Agradecemos ao Centro de Medicina Comparada e Pesquisa do Dartmouth College por fornecer criação diária para os animais usados neste protocolo. Também agradecemos a Leah Jacob e Adwaita Bose por sua ajuda em testar o protocolo e fotografar animais. Por fim, agradecemos ao laboratório de Ann Miller pelo treinamento na prática da tatuagem. Este trabalho foi apoiado pela concessão R00 do NIH GM147826 a J.L.

Todos os procedimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Dartmouth College.
1. Configuração do equipamento
NOTA: Um fluxo de trabalho para o procedimento e um exemplo de configuração de bancada estão incluídos (Figura 1).
<ol><li>Conecte a pistola de tatuagem e o pedal à fonte de alimentação. Posicione o pedal embaixo da superfície de trabalho.</li>
	<li>Montando a pistola de tatuagem<ol><li>Usando uma chave Allen ou chave de fenda sextavada, solte os parafusos na empunhadura (Figura 2A, circulada em vermelho).</li>
		<li>Insira a ponta de plástico totalmente na alça. Aperte o parafuso para mantê-lo no lugar.</li>
		<li>Insira o tubo de metal na parte de trás da alça (Figura 2A). Isso será ajustado, então insira-o na metade do comprimento. Aperte o parafuso para mantê-lo no lugar.</li>
		<li>Insira uma agulha de tatuagem na parte de trás da empunhadura para que ela se encaixe confortavelmente na ponta de plástico na frente da empunhadura (Figura 2B).</li>
		<li>Deslize a parte de trás da agulha e do tubo de metal através do tubo clamp. Ajuste o tubo de metal para que a agulha se encaixe confortavelmente na ponta de plástico (Figura 2B). Aperte manualmente o tubo clamp até que o tubo não consiga se mover (Figura 2C).</li>
		<li>Remova o O-ring preto e prenda a agulha no braço do rotor; recoloque o O-ring para prender a agulha no lugar (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Defina a tensão na fonte de alimentação para que haja energia suficiente para perfurar a pele, mas não tão poderosa que seja difícil de controlar. Assim que a fonte de alimentação estiver conectada e conectada, pressione o pedal para certificar-se de que a máquina está funcionando. Tome cuidado para não apontar a agulha para você ou para outra pessoa. NOTA: A máquina de tatuagem usada neste protocolo funciona melhor entre 6,0 e 9,0 V, mas isso pode variar entre máquinas de tatuagem e fontes de tensão e deve ser determinado empiricamente.</li>
	<li>Encha a tampa de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL ou um pote de tinta de plástico fornecido com tinta de tatuagem preta até cerca de três quartos.</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Prepare a anestesia em um tanque grande o suficiente para submergir uma fêmea adulta de sapo X. laevis .<ol><li>Usando água própria para rãs (sem cloro), adicione tricaína à concentração final de 1,5 g/L e bicarbonato de sódio à concentração final de 3,5 g/L. Misture para dissolver. O pH desta solução é 7,15. CUIDADO: A tricaína é irritante.</li>
	</ol></li>
	<li>Mergulhe um sapo no tanque de anestesia. Certifique-se de que o sapo permaneça submerso na solução de tricaína até que seja anestesiado (7-8 min).<ol><li>Para verificar se o sapo está totalmente anestesiado, pegue-o, segure-o de cabeça para baixo e aperte-o com firmeza em um pé. Se o sapo não vacilar ou responder, ele pode ser tatuado.</li>
		<li>Se as rãs demorarem mais de 10 minutos para serem anestesiadas, prepare uma solução fresca de tricaína tamponada com bicarbonato de sódio. NOTA: As rãs não devem passar mais de 30 minutos em solução de tricaína15.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tatuagem
NOTA: Antes de tatuar um animal vivo, pode ser útil praticar em um pedaço de fruta com casca firme (como limão ou banana).
<ol><li>Prepare um tanque de recuperação para os sapos antes de tatuar. Encha um tanque com 10-15 L de água fresca segura para sapos e adicione uma ilha de isopor. Isso fornecerá uma superfície para o sapo acordar sem se afogar. NOTA: Uma ilha de isopor pode ser feita usando a tampa de um contêiner de transporte frio de isopor colocado dentro de um saco com zíper.</li>
	<li>Coloque o sapo anestesiado de costas sobre uma toalha de papel seca ou papel de bancada (Figura 3A). Use toalhas de papel cruas (marrons) para todos os trabalhos envolvendo sapos.</li>
	<li>Usando um pano seco sem fiapos, limpe a água e o muco do peito do sapo.</li>
	<li>Encontre o esterno no centro do peito do sapo com os dedos e, usando a mão não dominante, segure a pele esticada.</li>
	<li>Marcando o sapo<ol><li>Segure a pistola de tatuagem montada verticalmente em relação à superfície de trabalho e mergulhe a agulha na tinta (Figura 3B).</li>
		<li>Mantendo a pistola de tatuagem montada na vertical, pressione a ponta da agulha na pele do sapo antes de pressionar o pedal. Desenhe linhas na pele do sapo enquanto aplica pressão uniforme. NOTA: Algum sangramento ou vermelhidão menor é normal, assim como uma pequena descamação da pele.</li>
		<li>Se a agulha estiver presa na pele do sapo, limpe o excesso de tinta ou pele da agulha com um lenço. O excesso de tinta é normal durante a tatuagem.</li>
		<li>Se o peito do sapo estiver coberto de muita tinta para ver claramente a área que está sendo marcada ( Figura 3C ), limpe o excesso de tinta com água segura para sapos e um lenço umedecido ( Figura 3C '). Em seguida, absorva a umidade com um pano seco e continue pintando. NOTA: Uma garrafa squeeze de água segura para sapos pode ser preparada antes da tatuagem.</li>
		<li>Continue a pintar a mesma área até que os números escuros e legíveis permaneçam depois de limpar o excesso de tinta (Figura 3D). Em vez de desenhar toda a marcação ou número em um traço, faça repetidamente traços menores, especialmente para curvas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Recuperação
<ol><li>Molhe uma toalha de papel com água própria para sapos e coloque-a plana em cima da ilha de isopor (Figura 4A).</li>
	<li>Devolvendo sapos a tanques permanentes<ol><li>Deite o sapo de barriga para baixo na toalha de frente para a água (Figura 4B). Dobre metade da toalha de papel sobre a metade de trás do sapo e, usando as mãos em concha, molhe a parte superior do sapo. Uma vez que um sapo emerge da anestesia (cerca de 1 h após a tatuagem), ele entra na água de forma independente e nadará normalmente.</li>
		<li>Devolva os sapos ao alojamento de longo prazo após 24 horas, assim que a tatuagem estiver totalmente cicatrizada.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Limpeza e manutenção de equipamentos
<ol><li>Reutilização e autoclavagem de agulhas de tatuagem<ol><li>Enxágue as agulhas em 100% de isopropanol e água deionizada para soltar a tinta e esfregar a tinta restante que não se dissolveu.</li>
		<li>Após esfregar, coloque as agulhas em um estojo de autoclavagem de metal ou envolva-as com papel alumínio e autoclave por 30 min em ciclo seco.</li>
	</ol></li>
	<li>Se houver tinta em pedaços da máquina de tatuagem ou outro equipamento, limpe-o com etanol 100% e uma toalha de papel.</li>
	<li>A solução anestésica tem uma concentração final de tricaína de aproximadamente 0,5%. Descarte isso de acordo com as diretrizes institucionais de gerenciamento de resíduos perigosos.</li>
	<li>Armazenamento e manutenção de equipamentos<ol><li>Se possível, guarde a máquina de tatuagem em uma sala seca. O excesso de umidade danificará os componentes elétricos e reduzirá a longevidade da máquina.</li>
		<li>Para manter a máquina de tatuagem em boas condições de funcionamento, verifique o rolamento do rotor (Figura 2C) para certificar-se de que não se soltou devido às vibrações22. Isso pode ser apertado com uma chave Allen ou chave de fenda sextavada.</li>
		<li>Cerca de uma vez por mês, lubrifique o rolamento no braço do rotor usando uma graxa lubrificante espessa22.</li>
		<li>Em algumas máquinas de tatuagem, o braço do rotor pode ficar preso e não vibrar. Para corrigir isso, gire o braço do rotor ou comprima a mola para que a agulha fique na posição abaixada (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Otimizando a marcação de anfíbios: um guia para tatuar Xenopus

<ol>
	<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+and+humane+experimental+technique:+Implementing+change.">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals (Basel). 9 (10), 754 (2019).</li><li>Elkan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pregnancy+test.">The Xenopus pregnancy test.</a> British Med J. 2, 1253-1256 (1938).</li><li>Vize, P. D., Zorn, A. 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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Tatuar humanos é uma forma de arte que remonta a milhares de anos e, desde que os humanos se tatuam, eles também tatuam ou marcam animais23. O equipamento e as técnicas para marcar animais, particularmente mamíferos, estão bem estabelecidos, bem documentados e amplamente acessíveis. Embora a marcação de animais fosse originalmente para distinguir o gado e os impedimentos de roubo23, seu papel na pesquisa biomédica tornou-se igualmente importante.
<p class="jove...

Os modelos animais são ferramentas úteis para investigar questões relativas à saúde humana. Na prática, a pesquisa biomédica usando modelos animais requer organização e manutenção cuidadosas de uma colônia animal saudável. As melhores práticas para o manejo e criação éticos de animais visam reduzir o número de animais necessários para experimentação e refinar as práticas para garantir o bem-estar animal1. O gênero de rãs com garras, incluindo Xenopus laevis (X. laevis; Sapo africano com garras) e Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Sapo com garras ocidentais), têm sido usados em pesquisas biomédicas desde a década de 1930, quando X. laevis foi usado por médicos sul-africanos para realizar os primeiros testes de gravidez2. Embora os testes de gravidez modernos não exijam mais sapos, o papel da pesquisa de Xenopus persiste. As vantagens de usar Xenopus para pesquisa biomédica incluem seus genomas bem anotados3, ovulação induzível durante todo o ano de grandes ninhadas de ovos4 e ovos colocados externamente passíveis de fertilização in vitro. Essas características os tornam um recurso útil para a embriologia e desenvolvimento de vertebrados 5,6,7, biologia molecular e celular básica 7,8,9,10 e para modelar doenças humanas 7,11,12,13.
Métodos confiáveis para rastrear animais individuais de Xenopus são essenciais para registrar réplicas biológicas e melhorar o rigor e a reprodutibilidade na pesquisa. Como os Xenopus são frequentemente alojados em grupos, a marcação de animais permite que os pesquisadores rastreiem facilmente animais individuais4. Manter um registro preciso dos animais pode economizar tempo e recursos e melhorar a capacidade de rastrear a saúde dos animais. Por exemplo, a identificação individual de animais pode melhorar os fluxos de trabalho da organização para a geração de linhagens transgênicas de Xenopus , pois isso requer várias gerações de rãs com genótipos específicos verificados pelo sequenciamento14, o que requer organização e identificação individual dos animais. Isso é particularmente verdadeiro quando essas mutações carecem de fenótipos adultos facilmente discerníveis. Da mesma forma, o uso de oócitos e embriões de Xenopus para estudar biologia celular e de desenvolvimento básica se beneficia do rastreamento de animais individuais. Após a indução da ovulação, os animais precisam descansar por um período mínimo de 3 meses para evitar complicações de saúde, como a síndrome da hiperovulação15. Os métodos de identificação individual garantem que os animais não sejam induzidos a ovular com muita frequência.
A marcação e o rastreamento de animais também permitem que o pessoal do laboratório rastreie as preocupações com a saúde dos animais. Animais do mesmo genótipo adoecendo podem indicar endogamia excessiva ou problemas de saúde imprevistos associados ao transgene. Da mesma forma, animais adoecendo após ovulação recente podem indicar problemas com reagentes, materiais ou técnicas. O rastreamento de animais e sua saúde permite que o pessoal do laboratório e os veterinários acompanhem quando as preocupações ressurgirem e tomem medidas preventivas para prevenir doenças futuras. Nos mamíferos, existem vários métodos de identificação. Os métodos permanentes para camundongos incluem perfuração de orelhas, marcas de orelha, tatuagem e microchips subcutâneos16. Eles podem diferenciar de forma clara e confiável os animais dentro de uma colônia ou gaiola e podem ser facilmente administrados pelo pessoal do laboratório. Métodos como perfurar a orelha são minimamente invasivos, requerem apenas um equipamento especializado e funcionam para animais da maioria das idades. Embora esses sistemas sejam diretos e úteis para camundongos, seu uso em sapos apresenta um conjunto único de desafios. Rãs e outros anfíbios não possuem um pavilhão auricular (estrutura da orelha externa). Alguns pesquisadores colocaram etiquetas na mandíbula, dedo do pé ou membro posterior do animal17,18. Essa abordagem resultou em vários problemas: as marcas da mandíbula causaram irritação e as rãs agitadas tentaram arrancar as marcas com os membros anteriores17. As marcas dos dedos perfuravam a teia entre os dedos, prejudicando o movimento e trazendo o risco de se perder. Como tal, os anfíbios requerem seus próprios métodos de identificação. Historicamente, o corte do dedo do pé também tem sido usado para marcar anfíbios17,19. O dedo do pé é cortado com uma tesoura afiada, e o animal pode ser identificado pelo comprimento dos dedos das patas dianteiras e traseiras ou pelo ângulo em que o dedo do pé voltou a crescer (em salamandras). No entanto, esse método apresenta a preocupação ética de que a tosquia do dedo do pé possa prejudicar o movimento do animal17. Além disso, isso pode causar sangramento e introduzir risco de infecção. Outro sistema de marcação estabelecido são os autoenxertos de pele, nos quais a pele é retirada de uma parte do sapo e cirurgicamente fixada a outra parte. Por exemplo, é descrito um método para marcar as costas ou o ombro de um sapo usando um enxerto de pele de cor clara de seu peito20. Os enxertos de pele também apresentam limitações e riscos: o procedimento é invasivo e apresenta o risco de infecção por Aeromonas hydrophila, ou perna vermelha, uma doença potencialmente fatal; a cicatrização completa do autoenxerto leva até 6 semanas; E com os métodos descritos, apenas 6 rãs podem ser alojadas juntas por causa de lugares limitados para colocar um autoenxerto20.
Abordagens de marcação menos invasivas incluem contas de vidro e chips de transponder17,19. No método de contas de vidro, as contas de vidro são enfiadas em uma pequena sutura e costuradas na pele do sapo. Isso fornece maior variabilidade do que os autoenxertos de pele, com pelo menos 60 combinações de cores distintas. Existe, no entanto, o risco de que a sutura possa sair e resultar na perda das contas. Alternativamente, um transponder de microchip pode ser implantado sob a pele no saco linfático dorsal do sapo. Este é considerado o método de marcação mais permanente e permite que um número potencialmente infinito de animais seja identificado e catalogado individualmente. No entanto, este também é o método mais caro, pois microchips individuais são caros e uma grande colônia seria cara para marcar. Os microchips também requerem um scanner especial para ler19. Uma abordagem comum para a identificação de Xenopus é referir-se à coloração e padronização naturais dos animais. Isso funciona especialmente bem para sapos como X. laevis, que têm padrões distintos que permanecem durante a idade adulta. No entanto, esses padrões podem mudar com o tempo com o estresse, e a coloração pode parecer diferente quando os sapos são movidos entre recipientes transparentes e coloridos15. Além disso, esse método de identificação é menos útil para X. tropicalis, que possui padrões de marcação menos distintos em comparação com X. laevis, ou para animais albinos, que não apresentam marcações de cor21. Mesmo para espécies com marcações distintas, o pessoal do laboratório pode interpretar a colocação e o tamanho das marcações de maneira diferente, o que pode causar erros na identificação. Por isso, fotografar animais é mais confiável em conjunto com um método de identificação adicional. Portanto, buscamos marcar e identificar animais Xenopus usando uma técnica que seja facilmente discernível, permanente e minimamente invasiva.
Existem recursos publicados limitados que descrevem métodos para tatuar anfíbios. A tatuagem foi descrita ao lado de outras técnicas de branding, incluindo marcas de calor, marcas de nitrato de prata e marcas de congelamento17. No mesmo recurso, a tatuagem foi feita desenhando numerais com uma agulha hipodérmica 27G, e o processo foi observado para não causar infecção, ao contrário das outras técnicas de marcação, que usavam um fio em forma de numeral ou outra marca. Em outra fonte, uma máquina de tatuagem elétrica (descrita como agulha vibratória) foi usada para marcar sapos, mas poucos detalhes foram fornecidos sobre a técnica 17,19. Os autores alertam que, ao perturbar a camada protetora de lodo do sapo, esse procedimento aumenta o risco de perna vermelha. Embora não exista um método de marcação ou identificação que seja completamente não invasivo (como fotografias) e permanente (como microchips), a tatuagem fornece um compromisso eficaz. A tatuagem é relativamente simples em comparação com outras técnicas, como autoenxertos de pele. Os benefícios adicionais incluem uma curva de aprendizado menor e equipamentos relativamente baratos. Tatuar anfíbios aquáticos traz certos desafios, que podem intimidar os pesquisadores e prejudicar a marcação bem-sucedida dos animais. Este artigo tem como objetivo fornecer aos pesquisadores métodos bem documentados para tatuar Xenopus adulto com uma máquina de tatuagem rotativa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1203RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 Needle Round Disposable ULTRA</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>HTIPRS5-U</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1205RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1207RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Cord</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkpots</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, delicate task wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCA Connection</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scream Ink Pitch Black, 1oz</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>SI101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grips</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>STEALTH2-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam island</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the lid of a styrofoam cold shipping container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>CAUTION: IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unbleached paper towels</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2U229</td>
			<td>Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage Supply</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle (with frog-safe water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0340923T</td>
			<td>Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X. laevis adult female</td>
			<td>Xenopus1</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip-top plastic bag</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This bag should be large enough to hold the styrofoam island</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for tattooing xenopus laevis with a rotary tattoo machine

Os modelos animais expandem o escopo da pesquisa biomédica, aprofundando nossa compreensão da biologia do desenvolvimento, molecular e celular e permitindo que os pesquisadores modelem doenças humanas. Registrar e rastrear animais individuais permite que os pesquisadores reduzam o número de animais necessários para o estudo e refinem as práticas para melhorar o bem-estar animal. Existem vários métodos bem documentados para marcar e rastrear mamíferos, incluindo socos e marcas de orelha. No entanto, os métodos de marcação de espécies de anfíbios aquáticos são limitados, sendo os recursos existentes desatualizados, ineficazes ou proibitivamente dispendiosos. Neste manuscrito, descrevemos métodos e melhores práticas para marcar Xenopus laevis com uma máquina de tatuagem rotativa. A tatuagem adequada resulta em tatuagens de alta qualidade, tornando os indivíduos facilmente distinguíveis para os pesquisadores e representando um risco mínimo para a saúde dos animais. Também destacamos as causas de tatuagens de baixa qualidade, que podem resultar em tatuagens que desbotam rapidamente e causam danos desnecessários aos animais. Essa abordagem permite que pesquisadores e veterinários marquem anfíbios, permitindo que eles rastreiem réplicas biológicas e linhagens transgênicas e mantenham registros precisos da saúde animal.

Tatuagens de alta qualidade terão traços escuros e legíveis no peito do sapo e podem ser claramente diferenciadas a vários metros de distância (Figura 5A). Em geral, números e marcações maiores são melhores para legibilidade, mas nomes e números mais longos podem ser reduzidos para caber confortavelmente no peito do sapo. A longevidade da tatuagem é mais difícil de julgar, mas as tatuagens de sapo de alta qualidade devem permanecer escuras e legíveis por pelo menos 3-6 meses (<s...

Autor em destaque: Refinando técnicas de marcação de Xenopus laevis para estudos biomédicos

Aqui, descrevemos métodos para tatuar Xenopus laevis adulto (sapo africano com garras) com uma máquina de tatuagem rotativa. A tatuagem adequada resulta em numerais escuros e facilmente legíveis que duram vários meses e tornam os animais facilmente distinguíveis para fins de pesquisa e manutenção de registros.

Métodos para tatuar Xenopus laevis com uma máquina de tatuagem rotativa

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling ...

methods-for-tattooing-xenopus-laevis-with-a-rotary-tattoo-machine

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine

548 visualizações.  Dartmouth College. Nossa pesquisa está focada em investigar a organização do córtex celular usando extratos de ovos de Xenopus e bicamadas lipídicas suportadas. Estamos tentando entender como os padrões dinâmicos do citoesqueleto são regulados no córtex e como esses padrões suportam funções celulares básicas, como a divisão celular. Este protocolo descreve um método eficaz e seguro para marcar Xenopus laevis.Essa abordagem permite que os pesquisadores rast...

Vídeo: Autor em destaque: Refinando técnicas de marcação de Xenopus laevis para estudos biomédicos

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Incorporação de plástico e secção de embriões Xenopus laevis

Biologia

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

Obtenção de ovos de Xenopus laevis fêmeas

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, ...

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparação e fracionamento de Xenopus laevis Egg Extractos

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjeção de Oócitos Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Transplantes faciais em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Os embriões

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

Dissecção<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Crista neural para<em&gt; In vitro</em&gt; Cultura Explant ou<em&gt; In vivo</em&gt; Transplante

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

Usando plusTipTracker software para medir Microtubule Dynamics em<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cones de Crescimento

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...