אנו מודים למרכז לרפואה השוואתית ומחקר של דארטמות' קולג' על מתן גידול יומי לבעלי החיים המשמשים בפרוטוקול זה. אנו מודים גם ללאה יעקב ולאדוויטה בוס על עזרתן בבדיקת הפרוטוקול ובצילום בעלי חיים. לבסוף, אנו מודים למעבדה של אן מילר על ההכשרה בפרקטיקה של קעקוע. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R00 GM147826 של NIH לג'.ל.

כל הנהלים המתוארים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של דארטמות' קולג '.
1. הגדרת ציוד
הערה: זרימת עבודה עבור ההליך והגדרת ספסל לדוגמה כלולות (איור 1).
<ol><li>חבר את אקדח הקעקוע ואת דוושת הרגל לספק הכוח. מקם את דוושת הרגל מתחת למשטח העבודה.</li>
	<li>הרכבת אקדח הקעקועים<ol><li>בעזרת מפתח אלן או מברג משושה, שחררו את הברגים שבידית האחיזה (איור 2A, מוקף באדום).</li>
		<li>הכנס את קצה הפלסטיק עד לידית האחיזה. הדקו את הבורג כדי להחזיק אותו במקומו.</li>
		<li>הכניסו את צינור המתכת לחלק האחורי של ידית האחיזה (איור 2A). זה יותאם, אז להכניס אותו למחצית אורכו. הדקו את הבורג כדי להחזיק אותו במקומו.</li>
		<li>הכניסו מחט קעקוע דרך החלק האחורי של ידית האחיזה כך שהיא תשב בנוחות בקצה הפלסטיק שבקדמת ידית האחיזה (איור 2B).</li>
		<li>החלק את גב המחט וצינור המתכת דרך מהדק הצינור. התאימו את צינור המתכת כך שהמחט תתאים בנוחות לקצה הפלסטיק (איור 2B). הדקו ידנית את מהדק הצינור עד שהצינור לא יוכל לזוז (איור 2C).</li>
		<li>הסר את טבעת O השחורה וחבר את המחט לזרוע הרוטור; החליפו את טבעת ה-O כדי לאבטח את המחט למקומה (איור 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>הגדר את המתח על ספק הכוח כך שיש מספיק כוח כדי לחדור את העור אבל לא כל כך חזק כי קשה לשלוט. לאחר חיבור ספק הכוח לחשמל, לחץ על דוושת הרגל כדי לוודא שההתקן פועל. היזהר לא לכוון את המחט על עצמך או על אנשי צוות אחרים. הערה: מכונת הקעקוע המשמשת בפרוטוקול זה פועלת בצורה הטובה ביותר בין 6.0 ל- 9.0 וולט, אך הדבר עשוי להשתנות בין מכונות קעקוע לספקי מתח ויש לקבוע זאת אמפירית.</li>
	<li>מלאו את המכסה של צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל או סיר דיו מפלסטיק שסופק בדיו קעקוע שחור עד כשלושת רבעי הפקק המלא.</li>
</ol>2. הרדמה
<ol><li>הכינו את חומר ההרדמה במיכל גדול מספיק כדי להטביע נקבה בוגרת אחת של צפרדע X. laevis .<ol><li>בעזרת מים בטוחים לצפרדעים (ללא כלור), מוסיפים טריקאין לריכוז הסופי של 1.5 גרם/ליטר וסודיום ביקרבונט לריכוז הסופי של 3.5 גרם/ליטר. מערבבים להתמוססות. ה- pH של פתרון זה הוא 7.15. אזהרה: טריקאין הוא חומר מגרה.</li>
	</ol></li>
	<li>יש לטבול צפרדע אחת במיכל ההרדמה. ודאו שהצפרדע נשארת שקועה בתמיסת הטריקאין עד שהיא מורדמת (7-8 דקות).<ol><li>כדי לבדוק אם הצפרדע מורדמת לחלוטין, הרימו אותה, החזיקו אותה הפוכה ולחצו אותה היטב על רגל אחת. אם הצפרדע אינה נרתעת או מגיבה, ניתן לקעקע אותה.</li>
		<li>אם לצפרדעים לוקח באופן עקבי יותר מ-10 דקות להיות מורדמות, הכינו תמיסת טריקאין טריקאין טרייה עם סודיום ביקרבונט. הערה: צפרדעים לא צריכות לבלות יותר מ -30 דקות בתמיסת טריקאין15.</li>
	</ol></li>
</ol>3. קעקוע
הערה: לפני קעקוע חיה חיה, זה יכול להיות שימושי להתאמן על חתיכת פרי עם קליפה מוצקה (כגון לימון או בננה).
<ol><li>הכינו מיכל התאוששות לצפרדעים לפני הקעקוע. ממלאים מיכל ב-10-15 ליטר מים טריים בטוחים לצפרדעים ומוסיפים אי קלקר. זה יספק משטח לצפרדע להתעורר מבלי לטבוע. הערה: ניתן להכין אי קלקר באמצעות מכסה של מיכל קלקר קר המונח בתוך שקית רוכסן.</li>
	<li>הניחו את הצפרדע המורדמת על גבה על מגבת נייר יבשה או נייר ספסל (איור 3A). השתמשו במגבות נייר לא מולבנות (חומות) לכל עבודה המערבת צפרדעים.</li>
	<li>בעזרת מגבון יבש ללא מוך, נגבו את המים והריר מחזה הצפרדע.</li>
	<li>מצאו את עצם החזה במרכז החזה של הצפרדע בעזרת אצבעות, ובעזרת היד הלא דומיננטית החזיקו את העור מתוח.</li>
	<li>סימון הצפרדע<ol><li>החזיקו את אקדח הקעקועים שהורכב במאונך ביחס למשטח העבודה וטבלו את המחט בדיו (איור 3B).</li>
		<li>שמירה על אקדח הקעקועים המורכב אנכי, לחץ על קצה המחט על עור הצפרדע לפני לחיצה על דוושת הרגל. ציירו קווים על עור הצפרדע תוך הפעלת לחץ אחיד. הערה: דימום קל או אדמומיות הם נורמליים, כמו גם החלקת עור קלה.</li>
		<li>אם המחט נתפסת על עור הצפרדע, נקו עודפי דיו או עור מהמחט בעזרת מגבון. עודף דיו הוא נורמלי במהלך קעקוע.</li>
		<li>אם החזה של הצפרדע מכוסה ביותר מדי דיו מכדי לראות בבירור את האזור המסומן (איור 3C), יש לנקות את עודפי הדיו בעזרת מים בטוחים לצפרדעים ומגבון (איור 3C). לאחר מכן, פתילו לחות עם מגבון יבש והמשיכו לסמן בדיו. הערה: ניתן להכין בקבוק לחיץ של מים בטוחים לצפרדעים לפני הקעקוע.</li>
		<li>המשיכו להשתמש בדיו באותו אזור עד שיישארו מספרים כהים וקריאים לאחר מחיקת עודפי דיו (איור 3D). במקום לצייר את כל הסימון או המספר בקו אחד, בצעו שוב ושוב קווים קטנים יותר, במיוחד בעקומות.</li>
	</ol></li>
</ol>4. התאוששות
<ol><li>הרטיבו מגבת נייר במים בטוחים לצפרדעים והניחו אותה שטוחה על גבי אי הקלקר (איור 4A).</li>
	<li>החזרת צפרדעים לטנקים עומדים<ol><li>הניחו את בטן הצפרדע על המגבת הפונה למים (איור 4B). מקפלים חצי ממגבת הנייר על החצי האחורי של הצפרדע ובעזרת ידיים קפוצות מרטיבים את החלק העליון של הצפרדע. ברגע שצפרדע יוצאת מההרדמה (כשעה לאחר הקעקוע), היא תיכנס למים באופן עצמאי ותשחה כרגיל.</li>
		<li>להחזיר צפרדעים לדיור לטווח ארוך לאחר 24 שעות, לאחר הקעקוע נרפא לחלוטין.</li>
	</ol></li>
</ol>5. ניקיון ותחזוקת ציוד
<ol><li>שימוש חוזר ואוטוקלאבינג של מחטי קעקוע<ol><li>יש לשטוף מחטים ב-100% איזופרופנול ומים שעברו דה-יוניזציה כדי לשחרר את הדיו ולקרצף את שאריות הדיו שלא התמוססו.</li>
		<li>לאחר הקרצוף, הניחו את המחטים בתוך מארז מתכת או עטפו אותן ברדיד אלומיניום ואוטוקלאבה למשך 30 דקות במחזור יבש.</li>
	</ol></li>
	<li>אם יש דיו על חתיכות של מכונת הקעקוע או ציוד אחר, לנגב אותו עם 100% אתנול ומגבת נייר.</li>
	<li>בתמיסת ההרדמה ריכוז הטריקאין הסופי הוא כ-0.5%. יש להשליך זאת בהתאם להנחיות מוסדיות לטיפול בפסולת מסוכנת.</li>
	<li>אחסון ותחזוקה של ציוד<ol><li>במידת האפשר, אחסנו את מכונת הקעקועים בחדר יבש. עודף לחות יפגע ברכיבים החשמליים ויפחית את תוחלת החיים של המכונה.</li>
		<li>כדי לשמור על תקינות מכונת הקעקועים, בדקו את המסב על הרוטור (איור 2C) כדי לוודא שהוא לא השתחרר מתנודות22. ניתן להדק זאת באמצעות מפתח אלן או מברג משושה.</li>
		<li>בערך פעם בחודש, לשמן את המסב על זרוע הרוטור באמצעות שומן סיכה סמיך22.</li>
		<li>בחלק ממכונות הקעקוע, זרוע הרוטור יכולה להיתקע ולא תרטוט. כדי לתקן זאת, סובבו את זרוע הרוטור או דחסו את הקפיץ כך שהמחט תהיה במצב מונמך (איור 2C).</li>
	</ol></li>
</ol>

אופטימיזציה של סימון דו-חיים: מדריך לקעקוע קסנופוס

<ol>
	<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+and+humane+experimental+technique:+Implementing+change.">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals (Basel). 9 (10), 754 (2019).</li><li>Elkan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+pregnancy+test.">The Xenopus pregnancy test.</a> British Med J. 2, 1253-1256 (1938).</li><li>Vize, P. D., Zorn, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+genomic+data+and+browser+resources.">Xenopus genomic data and browser resources.</a> Dev Biol. 426 (2), 194-199 (2017).</li><li>Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Xenopus: A Laboratory Manual. , (2023).</li><li>Borodinsky, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+as+a+model+organism+for+the+study+of+spinal+cord+formation,+development,+function+and+regeneration.">Xenopus laevis as a model organism for the study of spinal cord formation, development, function and regeneration.</a> Front Neural Circuits. 11, 90 (2017).</li><li>Hoppler, S., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus:+Experimental+access+to+cardiovascular+development,+regeneration+discovery,+and+cardiovascular+heart-defect+modeling.">Xenopus: Experimental access to cardiovascular development, regeneration discovery, and cardiovascular heart-defect modeling.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (6), a037200 (2020).</li><li>Fisher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenbase:+key+features+and+resources+of+the+Xenopus+model+organism+knowledgebase.">Xenbase: key features and resources of the Xenopus model organism knowledgebase.</a> Genetics. 224 (1), iyad018 (2023).</li><li>Slater, P. G., Hayrapetian, L., Lowery, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+laevis+as+a+model+system+to+study+cytoskeletal+dynamics+during+axon+pathfinding.">Xenopus laevis as a model system to study cytoskeletal dynamics during axon pathfinding.</a> Genesis. 55 (1-2), (2017).</li><li>Bermudez, J. G., Chen, H., Einstein, L. C., Good, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+biology+of+cell+boundary+conditions+through+confinement+of+Xenopus+cell-free+cytoplasmic+extracts.">Probing the biology of cell boundary conditions through confinement of Xenopus cell-free cytoplasmic extracts.</a> Genesis. 55 (1-2), (2017).</li><li>Stooke-Vaughan, G. A., Davidson, L. A., Woolner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+as+a+model+for+studies+in+mechanical+stress+and+cell+division.">Xenopus as a model for studies in mechanical stress and cell division.</a> Genesis. 55 (1-2), (2017).</li><li>Blackburn, A. T. M., Miller, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+congenital+kidney+diseases+in+Xenopus+laevis.">Modeling congenital kidney diseases in Xenopus laevis.</a> Dis Model Mech. 12 (4), dmm038604 (2019).</li><li>Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+toolkit+in+Xenopus:+Approaches+and+opportunities+for+human+disease+modeling.">Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling.</a> Dev Biol. 426 (2), 325-335 (2017).</li><li>Wheeler, G. N., Br&#228;ndli, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+vertebrate+models+for+chemical+genetics+and+drug+discovery+screens:+Lessons+from+zebrafish+and+Xenopus.">Simple vertebrate models for chemical genetics and drug discovery screens: Lessons from zebrafish and Xenopus.</a> Dev Dyn. 236 (6), 1287-1308 (2009).</li><li>Carron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origin+of+Hox13-dependent+skin+appendages+in+amphibians.">Evolutionary origin of Hox13-dependent skin appendages in amphibians.</a> Nat Commun. 15 (1), 2328 (2024).</li><li>Schultz, T. W., Dawson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Housing+and+husbandry+of+Xenopus+for+oocyte+production.">Housing and husbandry of Xenopus for oocyte production.</a> Lab Animal. 32 (2), 34-39 (2003).</li><li>Cadillac, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Animal identification systems used for mice. , (2006).</li><li>Donnelly, M. A., Guyer, C., Juterbock, J. E., Alford, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+marking+amphibians.">Techniques for marking amphibians.</a> Meas Monitor Biol Div: Std Meth Amphibians. , 277-284 (1994).</li><li>Hutchens, S. J., Deperno, C. S., Matthews, C. E., Pollock, K. H., Woodward, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visible+implant+fluorescent+marker:+A+reliable+marking+alternative+for+snakes.">Visible implant fluorescent marker: A reliable marking alternative for snakes.</a> Herpetol Rev. 39 (3), 301-303 (2008).</li><li>Hoogstraten-Miller, S., Dunham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+identification+methods+for+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Practical identification methods for African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> Lab Animal. 26 (7), 36-38 (1997).</li><li>Loopstra, J. A., Zwart, P., Verhoeff-de Fremery, R., Vervoordeldonk, F. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marking+of+African+clawed+toads+(Xenopus+laevis).+Improvement+of+a+skin+autograft+technique.">Marking of African clawed toads (Xenopus laevis). Improvement of a skin autograft technique.</a> New Dev Biosci: Their Implicat Lab Animal Sci. , 311-316 (1988).</li><li>R&#246;del, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis.">Xenopus tropicalis.</a> AmphibiaWeb. , (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worldwide+Tattoo+Supply.">Worldwide Tattoo Supply.</a> Stealth 2 Rotary Tattoo Machine Intro &amp; Maintenance. , (2015).</li><li>Khan, S. U., Mufti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hot+history+and+cold+future+of+brands.">The hot history and cold future of brands.</a> J Manager Sci. 1 (1), 75-84 (2007).</li><li>Catlett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> All About Lip Tattoo: what to Expect, Cost, Risks, Touch-ups &amp; More. , (2019).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

קעקוע בני אדם הוא צורת אמנות בת אלפי שנים, וכל עוד בני האדם קעקעו את עצמם, הם גם קעקעו או מיתגו בעלי חיים23 . הציוד והטכניקות לסימון בעלי חיים, בעיקר יונקים, מבוססים היטב, מתועדים היטב ונגישים באופן נרחב. בעוד שסימון בעלי חיים נועד במקור להבדיל בין הרתעת בעלי חיים וגניבות<sup class="xref...

מודלים של בעלי חיים הם כלים שימושיים לחקר שאלות הנוגעות לבריאות האדם. בפועל, מחקר ביו-רפואי באמצעות מודלים של בעלי חיים דורש ארגון ותחזוקה קפדניים של מושבת בעלי חיים בריאה. שיטות עבודה מומלצות לטיפול אתי בבעלי חיים ולגידול שואפות להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים לניסויים ולחדד שיטות עבודה כדי להבטיח רווחת בעלי חיים1. סוג צפרדע בעל טפרים, כולל Xenopus laevis (X. laevis; צפרדע אפריקאית בעלת טפרים) ו-Xenopus tropicalis (X. tropicalis; צפרדע בעלת טפרים מערביים), שימשו במחקר ביו-רפואי מאז שנות ה-30 של המאה ה-20, כאשר רופאים דרום אפריקאים השתמשו ב-X. laevis לביצוע בדיקות ההריון הראשונות2. בעוד בדיקות הריון מודרניות כבר לא דורשות צפרדעים, התפקיד של מחקר Xenopus נמשך. יתרונות השימוש בקסנופוס למחקר ביו-רפואי כוללים את הגנום המבואר היטבשלהם 3, ביוץ המושרה לאורך כל השנה של ביציםגדולות 4, וביציות המוטלות חיצונית הניתנות להפריה חוץ גופית. תכונות אלה הופכות אותם לנכס שימושי לאמבריולוגיה ופיתוח של בעלי חוליות 5,6,7, ביולוגיה מולקולרית ותאית בסיסית 7,8,9,10, ולמידול מחלות אנושיות 7,11,12,13.
שיטות אמינות למעקב אחר בעלי חיים בודדים של קסנופוס חיוניות לרישום שכפולים ביולוגיים ולשיפור הקפדנות והרבייה במחקר. מכיוון שקסנופוס שוכנים לעתים קרובות בקבוצות, סימון בעלי חיים מאפשר לחוקרים לעקוב בקלות אחר בעלי חיים בודדים4. שמירה על תיעוד מדויק של בעלי חיים יכולה לחסוך זמן ומשאבים ולשפר את היכולת לעקוב אחר בריאותם של בעלי חיים. לדוגמה, זיהוי פרטני של בעלי חיים יכול לשפר את תהליכי העבודה הארגוניים ליצירת קווי קסנופוס טרנסגניים, מכיוון שהדבר דורש דורות מרובים של צפרדעים עם גנוטיפים ספציפיים שאומתו על ידי ריצוף14, הדורש ארגון וזיהוי פרטני של בעלי חיים. זה נכון במיוחד כאשר מוטציות אלה חסרות פנוטיפים בוגרים שניתן להבחין בהם בקלות. באופן דומה, השימוש בביציות ובעוברים של Xenopus לחקר ביולוגיה תאית והתפתחותית בסיסית מועיל ממעקב אחר בעלי חיים בודדים. לאחר גרימת ביוץ, בעלי חיים צריכים לנוח לפחות 3 חודשים כדי למנוע סיבוכים בריאותיים כגון תסמונת ביוץ יתר15. שיטות זיהוי אינדיבידואליות מבטיחות כי בעלי חיים אינם מושרים לבייץ בתדירות גבוהה מדי.
סימון ומעקב אחר בעלי חיים גם מאפשר לאנשי המעבדה לעקוב אחר בעיות בריאותיות של בעלי חיים. בעלי חיים מאותו גנוטיפ חולים יכולים להצביע על רבייה מוגזמת או על חששות בריאותיים בלתי צפויים הקשורים לטרנסגן. באופן דומה, בעלי חיים שחולים לאחר הביוץ האחרון יכולים להצביע על בעיות עם ריאגנטים, חומרים או טכניקות. מעקב אחר בעלי חיים ובריאותם מאפשר לאנשי מעבדה ווטרינרים לעקוב כאשר חששות עולים מחדש ולנקוט באמצעי מניעה למניעת מחלות עתידיות. ביונקים, ישנן שיטות זיהוי רבות. שיטות קבועות לעכברים כוללות ניקוב אוזניים, תגי אוזניים, קעקוע ושבבים תת עוריים16. אלה יכולים להבדיל באופן ברור ואמין בין בעלי חיים בתוך מושבה או כלוב ויכולים להיות מנוהלים בקלות על ידי אנשי מעבדה. שיטות כגון ניקוב אוזניים הן זעיר פולשניות, דורשות רק פריט אחד של ציוד מיוחד, ועובדות עבור בעלי חיים ברוב הגילאים. בעוד שמערכות אלה פשוטות ושימושיות עבור עכברים, השימוש בהן בצפרדעים מציב מערך ייחודי של אתגרים. לצפרדעים ולדו-חיים אחרים אין פינה (מבנה אוזן חיצוני). כמה חוקרים הצמידו תגים ללסת, לבוהן או לגפה האחורית של החיה 17,18. גישה זו גרמה לבעיות שונות: תגי לסת גרמו לגירוי, וצפרדעים נסערות ניסו למשוך תגים עם הגפיים הקדמיות שלהם17. תגי הבוהן פילחו את הרשת בין אצבעות הרגליים, פגעו בתנועה ונשאו את הסיכון ללכת לאיבוד. ככאלה, דו-חיים זקוקים לשיטות זיהוי משלהם. מבחינה היסטורית, גזיזת אצבעות שימשה גם לסימון דו-חיים17,19. הבוהן נחתכת בזוג מספריים חדים, וניתן לזהות את החיה לפי אורך הבהונות בכפות הרגליים הקדמיות והאחוריות או לפי הזווית שבה הבוהן גדלה לאחור (בסלמנדרות). עם זאת, שיטה זו מעוררת חשש אתי שגזיזת הבוהן עלולה לפגוע בתנועת החיה17 . בנוסף, זה יכול לגרום לדימום ולהציג סיכון של זיהום. מערכת סימון מבוססת נוספת היא השתלות עצמיות של העור, שבהן העור נלקח מחלק אחד של הצפרדע ומוצמד בניתוח לחלק אחר. לדוגמה, מתוארת שיטה לסימון גב או כתף של צפרדע באמצעות שתל עור בהיר מחזה20 שלה. השתלות עור מגיעות גם עם מגבלות וסיכונים: ההליך הוא פולשני ומציג את הסיכון של זיהום הידרופילה Aeromonas, או רגל אדומה, נגע שעלול להיות קטלני; ריפוי מלא של autograft לוקח עד 6 שבועות; ועם השיטות המתוארות, רק 6 צפרדעים ניתן לשכן יחד בגלל מקומות מוגבלים לשים autograft20.
גישות סימון פחות פולשניות כוללות חרוזי זכוכית ושבבי משדר17,19. בשיטת חרוזי הזכוכית, חרוזי זכוכית מושחלים על תפר קטן ותופרים לתוך עור הצפרדע. זה מספק שונות גדולה יותר מאשר השתלות עור, עם לפחות 60 שילובי צבעים ייחודיים. עם זאת, קיים סיכון שהתפר יכול לצאת ולגרום לאיבוד החרוזים. לחלופין, ניתן להשתיל משדר שבב מתחת לעור בשק הלימפה הגבי של הצפרדע. שיטה זו נחשבת לשיטת הסימון הקבועה ביותר ומאפשרת לזהות ולקטלג באופן אינדיבידואלי מספר אינסופי של בעלי חיים. עם זאת, זוהי גם השיטה היקרה ביותר, שכן שבבים בודדים הם יקרים, ומושבה גדולה תהיה יקרה לסמן. שבבים דורשים גם סורק מיוחד כדי לקרוא19. גישה נפוצה אחת לזיהוי קסנופוס היא התייחסות לצביעה ולדפוס הטבעיים של בעלי החיים. זה עובד טוב במיוחד עבור צפרדעים כגון X. laevis, אשר יש דפוסים ברורים שנשארים לאורך כל הבגרות. עם זאת, דפוסים אלה יכולים להשתנות עם הזמן עם מתח, והצביעה יכולה להיראות שונה כאשר צפרדעים מועברות בין מיכלים שקופים וכהים15. בנוסף, שיטת זיהוי זו שימושית פחות עבור X. tropicalis, שיש לו דפוסי סימון פחות ברורים בהשוואה ל-X. laevis, או עבור בעלי חיים לבקנים, שאין להם סימוני צבע21. אפילו עבור מינים עם סימונים ברורים, אנשי מעבדה יכולים לפרש את המיקום והגודל של הסימונים באופן שונה, מה שעלול לגרום לטעויות בזיהוי. מסיבה זו, צילום בעלי חיים הוא אמין ביותר בשילוב עם שיטת זיהוי נוספת. לכן, אנו מבקשים לסמן ולזהות בעלי חיים מסוג Xenopus באמצעות טכניקה קלה להבחנה, קבועה וזעיר פולשנית.
ישנם מקורות מוגבלים שפורסמו המתארים שיטות לקעקוע דו-חיים. קעקוע תואר לצד טכניקות מיתוג אחרות, כולל מותגי חום, מותגי כסף חנקתי ומותגי הקפאה17. באותו משאב, הקעקוע נעשה על ידי ציור ספרות עם מחט היפודרמית 27G, והתהליך צוין כלא גורם לזיהום, בניגוד לטכניקות מיתוג אחרות, שהשתמשו בחוט בצורת ספרה או סימן אחר. במקור אחר, מכונת קעקוע חשמלית (שתוארה כמחט רוטטת) שימשה לסימון צפרדעים, אך מעט פרטים נמסרו על הטכניקה17,19. המחברים מזהירים כי על ידי הפרעה לשכבת הרפש המגנה על הצפרדע, הליך זה מגביר את הסיכון לרגל אדומה. אמנם אין שיטת סימון או זיהוי שהיא גם לגמרי לא פולשנית (כמו צילומים) וגם קבועה (כמו שבבים), אבל קעקוע מספק פשרה יעילה. קעקוע הוא פשוט יחסית בהשוואה לטכניקות אחרות, כגון השתלות עור. יתרונות נוספים כוללים עקומת למידה קטנה יותר וציוד זול יחסית. קעקוע דו-חיים ימיים מגיע עם אתגרים מסוימים, אשר יכולים להפחיד חוקרים ולפגוע בסימון מוצלח של בעלי חיים. מאמר זה נועד לספק לחוקרים שיטות מתועדות היטב לקעקוע קסנופוס בוגר באמצעות מכונת קעקועים סיבובית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1203RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 Needle Round Disposable ULTRA</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>HTIPRS5-U</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1205RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1207RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Cord</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkpots</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, delicate task wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCA Connection</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scream Ink Pitch Black, 1oz</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>SI101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grips</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>STEALTH2-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam island</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the lid of a styrofoam cold shipping container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>CAUTION: IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unbleached paper towels</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2U229</td>
			<td>Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage Supply</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle (with frog-safe water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0340923T</td>
			<td>Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X. laevis adult female</td>
			<td>Xenopus1</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip-top plastic bag</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This bag should be large enough to hold the styrofoam island</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for tattooing xenopus laevis with a rotary tattoo machine

מודלים של בעלי חיים מרחיבים את היקף המחקר הביו-רפואי, מקדמים את הבנתנו בביולוגיה התפתחותית, מולקולרית ותאית ומאפשרים לחוקרים למדל מחלות אנושיות. תיעוד ומעקב אחר בעלי חיים בודדים מאפשרים לחוקרים להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים למחקר ולשכלל שיטות לשיפור רווחת בעלי החיים. קיימות מספר שיטות מתועדות היטב לסימון ומעקב אחר יונקים, כולל ניקוב אוזניים ותגי אוזניים. עם זאת, השיטות לסימון מיני דו-חיים ימיים מוגבלות, כאשר המשאבים הקיימים מיושנים, לא יעילים או יקרים מדי. בכתב יד זה, אנו מתארים שיטות ושיטות עבודה מומלצות לסימון Xenopus laevis באמצעות מכונת קעקועים סיבובית. קעקוע נכון מביא לקעקועים באיכות גבוהה, מה שהופך אנשים לניתנים להבחנה בקלות עבור חוקרים ומהווה סיכון מינימלי לבריאות בעלי החיים. אנו גם מדגישים את הגורמים לקעקועים באיכות ירודה, מה שעלול לגרום לקעקועים שדוהים במהירות ולגרום נזק מיותר לבעלי חיים. גישה זו מאפשרת לחוקרים ולווטרינרים לסמן דו-חיים, מה שמאפשר להם לעקוב אחר שכפולים ביולוגיים וקווים טרנסגניים ולשמור תיעוד מדויק של בריאות בעלי חיים.

Animal models are useful tools for investigating questions pertaining to human health. In practice, biomedical research using animal models requires careful organization and maintenance of a healthy animal colony. Best practices for ethical animal handling and husbandry aim to reduce the number of animals needed for experimentation and refine practices to ensure animal welfare1. The clawed frog genus, including Xenopus laevis (X. laevis; African clawed frog) and Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Western clawed frog), have been used in biomedical research since the 1930s when X. laevis were used by South African doctors to conduct the first pregnancy tests2. While modern pregnancy tests no longer require frogs, the role of Xenopus research persists. Advantages of using Xenopus for biomedical research include their well-annotated genomes3, year-round inducible ovulation of large clutches of eggs4, and externally laid eggs amenable to in vitro fertilization. These features make them a useful asset for vertebrate embryology and development5,6,7, basic molecular and cellular biology7,8,9,10, and for modeling human disease7,11,12,13.
Reliable methods for tracking individual Xenopus animals are essential for recording biological replicates and improving rigor and reproducibility in research. As Xenopus are frequently housed in groups, animal marking allows researchers to easily track individual animals4. Maintaining an accurate record of animals can save time and resources and improve the ability to track animals&#39; health. For example, individual identification of animals can improve organization workflows for generating transgenic Xenopus lines, as this requires multiple generations of frogs with specific genotypes verified by sequencing14, which requires organization and individual identification of animals. This is particularly true when these mutations lack easily discernible adult phenotypes. Similarly, the use of Xenopus oocytes and embryos to study basic cellular and developmental biology benefits from tracking individual animals. After inducing ovulation, animals need to rest for a minimum of 3 months to prevent health complications such as hyper-ovulation syndrome15. Individual identification methods ensure that animals are not induced to ovulate too frequently.
Marking and tracking animals also enables lab personnel to track animals&#39; health concerns. Animals of the same genotype falling ill can indicate excessive inbreeding or unanticipated health concerns associated with the transgene. Similarly, animals falling ill after recent ovulation can indicate issues with reagents, materials, or techniques. Tracking animals and their health enables lab personnel and veterinarians to follow up when concerns resurface and take preventative measures to prevent future illness. In mammals, there are numerous identification methods. Permanent methods for mice include ear punching, ear tags, tattooing, and subcutaneous microchips16. These can clearly and reliably differentiate animals within a colony or cage and can be easily administered by laboratory personnel. Methods such as ear punching are minimally invasive, require only one piece of specialized equipment, and work for animals of most ages. While these systems are straightforward and useful for mice, their use in frogs presents a unique set of challenges. Frogs and other amphibians lack a pinna (external ear structure). Some researchers have attached tags to the animal&#39;s jaw, toe, or hind limb17,18. This approach resulted in various problems: jaw tags caused irritation, and agitated frogs attempted to pull off tags with their forelimbs17. Toe tags pierced the webbing between toes, impairing movement and carrying the risk of becoming lost. As such, amphibians require their own methods for identification. Historically, toe-clipping has also been used to mark amphibians17,19. The toe is clipped with a sharp pair of scissors, and the animal can be identified by the length of toes on the forefeet and hind feet or by the angle at which the toe has grown back (in salamanders). However, this method poses the ethical concern that toe clipping may impair the animal&#39;s movement17. In addition, this can cause bleeding and introduce a risk of infection. Another established marking system is skin autografts, in which skin is taken from one part of the frog and surgically attached to another part. For example, a method is described for marking a frog&#39;s back or shoulder using a light-colored skin graft from its chest20. Skin grafts also come with limitations and risks: the procedure is invasive and introduces the risk of Aeromonas hydrophila infection, or red leg, a potentially fatal affliction; complete healing of the autograft takes up to 6 weeks; and with the methods described, only 6 frogs can be housed together because of limited places to put an autograft20.
Less invasive marking approaches include glass beads and transponder chips17,19. In the glass bead method, glass beads are threaded onto a small suture and sewn into the frog&#39;s skin. This provides greater variability than skin autografts, with at least 60 distinctive color combinations. There is, however, a risk that the suture can come out and result in the beads being lost. Alternatively, a microchip transponder can be implanted under the skin in the frog&#39;s dorsal lymph sac. This is considered the most permanent marking method and enables a potentially infinite number of animals to be individually identified and cataloged. However, this is also the most expensive method, as individual microchips are expensive, and a large colony would be costly to mark. Microchips also require a special scanner to read19. One common approach for Xenopus identification is referring to animals&#39; natural coloring and patterning. This works especially well for frogs such as X. laevis, which have distinct patterns that remain throughout adulthood. However, these patterns can change over time with stress, and coloring can appear different when frogs are moved between transparent and tinted containers15. Additionally, this identification method is less useful for X. tropicalis, which has less distinct marking patterns compared to X. laevis, or for albino animals, which have no color markings21. Even for species with distinct markings, lab personnel can interpret the placement and size of markings differently, which can cause errors in identification. Because of this, photographing animals is most reliable in conjunction with an additional identification method. Therefore, we seek to mark and identify Xenopus animals using a technique that is easily discernable, permanent, and minimally invasive.
There are limited published resources describing methods for tattooing amphibians. Tattooing has been described alongside other branding techniques, including heat brands, silver nitrate brands, and freeze brands17. In the same resource, tattooing was done by drawing numerals with a 27G hypodermic needle, and the process was noted not to cause infection, in contrast to the other branding techniques, which used a wire shaped into a numeral or other mark. In another source, an electric tattooing machine (described as a vibrating needle) was used to mark frogs, but little detail was provided on the technique17,19. The authors warn that by disturbing the frog&#39;s protective slime layer, this procedure increases the risk of red leg. While there is no marking or identification method that is both completely noninvasive (such as photographs) and permanent (such as microchips), tattooing provides an effective compromise. Tattooing is relatively straightforward compared to other techniques, such as skin autografts. Additional benefits include a smaller learning curve and relatively inexpensive equipment. Tattooing aquatic amphibians comes with certain challenges, which can intimidate researchers and impair successful animal marking. This paper aims to provide researchers with well-documented methods for tattooing adult Xenopus with a rotary tattoo machine.

מחבר זרקור: זיקוק טכניקות סימון Xenopus laevis למחקרים ביו-רפואיים

שיטות לקעקוע Xenopus laevis עם מכונת קעקועים סיבובית

Our research is focused on investigating the organization of the cell cortex using Xenopus egg extracts and supported lipid bilayers. We are trying to understand how dynamic cytoskeletal patterns are regulated within the cortex and how these patterns support basic cell functions like cell division. This protocol outlines an effective and safe method for marking Xenopus laevis.This approach enables researchers to track genetic lines and experimental replicates and to monitor animal health. Tattooing is a cost-effective permanent marking technique for amphibians. It's much less invasive than other permanent methods, such as skin graft or tags, it's also more reliable than qualitative methods, like photos or pattern recognition.

לקעקועים באיכות גבוהה יהיו משיכות כהות וקריאות על חזה הצפרדע, וניתן להבדיל ביניהם בבירור ממרחק של כמה מטרים (איור 5A). באופן כללי, מספרים וסימונים גדולים יותר טובים יותר לקריאות, אך ניתן להקטין שמות ומספרים ארוכים יותר כדי להתאים בנוחות לחזה הצפרדע. קשה יותר לשפוט אורך חיים ?...

כאן, אנו מתארים שיטות לקעקוע בוגר Xenopus laevis (צפרדע אפריקאית ציפורניים) עם מכונת קעקוע סיבובית. קעקוע נכון יוצר ספרות כהות וקלות לקריאה שמחזיקות מעמד מספר חודשים והופכות את בעלי החיים לניתנים להבחנה בקלות למטרות מחקר ושמירת רשומות.

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling ...

methods-for-tattooing-xenopus-laevis-with-a-rotary-tattoo-machine

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine

386 Views.  Dartmouth College. המחקר שלנו מתמקד בחקירת הארגון של קליפת המוח התאית באמצעות תמציות ביצים של Xenopus ודו-שכבות שומנים נתמכות. אנו מנסים להבין כיצד תבניות ציטו-שלד דינמיות מווסתות בתוך קליפת המוח, וכיצד דפוסים אלה תומכים בתפקודים בסיסיים של תאים כמו חלוקת תאים. פרוטוקול זה מתו...

Video: מחבר זרקור: זיקוק טכניקות סימון Xenopus laevis למחקרים ביו-רפואיים

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling researchers to model human disease. Recording and tracking individual animals allows researchers to reduce the number of animals required for study and refine practices to improve animal wellbeing. Several well-documented methods exist for marking and tracking mammals, including ear punching and ear tags. However, methods for marking aquatic amphibian species are limited, with the existing resources being outdated, ineffective, or prohibitively costly. In this manuscript, we outline methods and best practices for marking Xenopus laevis with a rotary tattoo machine. Proper tattooing results in high-quality tattoos, making individuals easily distinguishable for researchers and posing minimal risk to animals' health. We also highlight the causes of poor-quality tattoos, which can result in tattoos that fade quickly and cause unnecessary harm to animals. This approach allows researchers and veterinarians to mark amphibians, enabling them to track biological replicates and transgenic lines and to keep accurate records of animal health.

Here, we describe methods for tattooing adult Xenopus laevis (African clawed frog) with a rotary tattoo machine. Proper tattooing results in dark, easily legible numerals that last for several months and make animals easily distinguishable for research and recordkeeping purposes.

Preparation of the Tattoo Gun to Mark Frogs for Research Purposes

To begin, connect the tattoo gun and foot pedal to the power supply. Position the foot pedal underneath the working surface. For assembling the tattoo gun, loosen the screws in the grip with an Allen wrench.Insert the plastic tip all the way into the grip and tighten the screw to hold it in place. Then insert the metal tube in the back of the grip to half of its length and tighten the screw while adjusting the length. Insert a tattoo needle through the back of the grip to secure it in the plastic tip at the front of the grip.Slide the back of the needle and metal tube through the tube clamp. After adjusting the metal tube, hand tighten the tube clamp until it cannot move. Remove the black O-ring, hook the needle onto the rotor arm, and replace the O-ring.Next, set the required voltage on the power supply. Once the power supply is plugged in, press the foot pedal to check if the machine works. Fill the plastic ink pot with black tattoo ink to about three quarters full before tattooing.

הכנת אקדח הקעקועים לסימון צפרדעים למטרות מחקר

Rotary Tattoo Method for Long-Term Marking of Xenopus in Research Environments

To begin, set up the equipment for tattooing. Place the anesthetized frog on its back on a dry, unbleached paper towel. Using a dry, lint-free wipe, clear the water and mucus from the frog's chest.Then find the sternum in the center of the frog's chest with fingers, and using the non-dominant hand, hold the skin taught. Position the assembled tattoo gun vertically relative to the working surface and dip the needle into the ink. Keeping the gun vertical, press the needle tip onto the frog's skin, followed by the foot pedal.Draw lines onto the frog's skin while applying even pressure. If the needle gets stuck, clear excess ink or skin from the needle with a wipe. If necessary, clear excess ink on the frog's chest with frog-safe water and a wipe, and then wick away moisture with a dry wipe.Continue to ink the same area until dark, legible numbers persist after wiping away excess ink. Fill a tank with 10 to 15 liters of fresh frog-safe water and add a styrofoam island to provide a surface for the frog to wake up without drowning. Wet a paper towel with frog-safe water and place it flat on the styrofoam island.Next, lay the frog belly down on the towel facing the water. Fold half of the paper towel over the back half of the frog, and using cupped hands, wet its top portion. After 24 hours, when the tattoo is healed, return the frog to its long-term housing unit.Of the frogs tattooed, 100%had visible tattoos immediately after tattooing, 100%had them 24 hours after tattooing, and 91%had them four months after tattooing.