Patlamanın neden olduğu şok dalgalarına maruz kalmanın neden olduğu hafif travmatik beyin hasarının altında yatan karmaşık mekanizmaları anlamaya çalışıyoruz. Ayrıca bu semptomları hafifletmek için yöntemler de araştırıyoruz. Düşük yoğunluklu patlama kaynaklı şok dalgaları nedeniyle kan-beyin bariyeri bozulmasının ilk aşamasının kapsamlı bir açıklaması olmuştur.
Spesifik olarak, bozulma maruziyetten yaklaşık üç saat sonra aniden başlar ve etkilenen lezyonlar başlangıcı takip eden yaklaşık bir gün boyunca yeniden şekillenir. Bu yöntem, BBB'nin bozulmasını daha ayrıntılı olarak incelememize olanak tanır ve bir patlama durumunda kullanılabilecek çeşitli tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için ek bir ölçüm sağlar. Başlamak için, hayvanı patlamanın neden olduğu şok dalgalarına maruz bırakmak için bir şok tüpü hazırlayın.
Anestezi uygulanmış fareyi şok tüpünün çıkış ucundan beş santimetre uzağa yerleştirin ve vücut ekseninin tüpün eksenine paralel olduğundan, ancak tüpün ekseniyle hizalanmadığından emin olun. Ardından, hayvanın kafasına 25 kilopaskallık bir tepe aşırı basıncına sahip tek bir patlama şok dalgası verin. Evans mavisi enjeksiyonu için, tuzlu suda hacimce ağırlıkça %4'lük bir Evans mavisi çözeltisi hazırlayın.
Çözeltiyi girdaplayın ve kullanana kadar karanlıkta saklayın. Evans mavi çözeltisini gram başına 2,5 mikrolitrelik bir dozajda kuyruk damarına enjekte edin. Anestezi uygulanmış fareyi FITC-dekstran boya ve paraformaldehit ile perfüze ettikten sonra, beyni dikkatlice çıkarmak için cerrahi makas ve cımbız kullanın.
Beyni gece boyunca aynı fiksatifte dört santigrat derecede düzeltin. Ertesi gün, sabitleyiciyi PBS ile değiştirin. Başlamak için, Evans mavisi ve FITC-dekstran boyaları enjekte edilen patlama şok dalgası ile muamele edilmiş bir fareden sabit beyni elde edin.
Her oyukta pH 7.4'e ayarlanmış fosfat tamponunda 500 mikrolitre %20 gliserol içeren 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. Bir beyin dilimleyici kullanarak, beyni koronal olarak her biri milimetre kalınlığında 12 dilim halinde kesin. Her dilimi 24 oyuklu plakanın karşılık gelen kuyucuğuna aktarın ve plakayı en az iki saat boyunca dört santigrat derecede saklayın.
Daha sonra çözeltiyi% 50 gliserol fosfat tamponu ile değiştirin ve en az iki saat boyunca dört santigrat derecede tekrar saklayın. Son olarak, çözeltiyi% 100gliserol ile değiştirin. Anında mikroskobik gözlem için, dilimlerin oda sıcaklığında en az iki saat bekletilmesine izin verin.
35 milimetrelik cam tabanlı bir tabağın dibine 500 mikrolitre gliserol ekleyin. Beyin dilimini gliserol çözeltisine aktarın ve yüzeyi bir kapak camı ile örtün. Kapak camının kenarındaki fazla gliserol'ü çıkarın.
Floresan mikroskobu altında dilimin floresan yoğunluğunu ölçün. Mikroskobik ölçümden sonra dilimi plakanın kuyusuna geri koyun. Her kuyucuğa 500 mikrolitre fosfat tamponu ekleyin ve 24 oyuklu plakayı gece boyunca dört santigrat derecede saklayın.
Çözeltiyi% 30 gliserol fosfat tamponu ile değiştirin ve immünohistokimya yapmadan önce plakayı en az iki saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin Evans mavi etiketlemesi, kan-beyin bariyerinin veya BBB bozulmasının patlama şok dalgasına maruz kaldıktan sonraki altı saat içinde başladığını ve yedi güne kadar sürdüğünü gösterdi. Floresan sıcak noktaları boyut ve yoğunluk bakımından farklılık gösterdi, Evans mavisi sıcak noktaları, Evans mavisi enjeksiyonu sırasında BBB bozulmasını ve FITC-dekstran enjeksiyonundan sonra onarımı gösterdi. Reaktif astrosit kümeleri, immünohistokimya ile doğrulanan BBB parçalanma bölgeleri ile yakından ilişkiliydi.
Patlama şok dalgasına maruz kaldıktan üç gün sonra reaktif astrositlerin yanı sıra aktive edilmiş mikroglia ve ameboid mikroglia gözlendi.
