumidamente, o sistema aPDT consiste em uma matriz de LED verde com um pico de 520 nm (consulte a Tabela de Materiais), brilhando luz do fundo com bom alinhamento com cada poço de uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Ajuste a suspensão de células de levedura no meio YPD para um OD600 de 0,65 (cerca de 1 × 107 células / mL).</li>
		<li>Misture 1 mL da suspensão de levedura com 111 μL de rosa bengala a 2% (RB, Figura 1) (ver Tabela de Materiais) em um tubo com tampa redonda para obter uma concentração final de RB de 0,2%. Incubar a mistura a 25 °C durante 15 min, rodando-a num ângulo de 45° a 155 rpm.</li>
		<li>Transfira a mistura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 16.100 x g por 2,5 min (à temperatura ambiente).</li>
		<li>Descarte o sobrenadante e raspe suavemente o tubo cinco vezes no chão do capô para ressuspender o pellet.</li>
		<li>Lave a suspensão com 1x PBS quatro vezes para remover todo o RB. Cada lavagem é seguida pela ressuspensão do pellet com breve vórtice ou pipetagem para ressuspensão completa.<ol><li>Após a lavagem final, adicione 1000 μL de PBS. A solução é de cor rosa claro. Transfira 200 μL da suspensão de levedura carregada com RB lavada para cada um dos três poços em uma placa de 96 poços (triplicata).</li>
		</ol></li>
		<li>Posicione a placa de 96 poços no sistema de luz fotodinâmica com lâmpadas LED brilhando luz verde por baixo. Apague as luzes da sala para garantir uma iluminação uniforme e evitar interferências. Ative o sistema de luz LED para fornecer a dose PDT de 4,38 J/cm2 em 2 min; Certifique-se de que o sistema esteja devidamente alinhado com os poços.</li>
		<li>Após a irradiação, diluir a suspensão de levedura em uma placa de 96 poços. Adicione 20 μL de suspensão de levedura a um poço contendo 180 μL de PBS, criando uma diluição de 10 vezes. Repita para as diluições restantes para atingir um intervalo de 10-1 a 10-5.</li>
		<li>Escolha quatro fatores de diluição (por exemplo, 10-2 a 10-5) com base no ajuste da concentração de células de levedura.</li>
		<li>Para cada factor de diluição, aplicar 3 gotas (20 μl cada) por quadrante em placas de ágar YPD.</li>
		<li>Após a suspensão da levedura ser completamente absorvida, cerca de 10 min pelas placas de ágar, inverter e incubar durante a noite a 37 °C.</li>
		<li>Defina T0 como o parente controle de C. glabrata sem tratamento com PDT. Prepare fungos T0 na fase de crescimento logarítmica conforme descrito acima e exponha-os a 4,38 J / cm2 luz verde na presença de 0,2% RB. Esta condição de PDT inibe consistentemente 3 a 3,5 logs de crescimento de fungos.<ol><li>Denote os fungos sobreviventes como T1 e exponha-os à mesma dose de PDT novamente depois de serem expandidos in vitro para uma fase de crescimento logarítmico. Os fungos sobreviventes após a segunda PDT são denotados como T2 e assim por diante.</li>
		</ol></li>
		<li>No dia seguinte, escolha quadrantes com contagem de colônias entre 5 e 80. Contar o número de colónias em cada quadrante e calcular o título com a seguinte fórmula: Unidade formadora de colónias (UFC)/ml = Número de colónias (média do triplicado) × Factor de diluição × 50.</li>
		<li>Execute a coloração TTC (consulte a etapa 3). Digitalize a placa conforme descrito anteriormente (etapa 2.2).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análise da função mitocondrial (teste de coloração TCC)
NOTA: TTC é um indicador redox e um aceptor de elétrons. Fica vermelho quando os compostos brancos são quebrados por elétrons11. Observe que nem todas as células necessariamente formam colônias visíveis dentro de 24 horas após a cultura em uma placa de ágar. As colônias com mitocôndrias funcionais ficam vermelhas, enquanto aquelas com mitocôndrias não funcionais permanecem brancas. Isso permite a diferenciação entre colônias com diferentes funcionalidades mitocondriais.
<ol><li>Após o tratamento, diluir as suspensões de Candida em placas de ágar YPD de acordo com a densidade celular desejada para obter colônias distintas para fácil visualização e coloração.</li>
	<li>Após 24 h de crescimento a 37 °C, as colônias visíveis são formadas a partir de uma única célula. Pipete 20 μL de TTC a 20% diretamente no centro de cada colônia.</li>
	<li>Após a absorção completa, cerca de 10 min de TTC pelas colônias, incubar a 37 °C por 30-40 min.</li>
</ol>4. Cinética de crescimento de C. glabrata normal e pequena
NOTA: Três cepas de levedura foram comparadas: C. glabrata C2-1000907 T0 (isolado clínico sem tratamento com PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 após 3 colônias RB-PDT consecutivas exibindo um diâmetro médio de 1,5 ± 0,8 mm semelhante às células parentais) e T3p (colônias pequenas de C. glabrata C2-1000907 após 3 RB-PDT consecutivas).
<ol><li>Ajuste a suspensão de células de levedura em meio YPD para um OD600 de 0,1 (5 × 106 células / mL) em um tubo de 3 mL.</li>
	<li>Meça automaticamente o OD600 da cultura estática a cada 20 minutos usando o leitor de microplacas multimodo (consulte a Tabela de Materiais) por 24 h.</li>
</ol>

Analisando a formação de colônias pequenas e a resistência a drogas em Candida glabrata

<ol>
	<li>Soriano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+candidiasis:+current+clinical+challenges+and+unmet+needs+in+adult+populations.">Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations.</a> J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).</li><li>Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+candidiasis.">Invasive candidiasis.</a> Nat Rev Dis Primers. 4, 18026 (2018).</li><li>Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiologic+features,+clinical+characteristics,+and+predictors+of+mortality+in+patients+with+candidemia+in+Alameda+County,+California;+a+2017-2020+retrospective+analysis.">Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis.</a> BMC Infect Dis. 22 (1), 843 (2022).</li><li>Whittaker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+petite+mutation+in+yeast.">The petite mutation in yeast.</a> Subcell Biochem. 6, 175-232 (1979).</li><li>Hatab, M. A., Whittaker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+respiration-deficient+mutants+from+the+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).</li><li>Defontaine, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+resistance+to+azoles+associated+with+mitochondrial+DNA+deficiency+in+Candida+glabrata.">In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata.</a> J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).</li><li>Brun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+respiration+and+susceptibility+to+azole+antifungals+in+Candida+glabrata.">Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).</li><li>Bouchara, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+selection+of+an+azole-resistant+petite+mutant+of+Candida+glabrata.">In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata.</a> J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).</li><li>Badrane, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+diversity+and+unrecognized+antifungal+resistance+among+populations+of+Candida+glabrata+from+positive+blood+cultures.">Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures.</a> Nat Commun. 14 (1), 5918 (2023).</li><li>Shantal, C. -. J. N., Juan, C. -. C., Lizbeth, B. -. U. S., Carlos, H. -. G. J., Estela, G. -. P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+is+a+successful+pathogen:+An+artist+manipulating+the+immune+response.">Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response.</a> Microbiol Res. 260, 127038 (2022).</li><li>Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+dubliniensis+and+Candida+albicans+differentiation+by+colony+morphotype+in+Sabouraud-triphenyltetrazolium+agar.">Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar.</a> Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).</li><li>Hung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rose+bengal-mediated+photodynamic+therapy+to+inhibit+Candida+albicans.">Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans.</a> J Vis Exp. (181), e63558 (2022).</li><li>Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivity+of+bovine+whey+proteins,+peptides,+and+amino+acids+toward+triplet+riboflavin+as+studied+by+laser+flash+photolysis.">Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis.</a> J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).</li><li>Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+petite+induction+and+the+recovery+of+respiratory+competence+in+yeast+cells+exposed+to+ethidium+bromide.">Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide.</a> Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).</li><li>Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+petite+mutation+in+yeasts:+50+years+on.">The petite mutation in yeasts: 50 years on.</a> Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).</li><li>Piskur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+the+yeast+mitochondrial+genome.">Inheritance of the yeast mitochondrial genome.</a> Plasmid. 31 (3), 229-241 (1994).</li><li>Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+effects+of+toluidine+blue-mediated+photodynamic+action+on+Vibrio+vulnificus.">Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).</li><li>Wong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indocyanine+green-mediated+photodynamic+therapy+reduces+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+drug+resistance.">Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance.</a> J Clin Med. 8 (3), 411 (2019).</li><li>Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+to+control+microbial+biofilms.">Photodynamic therapy to control microbial biofilms.</a> Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090 (2021).</li><li>Hung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+photodynamic+therapy+against+fungal+keratitis.">Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis.</a> Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Este estudo revela a PDT como o primeiro método relatado para induzir a formação de pequenas colônias em Candida, superando os efeitos estabelecidos do brometo de etídio e do fluconazol. Esta nova observação requer uma exploração mais aprofundada para desvendar suas implicações tanto para a erradicação de fungos, diminuindo a virulência quanto para o surgimento de mecanismos de resistência.
A PDT mediada por RB inibe efetivamente o crescimento de C. glabrata, sugerindo ...

As infecções fúngicas, particularmente aquelas causadas por Candida albicans e Candida glabrata, cada vez mais resistentes, representam uma séria ameaça global1. Essas infecções podem ser mortais, especialmente para pacientes hospitalizados e aqueles com sistema imunológico enfraquecido. O aumento da resistência antifúngica ameaça o controle da candidíase invasiva, uma infecção fúngica grave com alta mortalidade, especialmente por Candida albicans2. Cepas resistentes dificultam o tratamento eficaz, aumentando potencialmente a complexidade e as taxas de mortalidade. No condado de Alameda, Califórnia, EUA, C. glabrata tornou-se a espécie invasora mais prevalente3. Essa mudança na prevalência e distribuição de espécies de Candida pode ser influenciada por práticas locais de saúde, dados demográficos do paciente, utilização de agentes antifúngicos e prevalência de fatores de risco para infecções por Candida.
Pequenos mutantes em Candida, sem mitocôndrias funcionais, revelam como essa organela afeta a resposta a medicamentos, virulência e resistência ao estresse 4,5. C. glabrata forma prontamente essas colônias, ganhando sensibilidade aos polienos e perdendo-a aos azóis6. A sensibilidade aos azóis e a função respiratória estão intrinsecamente ligadas, com a diminuição da respiração levando à resistência por meio da perda de DNA mitocondrial7. Pequenas colônias de C. glabrata com resistência aos azóis foram isoladas de amostras de fezes humanas de um receptor de transplante de medula óssea em tratamento com fluconazol8 e de frascos de hemocultura de pacientes com infecções da corrente sanguínea9. Suas implicações potenciais na resistência a medicamentos, virulência e resposta ao estresse destacam seu significado clínico. Além disso, suas propriedades distintas os tornam ferramentas valiosas para investigar questões fundamentais na biologia mitocondrial5. À medida que a pesquisa sobre pequenos mutantes continua, suas aplicações em pesquisas clínicas e básicas provavelmente se expandirão.
Este estudo descobriu que a terapia fotodinâmica (PDT) pode induzir pequenas colônias em C. glabrata, expandindo a gama de métodos além das técnicas tradicionais de exposição de C. glabrata ao brometo de etídio ou fluconazol.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Merck, Taipei, Taiwan</td>
			<td>Millex, SLGVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tube</td>
			<td>Neptune, San Diego, USA</td>
			<td>#3745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>T8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene round bottom tube</td>
			<td>Corning, AZ, USA</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning, AZ, USA</td>
			<td>Falcon, #352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan</td>
			<td>#16196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BRS, Tainan, Taiwan</td>
			<td>AG012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blank disk</td>
			<td>Advantec, Tokyo, Japan</td>
			<td>49005040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, UK</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluconazole, 2 mg/mL</td>
			<td>Pfizer, NY, USA</td>
			<td>BC18790248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green light emitting diode (LED) strip</td>
			<td>Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan</td>
			<td>5050</td>
			<td>Excitation wave: 500~550 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature. shake Incubators</td>
			<td>Yihder, Taipei, Taiwan</td>
			<td>LM-570D (R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth care cotton swabs</td>
			<td>Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan</td>
			<td>161357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller Hinton II agar</td>
			<td>BD biosciences, California, USA</td>
			<td>211438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OD600 spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom, London, UK</td>
			<td>Ultrospec 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>330000</td>
			<td>stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized glass tube</td>
			<td>Sunmei, Tainan, Taiwan</td>
			<td>AK45048-16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose Medium</td>
			<td>HIMEDIA, India</td>
			<td>M1363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of petite colonies in candida glabrate via rose bengal-mediated photodynamic therapy

Enfrentando uma taxa de mortalidade de 40% em pacientes com candidemia, a Candida resistente a medicamentos e seus pequenos mutantes continuam sendo um grande desafio de tratamento. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) tem como alvo várias estruturas fúngicas, ao contrário dos antibióticos/antifúngicos, potencialmente frustrando a resistência. Os métodos tradicionais para induzir colônias pequenas dependem de brometo de etídio ou fluconazol, que podem influenciar a suscetibilidade aos medicamentos e as respostas ao estresse. Este estudo investigou a aplicação de luz verde (pico de 520 nm) e fotossensibilizador de rosa bengala (RB) no combate a um isolado de Candida glabrata resistente a medicamentos. Os resultados revelaram que o tratamento com aPDT inibiu significativamente o crescimento celular (redução de ≥99,9%) e induziu efetivamente a formação de colônias pequenas, como evidenciado pela redução do tamanho e perda da coloração do indicador redox mitocondrial. Este estudo fornece evidências iniciais de que o aPDT pode induzir pequenas colônias em uma cepa de C. glabrata multirresistente in vitro, oferecendo uma abordagem potencialmente transformadora para combater infecções fúngicas resistentes.

Fungal infections, particularly those caused by Candida albicans and increasingly drug-resistant Candida glabrata, pose a serious global threat1. These infections can be deadly, especially for hospitalized patients and those with weakened immune systems. Rising antifungal resistance threatens the control of invasive candidiasis, a severe fungal infection with high mortality, especially from Candida albicans2. Resistant strains hinder effective treatment, potentially increasing both complexity and death rates. In Alameda County, California, USA, C. glabrata has become the most prevalent invasive species3. This shift in the prevalence and distribution of Candida species may be influenced by local healthcare practices, patient demographics, the utilization of antifungal agents, and the prevalence of risk factors for Candida infections.
Petite mutants in Candida, lacking functional mitochondria, reveal how this organelle affects drug response, virulence, and stress resistance4,5. C. glabrata readily forms these colonies, gaining sensitivity to polyenes while losing it to azoles6. Azole sensitivity and respiratory function are intricately linked, with diminished respiration leading to resistance via mitochondrial DNA loss7. Petite colonies of C. glabrata with azole resistance have been isolated from human stool samples from a bone marrow transplant recipient undergoing fluconazole treatment8 and from blood culture bottles of patients with bloodstream infections9. Their potential implications in drug resistance, virulence, and stress response highlight their clinical significance. Additionally, their distinct properties make them valuable tools for investigating fundamental questions in mitochondrial biology5. As research into petite mutants continues, their applications in both clinical and basic research are likely to expand.
This study discovered that photodynamic therapy (PDT) can induce petite colonies in C. glabrata, expanding the range of methods beyond the traditional techniques of exposing C. glabrata to ethidium bromide or fluconazole.

Autor em destaque: Terapia fotodinâmica como uma nova abordagem para induzir pequenas colônias em candida resistente a medicamentos para pesquisa antifúngica

Indução de pequenas colônias em Candida glabrate via terapia fotodinâmica mediada por Rose Bengal

The research aims to use photodynamic therapy, also known as PDT, to fight against drug-resistant Candida infection. In this study, we are trying to answer how effectively PDT kills the fungi, and how the virulence of the fungi changes after the treatment. We found petite colonies from the after PDT.Present methods for inducing petite colonies rely on ethidium bromide or fluconazole, which may work through different pathways on drug resistance and the stress responses, compared to PDT. Recently, petite colonies of Candida have become a significant concern in the clinic because they may resist medication and increase mortality rates. Photodynamic therapy has become one of the antifungal treatments and our finding helps breach the gap between traditional methods used to study petite colonies.Our findings provide evidence that PDT can induce petite colonies in drug resistant Candida in-vitro, presenting a groundbreaking method to study petite colonies. We'll definitely delve deeper into this field. There are many questions to be answered.How and why do petite colonies form after PDT stress? Do different Candida species respond differently? I believe it's a never ending story to be explored.

Os dados são apresentados como a média com ± erro padrão e foram obtidos a partir de três experimentos independentes, com pelo menos triplicatas em cada grupo. Os dados experimentais, incluindo contagens de colônias, medições de OD600 e resultados de coloração TTC, foram representados graficamente e analisados estatisticamente usando gráficos e software estatístico (ver Tabela de Materiais). A análise dos dados foi realizada por ANOVA ou teste t de uma via, sendo consider...

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O significado de pequenas colônias em Candida spp. resistência a medicamentos não foi totalmente explorado. A terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT) oferece uma estratégia promissora contra infecções fúngicas resistentes a medicamentos. Este estudo demonstra que a aPDT mediada por rosa bengala desativa efetivamente Candida glabrata e induz pequenas colônias, apresentando um procedimento único.

Facing a 40% mortality rate in candidemia patients, drug-resistant Candida and their petite mutants remain a major treatment challenge. Antimicrobial ...

A pesquisa visa usar a terapia fotodinâmica, também conhecida como PDT, para combater a infecção por Candida resistente a medicamentos. Neste estudo, estamos tentando responder com que eficácia a PDT mata os fungos e como a virulência dos fungos muda após o tratamento. Encontramos pequenas colônias do pós-PDT.Os métodos atuais para induzir colônias pequenas dependem de brometo de etídio ou fluconazol, que podem funcionar por diferentes vias na resistência aos medicamentos e nas respostas ao estresse, em comparação com a PDT. Recentemente, pequenas colônias de Candida tornaram-se uma preocupação significativa na clínica porque podem resistir à medicação e aumentar as taxas de mortalidade. A terapia fotodinâmica tornou-se um dos tratamentos antifúngicos e nossa descoberta ajuda a romper a lacuna entre os métodos tradicionais usados para estudar colônias pequenas.Nossos achados fornecem evidências de que a PDT pode induzir pequenas colônias em Candida in-vitro resistente a medicamentos, apresentando um método inovador para estudar pequenas colônias. Com certeza vamos nos aprofundar nesse campo. Há muitas perguntas a serem respondidas.Como e por que as pequenas colônias se formam após o estresse da PDT? Diferentes espécies de Candida respondem de maneira diferente? Acredito que é uma história sem fim a ser explorada.

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Induction of Petite Colonies in Candida glabrate via Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy

477 visualizações.  National Cheng Kung University. A pesquisa visa usar a terapia fotodinâmica, também conhecida como PDT, para combater a infecção por Candida resistente a medicamentos. Neste estudo, estamos tentando responder com que eficácia a PDT mata os fungos e como a virulência dos fungos muda após o tratamento. Encontramos pequenas colônias do pós-PDT.Os métodos atuais para induzir colônias pequenas dependem de brometo de etídio ou fluconazol, que podem funcionar por diferentes vias na resistência aos medicamentos ...

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