Araştırmamız, mikrobakteri tüberkülozu ile insan mikrofajlarını ifade eden mikrobiyal sensörler arasındaki biyokimyasal etkileşimi incelemek için yararlı bir rehber sağlar ve mikrobakteri tüberkülozunun fibrositlere girişinde rol oynayan daha sert moleküllerle ilgili olacaktır. Reseptör etkileşimi, genellikle raportör makineler, hermetik moleküller, seviyelendirilmiş rekombinant proteinler, nakavt, knockdown, düşük ekspresyon modellerinin kullanımını kullanan yaklaşımlar kullanılarak yıllar boyunca incelenmiştir. Bu teknikler zorlayıcı, zaman alıcı ve bazen pahalı olabilir.
Yayınlanan protokolü kullanarak, makrofajlarda ilk kez SLMF1 reseptörünün mikobakteri tüberkülozu ile etkileşime girdiğini, bakteri alımını teşvik ettiğini ve endolizozomal olgunlaşmaya yol açtığını gösterdik. Gen ekspresyonu deneyleri ile ilgili zorlukların üstesinden geldik ve yeni terapötik stratejiler için yeni bir hedef belirledik. Protokolümüz, akış sitometrisi ve floresan mikroskobu kullanarak mikrobakteri tüberkülozu ve SLMF1 mikrobiyal sensörü arasındaki biyokimyasal etkileşimi tespit etmek için genellikle mevcut olan ve verimli olarak kullanılan iki teknik olan iki alternatif sunmaktadır.
Bu metodolojinin birçok potansiyel kullanımı vardır ve diğer araştırma bağlamlarına kolayca uyarlanabilir. Mycobacterium tuberculosis reseptör etkileşimini, BSL2 koşulu altında gerçekleştirilebilen, ancak diğer reseptörlere ve canlı suşlara kolayca uyarlanabilen tüm hücre inaktive edilmiş ve sonikasyonlu bakterileri kullanarak değerlendiren basit bir protokol sunuyoruz. Gerekirse, bu testler farklı canlı patojenlerle BSL3 koşulları altında da gerçekleştirilebilir.
Başlamak için, sağlıklı donörlerden toplanan kanı dikkatlice 50 mililitrelik tüplere aktarın ve hacminin yarısına kadar tuzlu su ile seyreltin. Bir yoğunluk gradyan ortamı hazırlayın ve numuneyi periferik kan mononükleer hücrelerini, PBMC'leri ayırmak için santrifüjleyin. PBMC'leri beyazımsı haleden toplayın.
Bir hücre sayma odasındaki hücreleri saydıktan sonra, CD14 pozitif monositleri toplamak için CD14 boncukları ile manyetik seçim yapın. Daha sonra izole edilmiş hücreleri RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin. Yapışmayı arttırmak için serum yokluğunda 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının her bir oyuğuna mililitrede altı hücrenin gücüne bir kez 10 ila 10 konsantrasyonda 500 mikrolitre CD14 pozitif monosit tohumlayın.
İki saat sonra, yapışmayan hücreleri çıkarmak için kuyucukları önceden ısıtılmış RPMI 1640 ortamı ile yıkayın. 16 ila 18 saat boyunca bir mililitre tam RPMI 1640 ortamı kullanarak monositleri makrofajlara ayırın. Ertesi gün, kuyuları bir mililitre PBS ile yıkayın ve her kuyucuğa bir mililitre tam RPMI 1640 ortamı ekleyin.
Makrofajları 24 saat boyunca 10 mikrolitre sonikasyonlu mikobakteri tüberküloz antijenleri ile uyarın. Ertesi gün, bir P-1000 pipeti kullanarak, tüm RPMI ortamını plakanın kuyularından atın. Makrofajları hasat etmek için soğuk PBS ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyin.
Hücreleri 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri 500G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti takviye edilmiş bir radyoimmünopresipitasyon test tamponunda yeniden süspanse edin.
Süspansiyonu bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin, her 10 dakikada bir girdap yapın. Süspansiyonu 15 dakika boyunca 14.000G'de santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın. Dönen bir mikro tüp tutucuda bir gecede dört santigrat derecede bir gecede 50 mikrolitre protein özütü ile altı mikrolitre protein özütü ile altı tam inaktive edilmiş mikobakteri tüberküloz hücresinin gücüne bir kez 10 kez inkübe edin.
Ertesi gün, protein bakteri kompleksini lekelemek için, mikro tüpe anti-insan SLAMF1 antikorunu ekleyin, karışımı girdaplayın ve karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika boyunca gece boyunca inkübe edin. Protein bakteri komplekslerini FACS ile yıkadıktan sonra, bunları FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneyi bir akış sitometresinde alın. Yuvarlak burunlu cerrahi cımbız kullanarak, 12 milimetre yuvarlak kapak fişlerini 24 oyuklu bir kültür plakasının kuyularına yerleştirin.
Kapak fişini mycobacterium tuberculosis rhodamine antijenleri ile 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 300 mikrolitre PBS içinde seyreltilmiş 100 mikrolitre protein özütü ekleyin ve çalkalama ile oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Kültür plakasının kapağını parafin film ile sarın.
Parafin film kaplı kapağa 60 mikrolitrelik önceden titre edilmiş anti SLAMF1 birincil antikoru ekleyin. Kavisli ince uçlu cerrahi cımbız ve iğneler kullanarak kapak fişini plakadan dikkatlice çıkarın. Birincil ve ikincil antikor çözeltisi ile inkübasyonun ardından, fazla sıvıyı çıkarın ve kapak kızağını bir cam slayt üzerine yerleştirilmiş bir damla montaj sıvısının üzerine monte edin.
Slaytı bir floresan mikroskobu altına yerleştirin ve uygun filtreler kullanarak hücreleri gözlemleyin. Monositler, PBMC'lerden %95 veya daha yüksek saflıkta başarılı bir şekilde izole edildi ve aderans ve gece kültürünü takiben monosit türevli makrofajlar üretildi. SLAMF1 yüzey ekspresyonu, mycobacterium tuberculosis antijenleri ile uyarılan makrofajlarda indüklendi ve seviyeleri akış sitometrisi kullanılarak doğrulandı.
SLAMF1 ve mycobacterium tuberculosis tüm hücreleri arasındaki etkileşim, bir çapraz bağlama testi ve ardından akış sitometrisi kullanılarak gösterildi. SLAMF1 ve Mycobacterium tuberculosis antijenleri arasındaki etkileşim, birleştirilmiş görüntülerle doğrulanan ko-lokalizasyon ile floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi.
