Araştırmamız, insan kan bozukluklarını incelemek, yeni biyobelirteçleri, terapötik hedefleri ve lösemi gibi durumlar için tedavileri belirlemeye odaklanmak için zebra balığı modelinden yararlanıyor. Zebra balığının benzersiz avantajlarından yararlanarak, hematolojik hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaları keşfetmeyi ve hasta sonuçlarını iyileştirmek için yenilikçi terapötik stratejiler geliştirmeyi amaçlıyoruz. Yetişkin zebra balıklarına intravenöz enjeksiyon, küçük boyutları ve karmaşık damar sistemleri nedeniyle zordur.
Maddelerin veya hücrelerin yetişkin zebra balıklarına hassas ve verimli bir şekilde iletilmesi için optimize edilmiş bir IV enjeksiyon yöntemi geliştirdik. İntrakardiyak ve retroorbital enjeksiyon ile karşılaştırıldığında, burada sunduğumuz IV yöntemi daha iyi balık sağkalımı ve daha iyi hücre aşılaması ile sonuçlandı. Bu yöntem, yetişkin zebra balıklarını dönem dışı çalışmalar için daha kullanışlı hale getirir.
Yeni modellerin bazı sınırlarının üstesinden gelen geliştirilmiş IV tekniği, hastalık modellerinin ve ilaç taramalarının doğruluğunu artırarak yeni tedavilerin ilerlemesine yardımcı olur. Başlamak için, ötenazi yapılmış mpo: EGFP transgenik zebra balığını bir diseksiyon masasına yerleştirin. Böbrek iliğini izole etmek için zebra balığını inceleyin.
Daha sonra böbrek iliğini hücre süspansiyon ortamı içeren 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Böbrek iliği hücrelerini ayrıştırmak için süspansiyonu pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir naylon hücre süzgecinden geçirin.
Daha sonra hücreleri 500G'de sekiz dakika santrifüjleyin ve peleti 500 mikrolitre hücre süspansiyon ortamında yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı atın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hücreleri 10 mikrolitrelik bir alikot ile sayın. Hamilton şırıngasını üç ila dört kez% 75 etanol ile iyice yıkayın.
Ardından, tüm etanol kalıntılarının giderildiğinden emin olmak için şırıngayı üç ila dört kez ultra saf suyla durulayın. Zebra balığına anestezi uyguladıktan sonra, anestezinin derinliğini azalmış hareket ve refleks tepkilerinin kaybı ile onaylayın. Enjeksiyonu stabilize etmek için balık sırt tarafını yukarı bakacak şekilde temiz nemli kağıt mendil üzerine sola bakacak şekilde konumlandırın.
Hamilton şırıngasını sıkıca kavrayın ve iğneyi kaudal damara yaklaşık 45 derece açıyla açın. Casper zebra balığı için, yarı saydam gövde boyunca geminin görünür bir bölümünü hedefleyin. İğneyi yavaşça kabın içine yerleştirin ve mpo: EGFP transgenik zebra balığından izole edilen iki mikrolitre tam böbrek iliği hücresi uygulayın.
Enjeksiyondan sonra, kanamayı kontrol etmek için enjeksiyon bölgesine bir pamuklu çubukla 10 saniye boyunca hafif bir baskı uygulayın. Kap içindeki GFP sinyallerini doğrulamak için enjekte edilen zebra balığını mikroskop altında gözlemleyin. Enjekte edilen zebra balığının taze sterilize edilmiş balık suyunda 10 dakika iyileşmesine izin verin.
Ardından balığı statik bir tanka aktarın. İntravenöz enjeksiyon yöntemi, 43 balığın 41'inde görülebilen GFP sinyalleri ile en yüksek başarı oranını verdi. Retroorbital yöntemde 37 balıktan sadece üçünde GFP tespit edilirken, intrakardiyak yöntemde ise 40 balıktan 11'inde başarı saptandı.
İntravenöz enjeksiyon yöntemi, enjekte edilen balıklarda, özellikle retro-orbital ve intrakardiyak yöntemlere kıyasla daha yüksek hücre dozları ile daha iyi sağkalım oranları ile sonuçlanmıştır. İntravenöz enjekte edilen balıklarda GFP sinyalleri transplantasyondan sonraki üçüncü gün gibi erken bir tarihte tespit edilirken, retro-orbital ve intrakardiyak yöntemler gecikmiş GFP sinyal başlangıcını gösterdi. 17. günde, intravenöz enjekte edilen balıklar böbrek iliğinde en belirgin GFP sinyallerini gösterdi.
Böbrek iliğinin akış sitometrisi, intravenöz enjekte edilen balıklarda yaklaşık% 18 GFP pozitif hücre gösterdi ve donör böbrek iliğindeki GFP seviyeleri ile uyumlu olarak üç kez 10 ila beş hücrenin gücü gösterdi. Buna karşılık, intrakardiyak ve retroorbital yöntemler sırasıyla %5 ve %2 GFP pozitif hücreler gösterdi.
