Dartmouth College'ın Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi'ne bu protokolde kullanılan hayvanlar için günlük yetiştiricilik sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca protokolün test edilmesindeki ve hayvanların fotoğraflanmasındaki yardımları için Leah Jacob ve Adwaita Bose'a da teşekkür ederiz. Son olarak, dövme pratiği eğitimi için Ann Miller'ın laboratuvarına teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIH hibesi R00 GM147826 JL'ye tarafından desteklenmiştir.

Açıklanan tüm hayvan prosedürleri, Dartmouth College'ın Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Ekipman kurulumu
NOT: Prosedür için bir iş akışı ve örnek bir tezgah kurulumu dahildir (Şekil 1).
<ol><li>Dövme tabancasını ve ayak pedalını güç kaynağına bağlayın. Ayak pedalını çalışma yüzeyinin altına yerleştirin.</li>
	<li>Dövme tabancasının montajı<ol><li>Bir Alyan anahtarı veya altıgen tornavida kullanarak tutamaktaki vidaları gevşetin (Şekil 2A, kırmızı daire içine alınmış).</li>
		<li>Plastik ucu tutamağın içine sonuna kadar sokun. Yerinde tutmak için vidayı sıkın.</li>
		<li>Metal boruyu tutamağın arkasına yerleştirin (Şekil 2A). Bu ayarlanacaktır, bu nedenle uzunluğunun yarısına kadar yerleştirin. Yerinde tutmak için vidayı sıkın.</li>
		<li>Tutamağın ön tarafındaki plastik uca rahatça oturması için tutamağın arkasından bir dövme iğnesi sokun (Şekil 2B).</li>
		<li>İğnenin ve metal borunun arkasını tüp kelepçesinden kaydırın. Metal boruyu, iğne plastik uca rahatça oturacak şekilde ayarlayın (Şekil 2B). Boru cl'yi elle sıkınamp tüp hareket edemeyecek duruma gelene kadar (Şekil 2C).</li>
		<li>Siyah O-ringi çıkarın ve iğneyi rotor koluna asın; iğneyi yerine sabitlemek için O-ringi değiştirin (Şekil 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Güç kaynağındaki voltajı, cildi delmek için yeterli güç olacak, ancak kontrol edilmesi zor olacak kadar güçlü olmayacak şekilde ayarlayın. Güç kaynağı prize takılıp bağlandıktan sonra, makinenin çalıştığından emin olmak için ayak pedalına basın. İğneyi kendinize veya diğer personele doğrultmamaya dikkat edin. NOT: Bu protokolde kullanılan dövme makinesi en iyi 6.0 ile 9.0 V arasında çalışır, ancak bu, dövme makineleri ve voltaj kaynakları arasında değişebilir ve ampirik olarak belirlenmelidir.</li>
	<li>1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün kapağını veya sağlanan plastik bir mürekkep kabını siyah dövme mürekkebi ile yaklaşık dörtte üçü kadar doldurun.</li>
</ol>2. Anestezi
<ol><li>Anesteziyi, bir yetişkin dişi X. laevis kurbağasını batıracak kadar büyük bir tankta hazırlayın.<ol><li>Kurbağa için güvenli (klorsuz) su kullanarak, 1,5 g / L'lik son konsantrasyona trikserin ve 3,5 g / L'lik son konsantrasyona sodyum bikarbonat ekleyin. Çözünmesi için karıştırın. Bu çözeltinin pH'ı 7.15'tir. DİKKAT: Trikain tahriş edicidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bir kurbağayı anestezi tankına batırın. Kurbağanın anestezi uygulanana kadar (7-8 dakika) tricaine solüsyonuna batırılmış halde kaldığından emin olun.<ol><li>Kurbağanın tam olarak uyuşturulup uyuşturulmadığını kontrol etmek için onu kaldırın, baş aşağı tutun ve tek ayağını sıkıca sıkın. Kurbağa ürkmezse veya tepki vermezse, dövme yapılabilir.</li>
		<li>Kurbağaların anestezi alması sürekli olarak 10 dakikadan fazla sürerse, sodyum bikarbonat ile tamponlanmış taze trikain çözeltisi hazırlayın. NOT: Kurbağalar tricaine solüsyonu15'te 30 dakikadan fazla zaman geçirmemelidir.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Dövme
NOT: Canlı bir hayvana dövme yaptırmadan önce, sert bir kabuğu olan bir meyve parçası (limon veya muz gibi) üzerinde pratik yapmak faydalı olabilir.
<ol><li>Dövme yapmadan önce kurbağalar için bir kurtarma tankı hazırlayın. Bir depoyu 10-15 L taze kurbağa için güvenli su ile doldurun ve bir Strafor adası ekleyin. Bu, kurbağanın boğulmadan uyanması için bir yüzey sağlayacaktır. NOT: Fermuarlı bir torba içine yerleştirilmiş bir strafor soğuk nakliye konteynerinin kapağı kullanılarak bir strafor adası yapılabilir.</li>
	<li>Anestezi uygulanmış kurbağayı kuru bir kağıt havlu veya tezgah kağıdı üzerine sırt üstü koyun (Şekil 3A). Kurbağalarla ilgili tüm işler için ağartılmamış (kahverengi) kağıt havlu kullanın.</li>
	<li>Kuru, tüy bırakmayan bir mendil kullanarak kurbağanın göğsündeki suyu ve mukusu silin.</li>
	<li>Kurbağanın göğsünün ortasındaki sternumu parmaklarınızla bulun ve baskın olmayan elinizi kullanarak cildi gergin tutun.</li>
	<li>Kurbağayı işaretlemek<ol><li>Monte edilmiş dövme tabancasını çalışma yüzeyine göre dikey olarak tutun ve iğneyi mürekkebe batırın (Şekil 3B).</li>
		<li>Monte edilmiş dövme tabancasını dikey tutarak, ayak pedalına basmadan önce iğnenin ucunu kurbağanın derisine bastırın. Eşit basınç uygularken kurbağanın derisine çizgiler çizin. NOT: Bazı küçük kanama veya kızarıklıklar, küçük cilt dökülmesi gibi normaldir.</li>
		<li>İğne kurbağanın derisine takılıyorsa, iğnedeki fazla mürekkebi veya cildi bir mendille temizleyin. Dövme sırasında fazla mürekkep olması normaldir.</li>
		<li>Kurbağanın göğsü, işaretlenen alanı net bir şekilde göremeyecek kadar fazla mürekkeple kaplıysa (Şekil 3C), fazla mürekkebi kurbağa için güvenli su ve bir mendille temizleyin (Şekil 3C'). Ardından kuru bir mendille nemi çekin ve mürekkeplemeye devam edin. NOT: Dövme yapmadan önce bir şişe kurbağa için güvenli su hazırlanabilir.</li>
		<li>Fazla mürekkebi sildikten sonra koyu, okunaklı sayılar kalana kadar aynı alanı mürekkeplemeye devam edin (Şekil 3D). Tüm işareti veya sayıyı tek bir vuruşta çizmek yerine, özellikle eğriler için art arda daha küçük vuruşlar yapın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Kurtarma
<ol><li>Bir kağıt havluyu kurbağa için güvenli suyla ıslatın ve strafor adanın üzerine düz bir şekilde yerleştirin (Şekil 4A).</li>
	<li>Kurbağaların ayakta duran tanklara geri döndürülmesi<ol><li>Kurbağayı suya bakacak şekilde havlunun üzerine göbeği yatırın (Şekil 4B). Kağıt havlunun yarısını kurbağanın arka yarısının üzerine katlayın ve ellerinizi kaplayarak kurbağanın üstünü ıslatın. Bir kurbağa anesteziden çıktığında (dövmeden yaklaşık 1 saat sonra), bağımsız olarak suya girecek ve normal şekilde yüzecektir.</li>
		<li>Dövme tamamen iyileştikten sonra kurbağaları 24 saat sonra uzun süreli konutlara geri koyun.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Temizlik ve ekipman bakımı
<ol><li>Dövme iğnelerinin yeniden kullanılması ve otoklavlanması<ol><li>Mürekkebi gevşetmek için iğneleri %100 izopropanol ve deiyonize suda durulayın ve çözünmemiş kalan mürekkebi ovalayın.</li>
		<li>Fırçaladıktan sonra, iğneleri metal bir otoklav kutusuna yerleştirin veya alüminyum folyo ile sarın ve kuru bir döngüde 30 dakika boyunca otoklavla sarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Dövme makinesinin veya diğer ekipmanın parçalarında mürekkep varsa,% 100 etanol ve bir kağıt havluyla silin.</li>
	<li>Anestezik çözelti, yaklaşık% 0.5'lik bir nihai trikin konsantrasyonuna sahiptir. Bunu kurumsal tehlikeli atık yönetimi yönergelerine göre atın.</li>
	<li>Ekipman depolama ve bakımı<ol><li>Mümkünse, dövme makinesini kuru bir odada saklayın. Aşırı nem, elektrikli bileşenlere zarar verir ve makinenin ömrünü kısaltır.</li>
		<li>Dövme makinesini iyi çalışır durumda tutmak için, titreşimlerden22 gevşemediğinden emin olmak için rotor üzerindeki yatağı (Şekil 2C) kontrol edin. Bu, bir Alyan anahtarı veya altıgen tornavida ile sıkılabilir.</li>
		<li>Ayda yaklaşık bir kez, rotor kolundaki yatağı kalın bir yağlama gresi22 kullanarak yağlayın.</li>
		<li>Bazı dövme makinelerinde rotor kolu sıkışabilir ve titremez. Bunu düzeltmek için rotor kolunu çevirin veya yayı iğne alçaltılmış konumda olacak şekilde sıkıştırın (Şekil 2C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Amfibi İşaretlemeyi Optimize Etme: Xenopus Dövme Rehberi

<ol>
	<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+and+humane+experimental+technique:+Implementing+change.">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals (Basel). 9 (10), 754 (2019).</li><li>Elkan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pregnancy+test.">The Xenopus pregnancy test.</a> British Med J. 2, 1253-1256 (1938).</li><li>Vize, P. D., Zorn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+genomic+data+and+browser+resources.">Xenopus genomic data and browser resources.</a> Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).</li><li>Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus: A Laboratory Manual. , (2023).</li><li>Borodinsky, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+as+a+model+organism+for+the+study+of+spinal+cord+formation,+development,+function+and+regeneration.">Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration.</a> Front Neural Circuits. 11, 90 (2017).</li><li>Hoppler, S., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus:+Experimental+access+to+cardiovascular+development,+regeneration+discovery,+and+cardiovascular+heart-defect+modeling.">Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200 (2020).</li><li>Fisher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase:+key+features+and+resources+of+the+Xenopus+model+organism+knowledgebase.">Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase.</a> Genetics. 224 (1), iyad018 (2023).</li><li>Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+as+a+model+system+to+study+cytoskeletal+dynamics+during+axon+pathfinding.">Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding.</a> Genesis. 55 (1-2), (2017).</li><li>Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+biology+of+cell+boundary+conditions+through+confinement+of+Xenopus+cell-free+cytoplasmic+extracts.">Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts.</a> Genesis. 55 (1-2), (2017).</li><li>Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+as+a+model+for+studies+in+mechanical+stress+and+cell+division.">Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division.</a> Genesis. 55 (1-2), (2017).</li><li>Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+congenital+kidney+diseases+in+Xenopus+laevis.">Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis.</a> Dis Model Mech. 12 (4), dmm038604 (2019).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Wheeler, G. N., Br&#228;ndli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens:+Lessons+from+zebrafish+and+Xenopus.">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).</li><li>Carron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origin+of+Hox13-dependent+skin+appendages+in+amphibians.">Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians.</a> Nat Commun. 15 (1), 2328 (2024).</li><li>Schultz, T. W., Dawson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housing+and+husbandry+of+Xenopus+for+oocyte+production.">Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production.</a> Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).</li><li>Cadillac, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal identification systems used for mice. , (2006).</li><li>Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+marking+amphibians.">Techniques for marking amphibians.</a> Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , 277-284 (1994).</li><li>Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+implant+fluorescent+marker:+A+reliable+marking+alternative+for+snakes.">Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes.</a> Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).</li><li>Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+identification+methods+for+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).</li><li>Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+of+African+clawed+toads+(Xenopus+laevis).+Improvement+of+a+skin+autograft+technique.">Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique.</a> New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).</li><li>R&#246;del, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis.">Xenopus tropicalis.</a> AmphibiaWeb. , (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+Tattoo+Supply.">Worldwide Tattoo Supply.</a> Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro &amp; Maintenance. , (2015).</li><li>Khan, S. U., Mufti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hot+history+and+cold+future+of+brands.">The hot history and cold future of brands.</a> J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).</li><li>Catlett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups &amp; More. , (2019).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

İnsanları dövmek binlerce yıl öncesine dayanan bir sanattır ve insanlar kendilerini dövme yaptıkları sürece hayvanları da dövme yapmışlardır veya markalamışlardır23. Hayvanları, özellikle memelileri işaretlemek için ekipman ve teknikler iyi kurulmuş, iyi belgelenmiş ve geniş çapta erişilebilirdir. Hayvanları işaretlemek başlangıçta hayvancılık ve hırsızlık caydırıcılarını ayırt etmek için23 olsa da, biyomedikal araştırmalardaki ...

Hayvan modelleri, insan sağlığı ile ilgili soruları araştırmak için yararlı araçlardır. Uygulamada, hayvan modellerini kullanan biyomedikal araştırmalar, sağlıklı bir hayvan kolonisinin dikkatli bir şekilde düzenlenmesini ve sürdürülmesini gerektirir. Etik hayvan muamelesi ve yetiştiriciliği için en iyi uygulamalar, deney için gereken hayvan sayısını azaltmayı ve hayvan refahını sağlamak için uygulamaları iyileştirmeyi amaçlamaktadır1. Pençeli kurbağa cinsi, Xenopus laevis (X. laevis; Afrika pençeli kurbağası) ve Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Batı pençeli kurbağa), X. laevis'in Güney Afrikalı doktorlar tarafından ilk gebelik testlerini yapmak için kullanıldığı 1930'lardan beri biyomedikal araştırmalarda kullanılmaktadır2. Modern hamilelik testleri artık kurbağa gerektirmese de, Xenopus araştırmasının rolü devam ediyor. Biyomedikal araştırmalar için Xenopus kullanmanın avantajları arasında iyi açıklamalı genomları3, büyük yumurta kavramalarının yıl boyunca indüklenebilir yumurtlaması4 ve in vitro fertilizasyona uygun harici olarak bırakılan yumurtalar yer alır. Bu özellikler onları omurgalı embriyolojisi ve gelişimi 5,6,7, temel moleküler ve hücresel biyoloji 7,8,9,10 ve insan hastalıklarının modellenmesi 7,11,12,13 için yararlı bir varlık haline getirir.
Bireysel Xenopus hayvanlarını izlemek için güvenilir yöntemler, biyolojik kopyaları kaydetmek ve araştırmada titizliği ve tekrarlanabilirliği geliştirmek için gereklidir. Xenopus sıklıkla gruplar halinde barındırıldığından, hayvan işaretlemesi araştırmacıların bireysel hayvanları kolayca izlemesine olanak tanır4. Hayvanların doğru bir kaydını tutmak, zamandan ve kaynaklardan tasarruf sağlayabilir ve hayvanların sağlığını takip etme yeteneğini geliştirebilir. Örneğin, hayvanların bireysel olarak tanımlanması, transgenik Xenopus hatları oluşturmak için organizasyon iş akışlarını iyileştirebilir, çünkü bu, hayvanların organizasyonunu ve bireysel olarak tanımlanmasını gerektiren14 dizileme ile doğrulanan belirli genotiplere sahip birden fazla kurbağa nesli gerektirir. Bu, özellikle bu mutasyonlar kolayca ayırt edilebilir yetişkin fenotiplerinden yoksun olduğunda geçerlidir. Benzer şekilde, temel hücresel ve gelişimsel biyolojiyi incelemek için Xenopus oositlerinin ve embriyolarının kullanılması, bireysel hayvanların izlenmesinden fayda sağlar. Yumurtlamayı indükledikten sonra, hiper yumurtlama sendromu gibi sağlık komplikasyonlarını önlemek için hayvanların en az 3 ay dinlenmesi gerekir15. Bireysel tanımlama yöntemleri, hayvanların çok sık yumurtlamaya teşvik edilmemesini sağlar.
Hayvanların işaretlenmesi ve izlenmesi, laboratuvar personelinin hayvanların sağlık sorunlarını izlemesine de olanak tanır. Aynı genotipteki hayvanların hastalanması, transgen ile ilişkili aşırı akrabalı yetiştirme veya beklenmeyen sağlık sorunlarını gösterebilir. Benzer şekilde, son yumurtlamadan sonra hastalanan hayvanlar, reaktifler, malzemeler veya tekniklerle ilgili sorunları gösterebilir. Hayvanları ve sağlıklarını izlemek, laboratuvar personelinin ve veteriner hekimlerin, endişeler yeniden ortaya çıktığında takip etmelerini ve gelecekteki hastalıkları önlemek için önleyici tedbirler almalarını sağlar. Memelilerde çok sayıda tanımlama yöntemi vardır. Fareler için kalıcı yöntemler arasında kulak delme, kulak küpeleri, dövme ve deri altı mikroçipler bulunur16. Bunlar, bir koloni veya kafes içindeki hayvanları net ve güvenilir bir şekilde ayırt edebilir ve laboratuvar personeli tarafından kolayca uygulanabilir. Kulak delme gibi yöntemler minimal invazivdir, yalnızca bir parça özel ekipman gerektirir ve çoğu yaştaki hayvanlar için işe yarar. Bu sistemler fareler için basit ve kullanışlı olsa da, kurbağalarda kullanımları benzersiz bir dizi zorluk sunar. Kurbağalar ve diğer amfibiler bir kulak kepçesinden (dış kulak yapısı) yoksundur. Bazı araştırmacılar hayvanın çenesine, ayak parmağına veya arka bacağına etiketler yapıştırmıştır17,18. Bu yaklaşım çeşitli sorunlara yol açtı: çene etiketleri tahrişe neden oldu ve ajite kurbağalar ön ayaklarıyla etiketleri çıkarmaya çalıştı17. Ayak etiketleri, ayak parmakları arasındaki dokumayı delerek hareketi bozdu ve kaybolma riskini taşıdı. Bu nedenle, amfibiler tanımlama için kendi yöntemlerine ihtiyaç duyarlar. Tarihsel olarak, amfibileri işaretlemek için ayak parmağı kırpma da kullanılmıştır17,19. Ayak parmağı keskin bir makasla kırpılır ve hayvan, ön ayaklardaki ve arka ayaklardaki ayak parmaklarının uzunluğu veya ayak parmağının geriye doğru uzadığı açı (semenderlerde) ile tanımlanabilir. Bununla birlikte, bu yöntem, ayak parmağının kırpılmasının hayvanın hareketini bozabileceğine dair etik kaygıyı ortaya çıkarmaktadır17. Ek olarak, bu kanamaya neden olabilir ve enfeksiyon riski oluşturabilir. Kurulan bir diğer işaretleme sistemi, kurbağanın bir kısmından derinin alındığı ve cerrahi olarak başka bir kısmına tutturulduğu deri otogreftleridir. Örneğin, bir kurbağanın sırtını veya omzunu göğsünden20 açık renkli bir deri grefti kullanarak işaretlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Deri greftleri ayrıca sınırlamalar ve risklerle birlikte gelir: prosedür invazivdir ve potansiyel olarak ölümcül bir rahatsızlık olan Aeromonas hydrophila enfeksiyonu veya kırmızı bacak riskini ortaya çıkarır; otogreftin tamamen iyileşmesi 6 haftaya kadar sürer; Ve açıklanan yöntemlerle, bir otogreft20 koymak için sınırlı yerler nedeniyle sadece 6 kurbağa bir arada barındırılabilir.
Daha az invaziv markalama yaklaşımları arasında cam boncuklar ve transponder yongalarıbulunur 17,19. Cam boncuk yönteminde, cam boncuklar küçük bir dikişe geçirilir ve kurbağanın derisine dikilir. Bu, en az 60 farklı renk kombinasyonu ile deri otogreftlerinden daha fazla değişkenlik sağlar. Bununla birlikte, dikişin dışarı çıkma ve boncukların kaybolmasına neden olma riski vardır. Alternatif olarak, kurbağanın dorsal lenf kesesinde deri altına bir mikroçip transponder implante edilebilir. Bu, en kalıcı işaretleme yöntemi olarak kabul edilir ve potansiyel olarak sonsuz sayıda hayvanın ayrı ayrı tanımlanmasını ve kataloglanmasını sağlar. Bununla birlikte, bu aynı zamanda en pahalı yöntemdir, çünkü bireysel mikroçipler pahalıdır ve büyük bir koloninin işaretlenmesi maliyetli olacaktır. Mikroçipler ayrıca19'u okumak için özel bir tarayıcı gerektirir. Xenopus tanımlaması için yaygın bir yaklaşım, hayvanların doğal renklendirmesine ve desenlerine atıfta bulunmaktır. Bu, özellikle yetişkinlik boyunca kalan farklı desenlere sahip olan X. laevis gibi kurbağalar için iyi çalışır. Bununla birlikte, bu desenler zamanla stresle değişebilir ve kurbağalar şeffaf ve renkli kaplar arasında hareket ettirildiğinde renklenme farklı görünebilir15. Ek olarak, bu tanımlama yöntemi, X. laevis'e kıyasla daha az belirgin işaretleme desenlerine sahip olan X. tropicalis veya renk işaretlemesi olmayan albino hayvanlar için daha az kullanışlıdır21. Farklı işaretlere sahip türler için bile, laboratuvar personeli işaretlerin yerleşimini ve boyutunu farklı şekilde yorumlayabilir ve bu da tanımlamada hatalara neden olabilir. Bu nedenle, hayvanları fotoğraflamak, ek bir tanımlama yöntemiyle birlikte en güvenilir olanıdır. Bu nedenle, Xenopus hayvanlarını kolayca ayırt edilebilir, kalıcı ve minimal invaziv bir teknik kullanarak işaretlemeye ve tanımlamaya çalışıyoruz.
Amfibilere dövme yapma yöntemlerini açıklayan sınırlı sayıda yayınlanmış kaynak vardır. Dövme, ısı markaları, gümüş nitrat markaları ve donma markaları dahil olmak üzere diğer markalama teknikleriyle birlikte tanımlanmıştır17. Aynı kaynakta, 27G hipodermik iğne ile rakamlar çizilerek dövme yapıldı ve işlemin, bir rakam veya başka bir işaret şeklinde bir tel kullanan diğer markalama tekniklerinin aksine, enfeksiyona neden olmadığı not edildi. Başka bir kaynakta, kurbağaları işaretlemek için bir elektrikli dövme makinesi (titreşimli bir iğne olarak tanımlanır) kullanıldı, ancak teknik hakkında çok az ayrıntı verildi 17,19. Yazarlar, kurbağanın koruyucu balçık tabakasını rahatsız ederek bu prosedürün kırmızı bacak riskini artırdığı konusunda uyarıyorlar. Hem tamamen noninvaziv (fotoğraflar gibi) hem de kalıcı (mikroçipler gibi) bir işaretleme veya tanımlama yöntemi olmasa da, dövme etkili bir uzlaşma sağlar. Dövme, deri otogreftleri gibi diğer tekniklere kıyasla nispeten basittir. Ek avantajlar arasında daha küçük bir öğrenme eğrisi ve nispeten ucuz ekipman bulunur. Sucul amfibileri dövmek, araştırmacıları korkutabilecek ve başarılı hayvan işaretlemesini bozabilecek bazı zorluklarla birlikte gelir. Bu makale, araştırmacılara yetişkin Xenopus'u döner bir dövme makinesiyle dövme yapmak için iyi belgelenmiş yöntemler sağlamayı amaçlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1203RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 Needle Round Disposable ULTRA</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>HTIPRS5-U</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1205RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1207RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Cord</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkpots</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, delicate task wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCA Connection</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scream Ink Pitch Black, 1oz</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>SI101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grips</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>STEALTH2-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam island</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the lid of a styrofoam cold shipping container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>CAUTION: IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unbleached paper towels</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2U229</td>
			<td>Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage Supply</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle (with frog-safe water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0340923T</td>
			<td>Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X. laevis adult female</td>
			<td>Xenopus1</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip-top plastic bag</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This bag should be large enough to hold the styrofoam island</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for tattooing xenopus laevis with a rotary tattoo machine

Hayvan modelleri, biyomedikal araştırmaların kapsamını genişleterek gelişimsel, moleküler ve hücresel biyoloji anlayışımızı geliştirir ve araştırmacıların insan hastalıklarını modellemesine olanak tanır. Bireysel hayvanları kaydetmek ve izlemek, araştırmacıların çalışma için gereken hayvan sayısını azaltmasına ve hayvan refahını iyileştirmek için uygulamaları iyileştirmesine olanak tanır. Memelileri işaretlemek ve izlemek için kulak delme ve kulak küpeleri de dahil olmak üzere iyi belgelenmiş birkaç yöntem mevcuttur. Bununla birlikte, sucul amfibi türlerini işaretleme yöntemleri sınırlıdır, mevcut kaynaklar modası geçmiş, etkisiz veya aşırı derecede maliyetlidir. Bu el yazmasında, Xenopus laevis'i döner bir dövme makinesiyle işaretlemek için yöntemleri ve en iyi uygulamaları özetliyoruz. Doğru dövme, yüksek kaliteli dövmelerle sonuçlanır, bireyleri araştırmacılar için kolayca ayırt edilebilir hale getirir ve hayvanların sağlığı için minimum risk oluşturur. Ayrıca, hızla solan ve hayvanlara gereksiz yere zarar veren dövmelere neden olabilecek düşük kaliteli dövmelerin nedenlerini de vurguluyoruz. Bu yaklaşım, araştırmacıların ve veteriner hekimlerin amfibileri işaretlemelerine, biyolojik kopyaları ve transgenik çizgileri izlemelerine ve hayvan sağlığının doğru kayıtlarını tutmalarına olanak tanır.

Animal models are useful tools for investigating questions pertaining to human health. In practice, biomedical research using animal models requires careful organization and maintenance of a healthy animal colony. Best practices for ethical animal handling and husbandry aim to reduce the number of animals needed for experimentation and refine practices to ensure animal welfare1. The clawed frog genus, including Xenopus laevis (X. laevis; African clawed frog) and Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Western clawed frog), have been used in biomedical research since the 1930s when X. laevis were used by South African doctors to conduct the first pregnancy tests2. While modern pregnancy tests no longer require frogs, the role of Xenopus research persists. Advantages of using Xenopus for biomedical research include their well-annotated genomes3, year-round inducible ovulation of large clutches of eggs4, and externally laid eggs amenable to in vitro fertilization. These features make them a useful asset for vertebrate embryology and development5,6,7, basic molecular and cellular biology7,8,9,10, and for modeling human disease7,11,12,13.
Reliable methods for tracking individual Xenopus animals are essential for recording biological replicates and improving rigor and reproducibility in research. As Xenopus are frequently housed in groups, animal marking allows researchers to easily track individual animals4. Maintaining an accurate record of animals can save time and resources and improve the ability to track animals&#39; health. For example, individual identification of animals can improve organization workflows for generating transgenic Xenopus lines, as this requires multiple generations of frogs with specific genotypes verified by sequencing14, which requires organization and individual identification of animals. This is particularly true when these mutations lack easily discernible adult phenotypes. Similarly, the use of Xenopus oocytes and embryos to study basic cellular and developmental biology benefits from tracking individual animals. After inducing ovulation, animals need to rest for a minimum of 3 months to prevent health complications such as hyper-ovulation syndrome15. Individual identification methods ensure that animals are not induced to ovulate too frequently.
Marking and tracking animals also enables lab personnel to track animals&#39; health concerns. Animals of the same genotype falling ill can indicate excessive inbreeding or unanticipated health concerns associated with the transgene. Similarly, animals falling ill after recent ovulation can indicate issues with reagents, materials, or techniques. Tracking animals and their health enables lab personnel and veterinarians to follow up when concerns resurface and take preventative measures to prevent future illness. In mammals, there are numerous identification methods. Permanent methods for mice include ear punching, ear tags, tattooing, and subcutaneous microchips16. These can clearly and reliably differentiate animals within a colony or cage and can be easily administered by laboratory personnel. Methods such as ear punching are minimally invasive, require only one piece of specialized equipment, and work for animals of most ages. While these systems are straightforward and useful for mice, their use in frogs presents a unique set of challenges. Frogs and other amphibians lack a pinna (external ear structure). Some researchers have attached tags to the animal&#39;s jaw, toe, or hind limb17,18. This approach resulted in various problems: jaw tags caused irritation, and agitated frogs attempted to pull off tags with their forelimbs17. Toe tags pierced the webbing between toes, impairing movement and carrying the risk of becoming lost. As such, amphibians require their own methods for identification. Historically, toe-clipping has also been used to mark amphibians17,19. The toe is clipped with a sharp pair of scissors, and the animal can be identified by the length of toes on the forefeet and hind feet or by the angle at which the toe has grown back (in salamanders). However, this method poses the ethical concern that toe clipping may impair the animal&#39;s movement17. In addition, this can cause bleeding and introduce a risk of infection. Another established marking system is skin autografts, in which skin is taken from one part of the frog and surgically attached to another part. For example, a method is described for marking a frog&#39;s back or shoulder using a light-colored skin graft from its chest20. Skin grafts also come with limitations and risks: the procedure is invasive and introduces the risk of Aeromonas hydrophila infection, or red leg, a potentially fatal affliction; complete healing of the autograft takes up to 6 weeks; and with the methods described, only 6 frogs can be housed together because of limited places to put an autograft20.
Less invasive marking approaches include glass beads and transponder chips17,19. In the glass bead method, glass beads are threaded onto a small suture and sewn into the frog&#39;s skin. This provides greater variability than skin autografts, with at least 60 distinctive color combinations. There is, however, a risk that the suture can come out and result in the beads being lost. Alternatively, a microchip transponder can be implanted under the skin in the frog&#39;s dorsal lymph sac. This is considered the most permanent marking method and enables a potentially infinite number of animals to be individually identified and cataloged. However, this is also the most expensive method, as individual microchips are expensive, and a large colony would be costly to mark. Microchips also require a special scanner to read19. One common approach for Xenopus identification is referring to animals&#39; natural coloring and patterning. This works especially well for frogs such as X. laevis, which have distinct patterns that remain throughout adulthood. However, these patterns can change over time with stress, and coloring can appear different when frogs are moved between transparent and tinted containers15. Additionally, this identification method is less useful for X. tropicalis, which has less distinct marking patterns compared to X. laevis, or for albino animals, which have no color markings21. Even for species with distinct markings, lab personnel can interpret the placement and size of markings differently, which can cause errors in identification. Because of this, photographing animals is most reliable in conjunction with an additional identification method. Therefore, we seek to mark and identify Xenopus animals using a technique that is easily discernable, permanent, and minimally invasive.
There are limited published resources describing methods for tattooing amphibians. Tattooing has been described alongside other branding techniques, including heat brands, silver nitrate brands, and freeze brands17. In the same resource, tattooing was done by drawing numerals with a 27G hypodermic needle, and the process was noted not to cause infection, in contrast to the other branding techniques, which used a wire shaped into a numeral or other mark. In another source, an electric tattooing machine (described as a vibrating needle) was used to mark frogs, but little detail was provided on the technique17,19. The authors warn that by disturbing the frog&#39;s protective slime layer, this procedure increases the risk of red leg. While there is no marking or identification method that is both completely noninvasive (such as photographs) and permanent (such as microchips), tattooing provides an effective compromise. Tattooing is relatively straightforward compared to other techniques, such as skin autografts. Additional benefits include a smaller learning curve and relatively inexpensive equipment. Tattooing aquatic amphibians comes with certain challenges, which can intimidate researchers and impair successful animal marking. This paper aims to provide researchers with well-documented methods for tattooing adult Xenopus with a rotary tattoo machine.

Yazar Spot Işığı: Biyomedikal Çalışmalar için Xenopus laevis İşaretleme Tekniklerinin Rafine Edilmesi

Xenopus laevis'i Döner Dövme Makinesi ile Dövme Yöntemleri

Our research is focused on investigating the organization of the cell cortex using Xenopus egg extracts and supported lipid bilayers. We are trying to understand how dynamic cytoskeletal patterns are regulated within the cortex and how these patterns support basic cell functions like cell division. This protocol outlines an effective and safe method for marking Xenopus laevis.This approach enables researchers to track genetic lines and experimental replicates and to monitor animal health. Tattooing is a cost-effective permanent marking technique for amphibians. It's much less invasive than other permanent methods, such as skin graft or tags, it's also more reliable than qualitative methods, like photos or pattern recognition.

Yüksek kaliteli dövmeler, kurbağanın göğsünde koyu, okunaklı vuruşlara sahip olacak ve birkaç metre uzaklıktan net bir şekilde ayırt edilebilecektir (Şekil 5A). Genel olarak, daha büyük sayılar ve işaretler okunabilirlik için daha iyidir, ancak daha uzun adlar ve sayılar kurbağanın göğsüne rahatça sığacak şekilde küçültülebilir. Dövmenin uzun ömürlülüğünü değerlendirmek daha zordur, ancak yüksek kaliteli kurbağa dövmeleri en az 3-6 ay boyunca kara...

Burada, yetişkin Xenopus laevis'i (Afrika pençeli kurbağası) döner bir dövme makinesi ile dövme yöntemlerini açıklıyoruz. Doğru dövme, birkaç ay süren ve hayvanları araştırma ve kayıt tutma amaçları için kolayca ayırt edilebilir hale getiren koyu, kolay okunabilir rakamlarla sonuçlanır.

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling ...

methods-for-tattooing-xenopus-laevis-with-a-rotary-tattoo-machine

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine

390 Görüntüleme.  Dartmouth College. Araştırmamız, Xenopus yumurta özleri ve desteklenen lipid çift katmanları kullanarak hücre korteksinin organizasyonunu araştırmaya odaklanmıştır. Dinamik hücre iskeleti modellerinin korteks içinde nasıl düzenlendiğini ve bu modellerin hücre bölünmesi gibi temel hücre fonksiyonlarını nasıl desteklediğini anlamaya çalışıyoruz. Bu protokol, Xenopus laevis'i işaretlemek için etkili ve güvenli bir yöntemin ana hatlarını çizmekte...

Video: Yazar Spot Işığı: Biyomedikal Çalışmalar için Xenopus laevis İşaretleme Tekniklerinin Rafine Edilmesi

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling researchers to model human disease. Recording and tracking individual animals allows researchers to reduce the number of animals required for study and refine practices to improve animal wellbeing. Several well-documented methods exist for marking and tracking mammals, including ear punching and ear tags. However, methods for marking aquatic amphibian species are limited, with the existing resources being outdated, ineffective, or prohibitively costly. In this manuscript, we outline methods and best practices for marking Xenopus laevis with a rotary tattoo machine. Proper tattooing results in high-quality tattoos, making individuals easily distinguishable for researchers and posing minimal risk to animals' health. We also highlight the causes of poor-quality tattoos, which can result in tattoos that fade quickly and cause unnecessary harm to animals. This approach allows researchers and veterinarians to mark amphibians, enabling them to track biological replicates and transgenic lines and to keep accurate records of animal health.

Here, we describe methods for tattooing adult Xenopus laevis (African clawed frog) with a rotary tattoo machine. Proper tattooing results in dark, easily legible numerals that last for several months and make animals easily distinguishable for research and recordkeeping purposes.

Biyoloji

Preparation of the Tattoo Gun to Mark Frogs for Research Purposes

To begin, connect the tattoo gun and foot pedal to the power supply. Position the foot pedal underneath the working surface. For assembling the tattoo gun, loosen the screws in the grip with an Allen wrench.Insert the plastic tip all the way into the grip and tighten the screw to hold it in place. Then insert the metal tube in the back of the grip to half of its length and tighten the screw while adjusting the length. Insert a tattoo needle through the back of the grip to secure it in the plastic tip at the front of the grip.Slide the back of the needle and metal tube through the tube clamp. After adjusting the metal tube, hand tighten the tube clamp until it cannot move. Remove the black O-ring, hook the needle onto the rotor arm, and replace the O-ring.Next, set the required voltage on the power supply. Once the power supply is plugged in, press the foot pedal to check if the machine works. Fill the plastic ink pot with black tattoo ink to about three quarters full before tattooing.

Araştırma amaçlı kurbağaları işaretlemek için dövme tabancasının hazırlanması

Rotary Tattoo Method for Long-Term Marking of Xenopus in Research Environments

To begin, set up the equipment for tattooing. Place the anesthetized frog on its back on a dry, unbleached paper towel. Using a dry, lint-free wipe, clear the water and mucus from the frog's chest.Then find the sternum in the center of the frog's chest with fingers, and using the non-dominant hand, hold the skin taught. Position the assembled tattoo gun vertically relative to the working surface and dip the needle into the ink. Keeping the gun vertical, press the needle tip onto the frog's skin, followed by the foot pedal.Draw lines onto the frog's skin while applying even pressure. If the needle gets stuck, clear excess ink or skin from the needle with a wipe. If necessary, clear excess ink on the frog's chest with frog-safe water and a wipe, and then wick away moisture with a dry wipe.Continue to ink the same area until dark, legible numbers persist after wiping away excess ink. Fill a tank with 10 to 15 liters of fresh frog-safe water and add a styrofoam island to provide a surface for the frog to wake up without drowning. Wet a paper towel with frog-safe water and place it flat on the styrofoam island.Next, lay the frog belly down on the towel facing the water. Fold half of the paper towel over the back half of the frog, and using cupped hands, wet its top portion. After 24 hours, when the tattoo is healed, return the frog to its long-term housing unit.Of the frogs tattooed, 100%had visible tattoos immediately after tattooing, 100%had them 24 hours after tattooing, and 91%had them four months after tattooing.