Bu çalışma, ameliyatlara yardımcı olma konusunda destek sağlayan Stephanie Tam'ın paha biçilmez katkılarıyla mümkün olmuştur. Kendisine yardımları için en içten şükranlarımızı sunarız. Bu araştırmayı desteklemek için Ulusal Sağlık Enstitüleri (AG066162).

Bu çalışma için insan amiloid plağını fizyolojik düzeyde eksprese eden AppNL-Ffareleri (3 aylık) kullanıldı, ancak bu sistem herhangi bir kemirgen modelinde kullanılabilir. Tüm hayvan prosedürleri, CAMH Hayvan Bakım Komitesi (Protokol # 843) tarafından onaylandı ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi yönergelerinin etik standartlarına uygun oldu. Fareler şirket içinde yetiştirildi ve yem ve suya ad libitum erişimi ile 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsünde tutuldu.
1. Cisterna magna (CM) enjeksiyonu prosedürü
<ol><li>Cerrahi prosedür<ol><li>Fareyi (APPNL-F, her iki cinsiyet, 3 ay) 1 dakika boyunca bir anestezi indüksiyon odasına yerleştirin. NOT: Hazneyi en az 1 dakika boyunca% 1 oksijen ile karıştırılmış% 5 izofluran ile yıkayın.</li>
		<li>Fare uyuşturulduktan sonra, hayvanı odadan çıkarın ve yeni bir cerrahi örtü üzerine yerleştirin ve burnun üzerine bir burun konisi yerleştirerek anesteziyi koruyun (izofluran,% 2.5 -% 3). NOT: Refleks olmadığından emin olmak için ayak parmağınızı sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin.</li>
		<li>Kuruluğu önlemek için oftalmik merhem sürün. Daha sonra, deri altından 0.1 mL bupivakain (lokal anestezik; 1-2 mg / kg% 0.125, 1: 2 seyreltme oranı ile) insizyon bölgesine ve Metacam'a (analjezik; 5 mg / kg, 1:10 seyreltme oranı ile) enjekte edin. Ameliyat sırasında olası kan kaybını telafi etmek için prosedürü yapmadan önce deri altına 0,5 mL salin enjekte ederek hayvanı nemli tutun.</li>
		<li>Net bir insizyon bölgesi için, oksipital kemiğin tabanındaki boynu tıraş edin, yüzeyi steril PBS ile silin ve konuyu yüzüstü pozisyonda stereotaksik çerçeveye aktarın. NOT: Anestezinin stereotaksik burun konisinden sağlandığından emin olun.</li>
		<li>Stabilite sağlamak ve üst dişlerin sabitlendiğinden emin olmak için burun çubuğunu stereotaksik çerçeveden farenin üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Cerrahi ilgi alanını ortaya çıkarmak için enseyi yükseltmek ve şişirmek için hayvan kafasını vücuttan 120°'lik bir açıyla konumlandırın.</li>
		<li>Cerrahi bölgeyi Betadine ovma 3x,% 70 etanol 3x ve betadin solüsyonu 1x steril 2 inç x 2 inç gazlı bez ile temizleyin.</li>
		<li>Cildi cımbız yardımıyla nazikçe katlayın ve cerrahi makas kullanarak küçük bir kesi (1 cm) yapın. NOT: Bu, ense orta hattını ortaya çıkarmalıdır.</li>
		<li>Kasları kesmek için neşteri orta hat boyunca dikkatlice çalıştırın. Daha sonra cımbız kullanarak kasları sola ve sağa çekerek nazikçe ayırın. NOT: Bu, kafatasının tabanının altında bulunan Cisterna magna'yı (ters üçgen) ortaya çıkarmalıdır (Şekil 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Elastaz hazırlanması NOT: Sipariş edilen elastaz (toz form) paketi 250 Birim (U) içeriyordu. Her bir hayvana enjekte edilecek elastaz miktarı 2,5 μL'dir. 2.5 μL'de olması gereken elastaz miktarı 15 miliUnits mU olmalıdır.<ol><li>İlk önce enjekte edilecek çözeltinin konsantrasyonunu hesaplayın. Konsantrasyon = kütle / hacim = 15 mU/2,5 μL = 6 mU/μL Bu nedenle, gerekli konsantrasyon 6 mU / μL'dir.</li>
		<li>Elastaz miktarı 250 U'dur ve etüt milliUnits ile çalışır, bu nedenle birimleri 250000 mU veren milliUnits'e dönüştürün.</li>
		<li>250000 mU'luk bir kütleye ve 6 mU/uL'lik bir konsantrasyona sahip olduktan sonra, elastazın seyreltilmesini ve 6 mU/uL'lik bir konsantrasyonun korunmasını gerektirecek hacmi (PBS) hesaplayın.</li>
		<li>Yukarıdaki formülün aynısını kullanarak, hacmi çözmek için yeniden düzenleyin: Hacim = kütle/Conc. = 250000 mU/ 6 mU/μL = 41666.67 μL</li>
		<li>41666.67 μL'yi pipetlemek zor olduğundan, 1x çözelti elde etmek için 41.66667 mL elde etmek için 1000'e bölerek mililitreye dönüştürün.<ol><li>Çözeltiyi daha konsantre hale getirmek için 10 kat veya 100 kat artırın.</li>
			<li>Çalışması daha basit olduğu için 10x'lik bir çözüm oluşturun (aşağıya bakın). 10x çözelti ---------- 4.166667 mL (konsantre)</li>
		</ol></li>
		<li>250 U'yu 5 mL'lik bir alikot tüpüne yerleştirin ve 10x stok çözeltisini yapmak için alikot tüpüne 4.167 mL steril PBS ekleyin.</li>
		<li>10 μL stok solüsyonunu pipetleyin ve 1000 μL'lik 4.167 mL stok solüsyonu veren 100 alikot tüpüne yerleştirin. Tüpleri -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Stok çözeltisinin geri kalanını alikot tüplerde tüp başına 100 μL'de saklayın ve dondurucuda -20 °C'de saklayın. NOT: Çözeltiler -20 °C'de 6 aya kadar stabildir ve önemli bir aktivite kaybı olmaz. Ek olarak, elastazın aşırı donmasının ve çözülmesinin stabiliteyi azaltabileceğine dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, bunun olmasını önlemek için, stok çözeltisi dondurulmadan önce, enjeksiyon için bir seferde yalnızca bir numunenin çözülmesi gerekecek şekilde bölünebilir.</li>
		<li>10 μL 10x çözelti içeren alikot tüplerinden birini çözdürdükten sonra, 100 μL 1x çözelti elde etmek için 90 μL steril PBS ekleyin.</li>
		<li>Bunun yerine 100 μL 10x çözelti içeren alikot tüpü çözüldüyse, 1x çözelti olan 1000 μL elde etmek için 900 μL PBS eklemeniz yeterlidir. Her iki çözeltiyi de 1 hafta boyunca 4 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Cisterna magna'ya enjekte etmek NOT: Hamilton şırıngasını elastaz ile yüklemeden önce damıtılmış su 5x, ardından etanol 5x ve son olarak damıtılmış su 5x ile yükleyerek ve aspire ederek temizleyin.<ol><li>Hamilton şırıngasını 2,5 μL elastaz (15 mU konsantrasyon) ile doldurun ve hava kabarcığı olmadığından emin olun.</li>
		<li>Şırıngayı, eğim yukarı bakacak şekilde yavaşça Sarnıç magnasının ortasına yerleştirin. NOT: Cisterna magna'dan geçen kan damarlarını delmekten kaçının.</li>
		<li>Delinmeden sonra eğimi çıkarın. Bu, az miktarda beyin omurilik sıvısının (BOS) salınmasını kolaylaştıracaktır. Fazla BOS'u emmek için steril bir pamuklu çubuk kullanın.</li>
		<li>Eğimi delinme bölgesine tekrar yerleştirin, elastazı veya aracı 1 dakikadan fazla yavaşça Cisterna magna'ya enjekte edin ve herhangi bir elastaz sızıntısını önlemek için iğneyi 1 dakika yerinde bırakın.</li>
		<li>Eğimi çıkardıktan sonra, insizyon bölgesini emilmeyen bir cerrahi sütürle (3/8" iğne ile # 4-0) kapatın ve anesteziyi kapatın.</li>
		<li>Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın ve konu iyileşene kadar 37 °C'ye ayarlanmış ılık bir ısı yastığının üzerine koyun. NOT: Ameliyat sonrası iyileşme sırasında ağrıya yardımcı olmak için ameliyattan sonra başka bir Metacam dozu önerilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Silikon kauçuk bileşiği enjeksiyonu ve doku hasadı
<ol><li>Hayvanı aşırı dozda avertin (1 mL, 125-250 mg / kg) ile uyuşturun. NOT: Reflekslerin durduğundan emin olmak için ayak parmağınızı sıkıştırın.</li>
	<li>Hayvanı bir bebek bezine yerleştirin ve göğüs boşluğu yukarı bakacak şekilde tüm uzuvları cerrahi bantla sabitleyin</li>
	<li>Kalbi ortaya çıkarmak için cımbız ve makas kullanarak göğüs boşluğunu açın.</li>
	<li>Kalbin sol ventrikülüne 23 G'lik künt bir iğne yerleştirin ve bir mikro perfüzyon pompası kullanarak kan damarlarını temizlemek için 4 dakika boyunca heparin (100 U / mL) ile infüzyon edilmiş PBS ile perfüze edin.</li>
	<li>Tampon şişesini %4 paraformaldehit (PFA) (PBS'de yapılmış) içeren bir şişeyle değiştirin ve 4 dakika daha perfüz.</li>
	<li>50 mL'lik bir tüpte 5 mL bileşiği 5 mL seyreltici ile birleştirerek silikon kauçuk bileşiği (sarı) çözeltisini hazırlayın. Kullanmadan önce iyice karıştırın.</li>
	<li>10 mL'lik bir şırıngayı 10 mL silikon kauçuk bileşimi ile doldurun. Şırıngayı 23 G künt iğneye bağlı hortuma takın ve çözeltiyi dikkatlice kalbe manuel olarak enjekte edin. NOT: Silikon kauçuk bileşiğinin yüksek viskozitesi nedeniyle, daha büyük bir namlu şırınga kullanmak önemlidir, aksi takdirde basınç pistonu itmek için çok büyük olacaktır.</li>
	<li>Enjeksiyondan sonra farenin kafasını çıkarın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın, böylece silikon kauçuk bileşiğinin kaplarda sertleşmesine izin verin.</li>
	<li>Ertesi gün, farenin kafatasını nazikçe çıkarın (tercihen ince cımbız kullanarak), beyni çıkarın ve gece boyunca oda sıcaklığında (RT) %4 PFA'da inkübe edin.</li>
	<li>PFA'da 24 saatlik bir inkübasyondan sonra, beyni PBS 3x'te yıkayın,% 30 sükroz içine koyun ve 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>3. Kantitatif analiz
<ol><li>Willis Çemberi'nin tüm beyindeki yüksek kaliteli görüntülerini yakalamak için (Şekil 3):<ol><li>Beyni sükroz çözeltisinden çıkarın. Yüzey nemini emmek için bir kağıt havlu kullanarak beyni iyice kurulayın.</li>
		<li>Beyni bir beyin dilimleyiciye yerleştirin. Beyin dilimleyiciyi bir kamera ile donatılmış bir ışık mikroskobu altına yerleştirin.</li>
		<li>Mikroskobu, Willis Çemberi'nin net, yüksek çözünürlüklü bir çözünürlüğüne odaklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yaklaşık 1 cm ölçmek ve piksel sayısını not etmek için 10 cm cetvel referanslı görüntü analiz yazılımı kullanın. Bu ölçüme göre 1 cm'lik ölçeği ayarlayın, ardından çapını bulmak için baziler arterin kalınlığını yatay olarak ölçün.</li>
	<li>Görüntüyü analiz etmek için standart bir piksel dansitometri yazılımı kullanın. Bir görüntü analiz yazılımı kullanarak baziler arterin beş ayrı okumasını (santimetre cinsinden) ölçün ve baziler arter çapının doğru bir temsilini elde etmek için ortalamayı hesaplayın.</li>
	<li>Elastaz ve kontrol grubu arasındaki ortalama çap değişimini karşılaştırmak için 2 yönlü bir varyans analizi (ANOVA) kullanın.<ol><li>Aşağıdaki 21'i kullanarak çaptaki yüzde değişimini hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66792/66792eq01.jpg" style="margin: auto;"> C = bağıl değişim X1 = Başlangıç değeri (Araç) X2 = Son değer (Elastaz) 0,05'ten küçük P değerlerini istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin. Tüm istatistiksel analizleri bir istatistiksel analiz yazılımı kullanarak gerçekleştirin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Alkol dehidrasyonu kullanılarak silikon kauçuk bileşiğinin çıkarılması
NOT: Fazla silikon kauçuk bileşiğinin kan damarından uzaklaştırılmasına yardımcı olmak için beyni kurutmak önemlidir, bu da immün boyamanın kalitesini potansiyel olarak artırabilir.
<ol><li>Sükrozu çıkarmak için beyinleri PBS ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Beyni, toplam 5 gün boyunca her konsantrasyonda 24 saat boyunca %25, %50, %75, %95 ve mutlak etanole yerleştirin.</li>
	<li>Dokunun dehidrasyonundan sonra, dokuyu 12-24 saat boyunca metil salisilata (konsantre% ≤100) yerleştirin. Etanol ve metil salisilat, dokudaki fazla silikonun çıkarılmasına izin verecektir.</li>
	<li>Artık kimyasalları uzaklaştırmak için beyni PBS 3x'te yıkayın ve gece boyunca taze PBS'de 4 °C'de bir külbütörde bırakın.</li>
	<li>Beyni sükroz içine yerleştirin ve kesit alma ve immün boyamadan önce 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>5. İmmünohistokimyasal boyama
<ol><li>Beyinlerin bölümlere ayrılması<ol><li>İmmünoseksiyondan önce, beynin sakarozla dolu tüpün dibine yerleşmesine izin verin.</li>
		<li>Kuru buzla çevrili optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği kullanarak beyni mikrotom platformunda dondurun. Mikrotom bıçağını kullanarak beyni 40 μm'lik bölümlere ayırın.</li>
		<li>İnce uçlu bir boya fırçası kullanarak donmayı önlemek için her bölümü kriyoprotektan içeren 96 oyuklu bir plakaya aktarın.</li>
		<li>96 oyuklu plakayı plastik sargı ile güvenli bir şekilde kapatın. Kapalı plakayı -20 °C dondurucuda saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>İmmünofloresan boyama (örnek olarak NeuN kullanılarak)<ol><li>Bölümleri 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Kriyoprotektanı ortadan kaldırmak için PBS ile üç yıkama yapın.</li>
		<li>Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için,% 2 keçi serumu,% 0.1 Triton-X 100 ve% 1 BSA içeren bir blokaj çözeltisi kullanarak RT'de 1 saat inkübe edin.</li>
		<li>Tüm bileşenleri PBS'de hazırlayın. NOT: Kullanılan birincil antikor, 1: 500 seyreltme ile monoklonal fare anti-NeuN'yi içeriyordu. Kullanılan ikincil antikor, 1:200 seyreltme ile poliklonal keçi anti-fare 568'i içeriyordu.</li>
		<li>Monoklonal fare anti-NeuN'yi yukarıda belirtilen bloke edici çözelti içinde seyreltin.</li>
		<li>Seyreltilmiş antikoru her bir oyuğa ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin, ışıktan folyo ile korunun.</li>
		<li>Birincil inkübasyondan sonra, bölümleri 3x PBS ile yıkayın. Poliklonal keçi anti-fare 568'i aynı engelleme çözeltisi içinde seyreltin.</li>
		<li>Seyreltilmiş antikoru her bir oyuğa ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin, folyo ile ışıktan korunun.</li>
		<li>İkincil inkübasyondan sonra bölümleri 3x PBS ile yıkayın.</li>
		<li>İnce boya fırçaları kullanarak bölümleri slaytlara yavaşça aktararak montaja hazırlanın. Tüm bölümlerin kurumasını bekleyin.</li>
		<li>Bölümler kuruduktan sonra 125-150 μL solmaya karşı dayanıklı montaj ortamı uygulayın. Lamelleri nazikçe yerleştirin.</li>
		<li>Slaytların karanlıkta RT'de 24 saat kurumasına izin verin, kenarları oje ile kapatın. Görüntüleme yazılımı kullanarak floresan görüntüler yakalayın.</li>
	</ol></li>
</ol>

Dolichoectasia: vasküler demans ve Alzheimer

<ol>
	<li>Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blood-brain+barrier+overview+on+structure,+function,+impairment,+and+biomarkers+of+integrity.">A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity.</a> Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69 (2020).</li><li>Sethi, B., Kumar, V., Mahato, K., Coulter, D. W., Mahato, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+drug+delivery+and+targeting+to+the+brain.">Recent advances in drug delivery and targeting to the brain.</a> J Control Release. 350, 668-687 (2022).</li><li>Vagnucci, A. H., Li, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+and+angiogenesis.">Alzheimer's disease and angiogenesis.</a> Lancet. 361 (9357), 605-608 (2003).</li><li>Banks, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+blood-brain+barrier+disruption:+roles+of+cyclooxygenase,+oxidative+stress,+neuroinflammation,+and+elements+of+the+neurovascular+unit.">Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit.</a> J Neuroinflamm. 12, 223 (2015).</li><li>Archie, S. R., Shoyaib, A. A., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+CNS+disorders+and+putative+therapeutic+targets:+an+overview.">Blood-brain barrier dysfunction in CNS disorders and putative therapeutic targets: an overview.</a> Pharmaceutics. 13 (11), 1779 (2021).</li><li>Jefferies, W. A., Price, K. A., Biron, K. E., Fenninger, F., Pfeifer, C. G., Dickstein, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adjusting+the+compass:+new+insights+into+the+role+of+angiogenesis+in+Alzheimer's+disease.">Adjusting the compass: new insights into the role of angiogenesis in Alzheimer's disease.</a> Alzheimers Res Ther. 5 (6), 64 (2013).</li><li>Kook, S. Y., Seok-Hong, H., Moon, M., Mook-Jung, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+blood-brain+barrier+in+Alzheimer+disease+pathogenesis.">Disruption of blood-brain barrier in Alzheimer disease pathogenesis.</a> Tissue Barriers. 1 (2), e23993 (2013).</li><li>Kempermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+dependency+and+aging+in+the+regulation+of+adult+neurogenesis.">Activity dependency and aging in the regulation of adult neurogenesis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a018929 (2015).</li><li>Del Brutto, V. J., Ortiz, J. G., Biller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+arterial+dolichoectasia.">Intracranial arterial dolichoectasia.</a> Front Neurol. 8, 344 (2017).</li><li>de la Torre, J. C., Mussivand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+disturbed+brain+microcirculation+cause+Alzheimer's+disease.">Can disturbed brain microcirculation cause Alzheimer's disease.</a> Neurol Res. 15 (3), 146-153 (1993).</li><li>Gutierrez, J., Sacco, R. L., Wright, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dolichoectasia-an+evolving+arterial+disease.">Dolichoectasia-an evolving arterial disease.</a> Nat Rev Neurol. 7 (1), 41-50 (2011).</li><li>Desai, B. S., Schneider, J. A., Li, J. L., Carvey, P. M., Hendey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+angiogenic+vessels+in+Alzheimer's+disease.">Evidence of angiogenic vessels in Alzheimer's disease.</a> J Neural Transm. 116 (5), 587-597 (2009).</li><li>Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+triggers+extensive+cerebral+angiogenesis+causing+blood+brain+barrier+permeability+and+hypervascularity+in+Alzheimer's+disease.">Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).</li><li>Zenaro, E., Piacentino, G., Constantin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+in+Alzheimer's+disease.">The blood-brain barrier in Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 107, 41-56 (2017).</li><li>Brandl, S., Reindl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+barrier+breakdown+in+neuroinflammation:+current+in+vitro+models.">Blood-Brain barrier breakdown in neuroinflammation: current in vitro models.</a> Int J Mol Sci. 24 (16), 12699 (2023).</li><li>Austin, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+hypoperfusion+in+Alzheimer's+disease.">Effects of hypoperfusion in Alzheimer's disease.</a> J Alzheimers Dis. 26, 123-133 (2011).</li><li>Jagust, W. J., Budinger, T. F., Reed, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnosis+of+dementia+with+single+photon+emission+computed+tomography.">The diagnosis of dementia with single photon emission computed tomography.</a> Arch Neurol. 44 (3), 258-262 (1987).</li><li>Schuff, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+blood+flow+in+ischemic+vascular+dementia+and+Alzheimer's+disease,+measured+by+arterial+spin-labeling+magnetic+resonance+imaging.">Cerebral blood flow in ischemic vascular dementia and Alzheimer's disease, measured by arterial spin-labeling magnetic resonance imaging.</a> Alzheimers Dement. 5 (6), 454-462 (2009).</li><li>Singh, C., Pfeifer, C. G., Jefferies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Angiogenic+Mechanisms+in+Alzheimer's+Disease.">Pathogenic Angiogenic Mechanisms in Alzheimer's Disease.</a> Physiologic and Pathologic Angiogenesis - Signaling Mechanisms and Targeted Therapy. , (2017).</li><li>Dai, D., Kadirvel, R., Rezek, I., Ding, Y. H., Lingineni, R., Kallmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase-induced+intracranial+dolichoectasia+model+in+mice.">Elastase-induced intracranial dolichoectasia model in mice.</a> Neurosurgery. 76 (3), 337-343 (2015).</li><li>Liu, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+protocol+for+establishment+of+intracranial+arterial+Dolichoectasia+model+by+injection+of+elastase+into+cerebellomedullary+cistern+in+mice.">Modified protocol for establishment of intracranial arterial Dolichoectasia model by injection of elastase into cerebellomedullary cistern in mice.</a> Front Neurol. 13, 860541 (2022).</li><li>Lee, A. Y., Han, B., Lamm, S. D., Fierro, C. A., Han, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+elastin+degradation+and+surrounding+matrix+support+on+artery+stability.">Effects of elastin degradation and surrounding matrix support on artery stability.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (4), H873-H884 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+elastase+in+corneal+epithelial+barrier+dysfunction+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa+exoproteins.">The role of elastase in corneal epithelial barrier dysfunction caused by Pseudomonas aeruginosa exoproteins.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (9), 7 (2021).</li><li>Temesv&#225;ri, P., &#193;brah&#225;m, C. S., Gell&#233;n, J., Speer, C. P., Kov&#225;cs, J., Megyeri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase+given+intracisternally+opens+blood-brain+barrier+in+newborn+piglets.">Elastase given intracisternally opens blood-brain barrier in newborn piglets.</a> Biol Neonatol. 67 (1), 59-63 (1995).</li><li>Takata, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+mice+intratracheally+administered+porcine+pancreatic+elastase.">Elevated permeability of the blood-brain barrier in mice intratracheally administered porcine pancreatic elastase.</a> J Pharmacol Sci. 129 (1), 78-81 (2015).</li><li>Hanyu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+mixed+dementia.">Diagnosis and treatment of mixed dementia.</a> Brain Nerve. 64 (9), 1047-1055 (2012).</li><li>Chui, H. C., Ramirez-Gomez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+imaging+features+of+mixed+alzheimer+and+vascular+pathologies.">Clinical and imaging features of mixed alzheimer and vascular pathologies.</a> Alzheimers Res Ther. 7 (1), 21 (2015).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+app+knock-in+mouse+models+of+alzheimer's+disease.">Single app knock-in mouse models of alzheimer's disease.</a> Nat Neurosci. 17 (5), 661-663 (2014).</li><li>Dobrin, P. B., Canfield, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase,+collagenase,+and+the+biaxial+elastic+properties+of+dog+carotid+artery.">Elastase, collagenase, and the biaxial elastic properties of dog carotid artery.</a> Am J Physiol. 247, H124-H131 (1984).</li><li>Wagenseil, J. E., Ciliberto, C. H., Knutsen, R. H., Levy, M. A., Kovacs, A., Mecham, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vessel+elasticity+alters+cardiovascular+structure+and+function+in+newborn+mice.">Reduced vessel elasticity alters cardiovascular structure and function in newborn mice.</a> Circ Res. 104 (10), 1217-1224 (2009).</li></ol>

Çıkar çatışması yoktur.

Bu makale, farelerin Cisterna magna'sına elastaz enjeksiyonu için kesin ve basit bir yaklaşım sağlayan serebrovasküler dilatasyon için geliştirilmiş bir protokolü göstermektedir. Bu anatomik nokta, beyin omurilik sıvısına doğrudan bir geçit görevi görür ve farklı nörolojik hastalıkların araştırılması için değerli bir yol sunar. Bu modifiye tekniğin ana avantajlarından biri, farelerin Cisterna magna'sına tek bir doz elastaz enjekte edilmesinin, tekrarlanabilir enjeksiyona veya bir kanül im...

Serebral kılcal damarları kaplayan mikrovasküler endotel hücreleri, beyin dolaşımına çevre ile neyin girdiğini veya neyin çıktığını düzenlemede çok önemli bir rol oynayan kan-beyin bariyerini (BBB)1 oluşturmak için ana bileşenlerdir. Sinir dokusu için gerekli olan temel besin maddelerinin BBB'ye girmesine izin verilirken, glutamat gibi bazı esansiyel amino asitler beyinden atılır, çünkü yüksek konsantrasyonlar beyin dokusunda kalıcı nörouyarıcı hasara neden olabilir2. Normal fizyolojik koşullar altında, BBB, albümin 3,4 ve protrombin gibi plazma proteinlerinin beyne girmesini sınırlar, çünkü bunlar zararlı etkilere sahip olabilir 5,6,7. Son olarak, BBB beyni, gıda veya çevreden gelen ksenobiyotikler gibi periferde dolaşan nörotoksinlerden korur1. Genel olarak, beyin dokularına verilen hasar geri döndürülemez ve düşük nörojenezseviyeleri 8 ile ilişkili yaşlanma, BBB'nin nörodejeneratif süreci hızlandıran herhangi bir faktörün korunmasında ve önlenmesinde önemini vurgulamaktadır.
Dolichoectasia'da (veya büyük kan damarı dilatasyonunda), damar elastikiyetinde bir azalma gözlenir, bu da damarların morfolojik değişikliklere uğramasına neden olur, böylece onları işlevsiz hale getirir9 ve beyindeki kan akışının azalmasına neden olur. Kan akışındaki bu azalma daha sonra oksijen ve glikoz kaynağını azaltır ve sonuçta reaktif astrositlerin10 aktivasyonu yoluyla BBB'ye zarar verir. Damarların iç elastin laminası dolikoektazi11'den hasar gördüğünde, anjiyogenez için vasküler endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) tekrar tekrar uyarılması gereklidir. Bu, sızdıran damarların oluşumuna yol açabilir ve sonuçta kusurlu damarların gelişimi ile karakterize edilen patolojik anjiyogenez ile sonuçlanabilir12. Patolojik anjiyogenez sırasında, kan damarları kusurlu hale geldiğinde, sıkı bağlantı proteinlerini yukarı regüle ederek damar bütünlüğünü yeniden sağlamak için telafi edici bir mekanizma ortaya çıkar. Bununla birlikte, bu işlem, bir kan damarının yapısal bütünlüğü kaybolduğunda yanlışlıkla BBB'yi bozabilir13. Bu, BBB'yi daha da bozarak ve amiloid plak14 üretimini teşvik ederek ortaya çıkabilir. Ek olarak, çevreden sızıntı nöroinflamasyona15 neden olabilir, bu da nöronal dejenerasyon ve ardından hafıza kaybı ile sonuçlanır.
Yapısal olarak BBB'nin sağladığı koruma, ksenobiyotik ajanların kandan beyne girmesini önleyen sıkı bağlantılardan geçer. Belirli maddelerin beyne girmesine izin verirken, BBB bunu esas olarak iki ana süreç, pasif difüzyon veya belirli kanallar (iyon kanalları ve taşıyıcılar gibi) yoluyla yapar1. AD'de araştırmalar, işlevsiz bir vasküler sistemin durumun ilerlemesinde önemli bir rol oynadığını göstermiştir12,13. Amiloid-beta (Aβ) plaklarının oluşumu ve nörodejenerasyon, BBB'nin12,13 parçalanmasından ve serebral kan akışındaki16 bozukluklardan kaynaklanabilir. Vasküler demans tanısı alan ve AD17,18 tanısı alan yaşlı bireylerde serebral kan akımında azalma görülebilir. Disfonksiyonel bir serebral kan akışı (CBF) ile birlikte kan-beyin bariyerinin (BBB) hasar görmesi, periferik dolaşımdan yabancı maddelerin sızması ile birlikte beyinde Aβ konsantrasyonunun artmasına katkıda bulunabilir19.
AH ve vasküler demans (VaD) gibi nörolojik hastalıkların patogenezini araştırmak için, hastalığı tekrarlamak için modeller geliştirilmiştir. İn vitro modeller yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak karışık hücre popülasyonu gibi kapsamlı hastalık modellemesi için biyolojik ortamdan yoksundur, bu nedenle in vivo modellerin önemini gerektirir. Fareler, hastalıkta insan benzeri özellikler (örneğin patoloji) oluşturmada genetik manipülasyon kolaylığı nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır. Şimdiye kadar kaydedilen ilerlemeyle birlikte, büyük damar dilatasyonu ve bunların AH'deki rolü gibi hastalık fenotiplerini taklit etmek için geliştirilmiş modellere hala ihtiyaç duyulmaktadır. Bu amaçla, bir fırsat gördük ve farelerin Cisterna magna'sına elastaz enjeksiyonunu içeren bir tekniği değiştirdik20,21. Elastaz, bağ dokusunda22 ve çevredeki sıkı bağlantılarda23 elastini parçaladığı gösterilen bir enzimdir. Cisterna magna, beyindeki en büyük kan damarı olan Willis çemberinin hemen üzerinde yer alması nedeniyle enjeksiyon noktası olarak seçildi. Cisterna magna'ya elastaz enjekte ederek, sıkı bağlantıları parçalayarak ve kan damarlarının genişlemesini indükleyerek (Willis çemberi) BBB ve kan damarlarını tehlikeye atabiliriz24,25. AD'nin vasküler bileşeninin patogenezinin daha iyi anlaşılması için bu tekniğin bir AD fare patoloji modelinin kullanımıyla birleştirilmesi, bu iki farklı patoloji arasındaki karmaşık etkileşimler ve etkiler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Önceki çalışmalar, hastaların tipik olarak karışık demans olarak adlandırılan bir durum olan AD ve VaD'nin hem patolojik özelliklerini sergilediği durumları göstermiştir26,27. Bu nedenle, her iki durum arasındaki birbirine bağlı mekanizmaları anlamak, bu nörodejeneratif bozuklukların ilerlemesi ve tezahürü hakkında daha kapsamlı bir bakış açısı sunabilir, altta yatan mekanizmaları ve potansiyel terapötik stratejileri anlamamızı geliştirir. Bu amaçla, vasküler değişiklikleri tanımlamak için bir AD patoloji fare modelinde (AppNL-F) elastaz uygulamasını gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23 G catheter</td>
			<td>University Medstore</td>
			<td>2546-CABD305145</td>
			<td>Needed for perfusion&#160; (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>University Medstore</td>
			<td>https://www.uoftmedstore.com/index.sz</td>
			<td>For removing the microfil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine scrub</td>
			<td>#</td>
			<td>https://www.pittsborofeed.com/products/betadine-surgical-scrub</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.ca/Povidone-Iodine-10-Topical-Solution-100ml/dp/B09DTKJGHW</td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacaine</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clippers</td>
			<td>BrainTree Scientific Inc</td>
			<td>CLP-41590</td>
			<td>Shave fur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Q-tip</td>
			<td>University Medstore</td>
			<td>1962</td>
			<td>For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>&#160;E7885</td>
			<td>Used for the dilatation of blood vessel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>University Medstore</td>
			<td>39752-P016-EAAN</td>
			<td>Sterilization (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse 568</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11004</td>
			<td>For staining mature neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad prism 10</td>
			<td>Graphpad prism 10</td>
			<td>https://www.graphpad.com/</td>
			<td>Statistical analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>28614-U</td>
			<td>Injection elastase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pad</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>https://www.amazon.ca/iPower-Temperature-Controller-Terrarium-Amphibians/dp/B08L4DBFFZ</td>
			<td>Maintain body temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>Fiji Imagej software</td>
			<td>imagej.net (USA)</td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Induction chamber</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Anesthesia induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metacam</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td>For removing the microfil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil</td>
			<td>Flow Tech, Carver, Massachusetts</td>
			<td>https://www.flowtech-inc.com/order/</td>
			<td>&#160;Dye (yellow)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-NeuN</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>For staining mature neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus VS200 slide scanner and VSI software.</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td>https://www.olympus-lifescience.com/en/downloads/detail-iframe/?0[downloads][id]=847254104</td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>University Medstore</td>
			<td>PAR070.1</td>
			<td>For protein fixation&#160; (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>https://pr.vwr.com/store/product/4787969/vwr-variable-speed-peristaltic-pumps</td>
			<td>Needed for perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>University Medstore</td>
			<td>2580-M90-10</td>
			<td>For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic</td>
			<td>Provided by animal facility</td>
			<td>N/A</td>
			<td>So secure the animal for surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissor</td>
			<td>University Medstore</td>
			<td>22751-A9-240</td>
			<td>For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tape</td>
			<td>University Medstore</td>
			<td>https://www.amazon.ca/3M-Micropore-Tape-1530-2-Rolls/dp/B0082A9GS2</td>
			<td>Secure the animal on the diaper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>University Medstore</td>
			<td>2297-VS881</td>
			<td>For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X2 tweezers</td>
			<td>University Medstore</td>
			<td>7731-A10-612</td>
			<td>For surgery (https://www.uoftmedstore.com/index.sz)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a visual approach for inducing dolichoectasia in mice to model large vessel-mediated cerebrovascular dysfunction

Kan-beyin (BBB), örneğin çevre ile seçici beyin dolaşımını düzenleyen, gerekli besinlerin beyinden aşırı amino asitlere veya toksinlere girmesine ve dışarı atılmasına izin veren çok önemli bir sistemdir. Vasküler demans (VaD) veya Alzheimer hastalığı (AD) gibi hastalıklarda BBB'nin nasıl tehlikeye atılabileceğini modellemek için araştırmacılar, damar dilatasyonunu modellemek için yeni yöntemler geliştirdiler. Bu hastalık durumlarında tehlikeye atılmış bir BBB zararlı olabilir ve BBB'nin düzensizliğine neden olabilir ve bu da beyin fonksiyonunu etkileyen istenmeyen ve patolojik sonuçlara yol açabilir. Elastaz kullanarak kan damarlarının dilatasyonunu indüklemek ve BBB'nin sıkı bağlantılarını (TJ) bozmak için doğrudan Cisterna magna'ya (CM) enjekte etmemizi sağlayan mevcut bir tekniği değiştirebildik. Bu yöntemle, tutarlı kan damarı dilatasyonu, azaltılmış mortalite veya daha iyi iyileşme ve bir silikon kauçuk bileşiği olan dolgu / opaklaştırıcı ajanın iyileştirilmesi, dilatasyon analizi için kan damarlarını etiketlemek için teslimat dahil olmak üzere önceki tekniklere göre çeşitli başarı ölçütleri görebildik. Bu modifiye minimal invaziv yöntem, farelerde enjeksiyondan 2 hafta ila 3 ay sonra büyük kan damarlarının sürekli genişlemesinde %19-32'lik bir artışla umut verici sonuçlar vermiştir. Bu iyileşme, yalnızca 2 haftalık işarette artan dilatasyon gösteren önceki çalışmalarla çelişmektedir. Ek veriler, 9,5 ay sonra bile genişlemenin devam ettiğini gösteriyor. Bu artış, elastaz ve araç enjekte edilen grubun kan damarlarının çapı karşılaştırılarak doğrulandı. Genel olarak, bu teknik, hayvan modelleri kullanarak merkezi sinir sistemini (CNS) etkileyen patolojik bozuklukları incelemek için değerlidir.

Microvascular endothelial cells that line the cerebral capillaries are the main components for forming the blood-brain barrier (BBB)1 which plays a crucial role in regulating what enters or leaves the brain circulation with the periphery. Essential nutrients needed for nervous tissue are permitted to enter the BBB, while some essential amino acids like glutamate are expelled from the brain, as high concentrations can cause permanent neuroexcitatory damage to brain tissue2. Under normal physiological conditions, the BBB limits the amount of plasma proteins like albumin3,4 and prothrombin from entering the brain since those can have detrimental effects5,6,7. Finally, the BBB protects the brain from neurotoxins that are circulating in the periphery, such as xenobiotics from food or the environment1. Overall, damage to brain tissues is irreversible, and aging that correlates with low levels of neurogenesis8 highlights the importance of the BBB in protecting and preventing any factors from accelerating the neurodegenerative process.
In dolichoectasia (or large blood vessel dilatation), a decrease in vessel elasticity is observed, which results in vessels undergoing morphological changes, thus rendering them dysfunctional9 and leading to reduced blood flow in the brain. This reduction in blood flow subsequently diminishes oxygen and glucose supply, ultimately triggering damage to the BBB through the activation of reactive astrocytes10. When the internal elastin lamina of vessels is damaged from dolichoectasia11, repeated stimulation of the vascular endothelial growth factor (VEGF) is necessary for angiogenesis. This can lead to the formation of leaky vessels and ultimately result in pathological angiogenesis, characterized by the development of defective vessels12. During pathological angiogenesis, when blood vessels become defective, a compensatory mechanism appears to restore vessel integrity by upregulating tight junction proteins. However, this process can inadvertently disrupt the BBB when the structural integrity of a blood vessel is lost13. This may occur through further disrupting the BBB and promoting the production of amyloid plaque14. Additionally, leakage from the periphery can cause neuroinflammation15, which results in neuronal degeneration and subsequent memory loss.
Structurally the protection that the BBB provides is through the tight junctions that prevent xenobiotic agents from the blood entering the brain. When permitting certain substances to enter the brain, the BBB mainly does it through two major processes, passive diffusion, or specific channels (like ion channels and transporters)1. In AD, research has demonstrated that a dysfunctional vascular system plays a significant role in the progression of the condition12,13. The formation of amyloid-beta (A&#946;) plaques and neurodegeneration can result from the breakdown of the BBB12,13 and disturbances in cerebral blood flow16. A reduction in cerebral blood flow can be seen in elderly individuals diagnosed with vascular dementia and AD17,18. Damage to the blood-brain barrier (BBB) along with a dysfunctional cerebral blood flow (CBF) can contribute to the increased production of A&#946; concentration in the brain, accompanied by the infiltration of foreign materials from the peripheral circulation19.
To investigate the pathogenesis of neurological diseases like AD and vascular dementia (VaD), models are developed to replicate the disease. In vitro models are extensively used but lack the biological environment for extensive disease modeling like mixed cell population, thus necessitating the importance of in vivo models. Mice are commonly used due to their ease of genetic manipulation in generating human-like properties (e.g., pathology) in disease. With the progression that has been made so far, there is still a continued need for improved models to emulate disease phenotypes like large vessel dilatation and their role in AD. To this end, we saw an opportunity and modified a technique that involved the injection of elastase into the Cisterna magna of mice20,21. Elastase is an enzyme that has been shown to break down elastin in connective tissue22 and in surrounding tight junctions23. The Cisterna magna was chosen as the point of injection due to it being located directly above the circle of Willis, the largest blood vessel in the brain. By injecting elastase into the Cisterna magna, we can compromise the BBB and blood vessels by breaking down the tight junctions and inducing dilatation of blood vessels (circle of Willis)24,25. Combining this technique with the use of an AD mouse model of pathology, for improved understanding of the pathogenesis for the vascular component of AD, can provide valuable insights into the complex interactions and influences between these two distinct pathologies.
Previous studies have demonstrated instances where patients display both the pathological features of AD and VaD, a condition typically referred to as mixed dementia26,27. Thus, understanding the interconnected mechanisms between both conditions can offer a more comprehensive perspective on the progression and manifestation of these neurodegenerative disorders, enhances our comprehension of the underlying mechanisms and potential therapeutic strategies. To this end, we demonstrate the application of elastase in an AD pathology mouse model (AppNL-F) to identify vascular changes.

Yazar Spotlight: Transgenik Farelerde Alzheimer Hastalığına Vasküler Katkıların Modellenmesi

Büyük Damar Aracılı Serebrovasküler Disfonksiyonu Modellemek için Farelerde Dolichoectaziyi İndüklemek İçin Görsel Bir Yaklaşım

The scope of our research is the model dolichoectasia in a transgenic mouse model to see the maximum impact that vascular changes have on Alzheimer's disease pathology. We are able to show that a single dose of elastase injection into the Cisterna magna of mice is able to cause dilatation up to the three months. Not much is known about individuals who suffer from both vascular dementia and Alzheimer's disease.We hope to bridge this gap by causing vascular changes in these transgenic mouse model to try and understand the pathogenesis of this form of mixed dementia. Previous studies were able to show that dilatation lasts up to two weeks, in our study, we showed that dilatation lasts up to three months with a low mortality during our surgical procedure. Successful dilatation of large blood vessel in a transgenic mouse model provides us with the opportunity to test drugs to prevent or improve vascular changes in Alzheimer's disease.

Fareyi stereotaksik çerçeveye dikkatlice yerleştirdikten ve kasları diseksiyon ettikten sonra Cisterna magna'yı kafatasının oksipital bölgesinin altına yerleştirmede başarılı olduk. Ters üçgeni andıran ve sarı renkle vurgulanan bu anatomik yapı, kafatasının tabanının altında yer almaktadır (Şekil 1). Hassasiyeti sağlamak ve beyin dokusuna herhangi bir zarar gelmesini önlemek için, Hamilton şırınga eğiminin 1-2 mm'si Cisterna magna'ya nazikçe yerleştirildi.</...

Read this Scientific Article Protocol about A Visual Approach for Inducing Dolichoectasia in Mice to Model Large Vessel-Mediated Cerebrovascular Dysfunction at JoVE.com

Vasküler demans ve Alzheimer hastalığı modellemesi için kullanılabilecek serebrovasküler disfonksiyonu araştırmak için bir model olarak farelerde kimyasal olarak indüklenen büyük kan damarı dilatasyonunu gösteriyoruz. Ayrıca, silikon kauçuk bileşiği enjekte ederek ve kan damarı boyutundaki değişiklikleri ölçmek için net bir görsel rehberlik sağlayarak damar sistemini görselleştirmeyi de gösteriyoruz.

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to ...

a-visual-approach-for-inducing-dolichoectasia-mice-to-model-large

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Visual Approach for Inducing Dolichoectasia in Mice to Model Large Vessel-Mediated Cerebrovascular Dysfunction

329 Görüntüleme.  Centre for Addiction and Mental Health. Araştırmamızın kapsamı, vasküler değişikliklerin Alzheimer hastalığı patolojisi üzerindeki maksimum etkisini görmek için transgenik bir fare modelinde dolikoektazi modelidir. Farelerin Cisterna magna'sına tek bir doz elastaz enjeksiyonunun üç aya kadar dilatasyona neden olabileceğini gösterebiliyoruz. Hem vasküler demans hem de Alzheimer hastalığından muzdarip bireyler hakkında pek bir şey bilinmemektedir.Bu transgenik fare mod...

Video: Yazar Spotlight: Transgenik Farelerde Alzheimer Hastalığına Vasküler Katkıların Modellenmesi

The blood-brain (BBB) is a crucial system that regulates selective brain circulation with the periphery, as an example, allowing necessary nutrients to enter and expel excessive amino acids or toxins from the brain. To model how the BBB can be compromised in diseases like vascular dementia (VaD) or Alzheimer's disease (AD), researchers developed novel methods to model vessel dilatation. A compromised BBB in these disease states can be detrimental and result in the dysregulation of the BBB leading to untoward and pathological consequences impacting brain function. We were able to modify an existing technique that enabled us to inject directly into the Cisterna magna (CM) to induce dilatation of blood vessels using elastase, and disrupt the tight junctions (TJ) of the BBB. With this method, we were able to see various metrics of success over previous techniques, including consistent blood vessel dilatation, reduced mortality or improved recovery, and improving the fill/opacifying agent, a silicone rubber compound, delivery for labeling blood vessels for dilatation analysis. This modified minimally invasive method has had promising results, with a 19%-32% increase in sustained dilatation of large blood vessels in mice from 2 weeks to 3 months post-injection. This improvement contrasts with previous studies, which showed increased dilatation only at the 2 week mark. Additional data suggests sustained expansion even after 9.5 months. This increase was confirmed by comparing the diameter of blood vessels of the elastase and the vehicle-injected group. Overall, this technique is valuable for studying pathological disorders that affect the central nervous system (CNS) using animal models.

We demonstrate chemically inducing large blood vessel dilatation in mice as a model for investigating cerebrovascular dysfunction, which can be used for vascular dementia and Alzheimer's disease modeling. We also demonstrate visualizing the vasculature by injecting silicone rubber compound and providing clear visual guidance for measuring changes in blood vessel size.

Nörobilim

Mouse Cisterna Magna (CM) Injection Procedure to Study Elastase-Induced Vessel Dilatation in CNS Disorders

To begin place an anesthetized mouse on a fresh surgical drape. Apply ophthalmic ointment to the animal's eye to prevent dryness, then inject Metacam, followed by 0.5 milliliters of saline subcutaneously into the mouse. Shave the neck of the mouse at the base of the occipital bone, and wipe down the surface with sterile PBS.Transfer the mouse to the stereotaxic frame in the prone position. Place the nose bar from the stereotaxic frame on top of the mouse to provide stability, and ensure the upper teeth are fastened. Position the animal head at a 120 degree angle from the body to elevate and distend the nape.Next, using sterile gauze, clean the surgical site three times with Betadine scrub and 70%ethanol. Then wipe once with Betadine solution. Using a scalpel, make a small one centimeter incision.Carefully run the scalpel along the midline to cut through the muscles. Using forceps, gently pull the muscles apart to the left and the right. Then load the Hamilton syringe with 2.5 microliters of elastase avoiding air bubbles.Slowly insert the syringe with the bevel facing upward into the center of the cisterna magna. After puncturing, carefully withdraw the bevel to facilitate the release of a small amount of cerebrospinal fluid or CSF. Next, reinsert the bevel to the puncture site and slowly inject elastase or vehicle into the cisterna magna, leaving the needle in place for one minute to prevent elastase leakage.After removing the bevel, close the incision site with a non-absorbable surgical suture, and turn off the anesthetic. Remove the animal from the stereotaxic frame and place it on a 37 degree Celsius heat pad until the mouse recovers.

CNS Bozukluklarında Elastaz ile İndüklenen Damar Dilatasyonunu İncelemek için Fare Sarnıcı Magna (CM) Enjeksiyon Prosedürü

Silicone Rubber Compound Injection and Tissue Harvest to Assess Vessel Dilatation in Neurodegenerative Diseases

To begin, place the anesthetized mouse on an absorbent pad or diaper. Pinch the mouse toe to confirm the ceased reflexes. Using surgical tape, secure all limbs with the chest cavity facing upward.Employing tweezers and scissors, carefully open the chest cavity to expose the heart. Insert a 23 gauge blunt needle into the left ventricle of the heart for perfusion. Then mix five milliliters of silicone rubber compound solution, with five milliliters of the diluent in a 50 milliliter tube.Using a hose linked 23 gauge blunt needle, inject 10 milliliters of the mixed compound into the heart. Next day using fine tweezers, gently remove the skull of the mouse and place the extracted brain in 4%paraformaldehyde at room temperature. After a 24 hour incubation, wash the brain three times in PBS and store it in 30%sucrose at four degrees Celsius.Pictographs of brains illustrated the enlargement of the basala artery and increased tortuosity around the circle of Willis following elastase injection compared with the PBS control group. Compared to the control group treated with PBS a significant blood vessel dilation was observed following a single elastase injection into the cisterna magna of three month old mice, which sustained for three months.