Araştırma grubumuz, bir 3D kokültür sistemi geliştirmek için poli vinil alkol, PVA ve poli epsilon-kaprolakton, PCL, nanolifli membranlar kullanır. Membranların epitel ve fibroblast hücrelerini nasıl desteklediğini, doku ortamlarını nasıl taklit ettiğini cevaplamayı ve modelleme sinyalizasyonlarının ve hücresel etkileşimlerin incelenmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Gözenekli elektro eğrilmiş nanofibröz membranların, epitel hücrelerinin epitel dokusu oluşturmasına izin verdiğini, çok katmanlı ve fibroblastların her ek matriste büyümesine izin verdiğini göstereceğiz.
Yöntemler, genişletilmiş bir 3D sistemin, geleneksel ve 2D kültürlere kıyasla büyüyen dokuya nasıl daha iyi ortamlar sağlayabileceğini vurgulamaktadır. Farklılaşmış epitel hücreleri kullanan bir kokültür sistemi sunuyoruz. Kök hücreleri kullanarak düzenlemek, karmaşık farklılaşma prosedürü gerektirir, ancak modelimiz, bir 3D kokültür sisteminin geliştirilmesinde basitlik ve zaman tasarrufu açısından avantajlara sahiptir.
Nanolifli membranları kokültürlerdeki üst tabaka hidrojellerle birleştirerek nanolifli iskelelerin sınırlamasının üstesinden gelmeye odaklanıyoruz. Başlamak için, manyetik çubuk içeren temiz bir cam şişeye 0.02 gram poliakrilik asit ve bir gram PVA ekleyin. Şişeye 7,8 mililitre damıtılmış su ekleyin, ardından şişeyi bir tabak karıştırıcıya yerleştirin.
Şişe oda sıcaklığına soğuduktan sonra, üzerine 0,2 mililitre glutaraldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 RPM'de plaka karıştırıcıya geri koyun. Elektro eğirme için beş mililitrelik bir şırınga kullanın. Pistonları namlulardan ayırın ve namluların içindeki küçük plastik kalıntıları ve pistonların uçlarını temizleyin.
Ardından, sıvı akışını engellemek için iğneler kullanın ve PVA çözeltisini her bir şırınga haznesine dökün. Pistonları namlulara monte edin ve iğneleri çıkarın. Yeni bir 27 gauge metal iğneyi monte ettikten sonra, elektro iplik eğirme makinesine yerleştirin.
Kollektörü alüminyum folyo ile sıkıca sarın. Enjektör paneli orijinal konumuna döndüğünde, elektro iplik eğirme makinesini iki mililitre enjeksiyon hacmine, dakikada altı mikrolitre enjeksiyon hızına, 100 RPM silindir hızına ve 14 santimetre uç-kollektör mesafesine ayarlayın. Her pompa için sıvı akışını kontrol edin, ardından yaklaşık 12 kilovoltluk bir elektrik potansiyeli ile elektro iplik eğirme makinesini çalıştırın.
Elektro sıkma işlemi tamamlandıktan sonra elyaf matı içeren folyoyu kolektörden ayırın. Nanofiber matı vakum altında bir kurutucuda saklayın. Temiz bir cam şişeye 1.5 gram PCL ve 8.5 mililitre kloroform ekleyin.
Şişeyi bir tabak karıştırıcıya yerleştirin ve PCL'yi oda sıcaklığında 12 saat boyunca kloroformda çözün. Nanofiber membranın küçük bir parçasını kesin, otomatik püskürtme işlemini kullanarak parçaları beş dakika boyunca ince bir altın tabaka ile kaplayın. Başlamak için, fabrikasyon PVA nanofiber matı, transwell eki için istenen boyutta parçalar halinde kesin.
1,5 mililitre saf hidroklorik asit içeren küçük bir tabak hazırlayın. Hidroklorik asitli tabağı ve nanofiber parçalarını bir vakum odasına yerleştirin ve kapağı kapatın. Daha sonra vakum pompasına bağlı vanayı açın ve hidroklorik asit dumanları yükselene kadar 10 saniye bekleyin.
Valfi kapatın ve membranları iki dakika boyunca hidroklorik asit dumanı ile işlemden geçirin. Hidroklorik asit işleminden sonra, membranlara damıtılmış su damlaları ekleyin. Membranları bir cam slayt üzerine yerleştirin ve folyodan çıkarın.
Membranları karbon bant üzerine ince bir altın tabakasıyla kaplamak için otomatik püskürtmeli bir kaplayıcı kullanın. Daha sonra hidroklorik asit ile çapraz bağlanmış PVA nano membranlarını PBS ile üç kez yıkayın ve kültür ortamına batırın. Suya batırdıktan sonra, artık hidroklorik asit olmadığını doğrulamak için pH'ı kontrol edin.
Başlamak için, nanofiber matları PVA nano membranlar için 10 milimetre ve PCL nano membranlar için 13 milimetre çapında yuvarlak parçalar halinde kesin. SYLGARD 184 baz ve sertleştirici maddeyi plastik bir kapta 10'a bir kütle oranında karıştırın. Polidimetilsiloksan veya PDMS çözeltisini kabarcıklar oluşana kadar iki ila üç dakika kuvvetlice karıştırmak için temiz bir cam slayt kullanın.
PDMS'yi bir cam slayt üzerine eşit şekilde yayın. Ek parçanın alt kenarını PDMS'ye iyice batırın. Ardından, PDMS sertleşene kadar ek parçayı 10 ila 15 dakika boyunca sürgülü ısıtıcının üzerine baş aşağı yerleştirin.
Artık yapışkan olmadığından emin olmak için PDMS'yi 200 mikrolitrelik bir pipet ucuyla kontrol edin. Şimdi, ek parçayı PVA nano membran parçasının üzerine hafifçe bastırın, böylece ek parçanın alt kısmı zarın nanofiber tarafına bakar. Kuyu ortasına bir damla damıtılmış su ekleyin ve folyoyu dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın.
Daha sonra eki 24 oyuklu yeni bir plakaya iyice yerleştirin ve zarın kurumasını bekleyin. Nano membran parçasını takarken, 200 mikrolitrelik bir pipet ucunu PDMS karışımına batırın ve kuyunun dört köşesine ve ortasına tam olarak noktalayın. Plakayı sürgülü ısıtıcıya yerleştirin ve PDMS'nin beş ila yedi dakika sertleşmesine izin verin.
Ardından, PCL nano membran parçasını, nanofiber tarafı PDMS'ye bağlı olacak şekilde iyi içeren PDMS'ye yerleştirin. Tam tutturma için zarın folyo tarafına hafifçe bastırmak için küçük, temiz bir fırça kullanın. Daha sonra folyonun çıkarılmasını kolaylaştırmak için kuyuya 0.2 mililitre% 70 etanol ekleyin.
Ek parçayı ve alt kısmı, gece boyunca ultraviyole ışık altında transwell kurulumunda iyice sterilize edin. Ertesi gün, her biri 10 dakikalık üç döngü boyunca ek parçaya 200 mikrolitre PBS ve alt kuyuya 500 mikrolitre ekleyerek eki ve tabanı iyice yıkayın. Hücreler% 70 ila% 80 birleşme seviyesine ulaştığında, onları 10 mililitre PBS ile yıkayın ve tripsinize etmek için iki mililitre% 0.05 tripsin EDTA ekleyin.
Hücreleri alttan çıkarmak için tabağa hafifçe vurun. Tripsin enzimini nötralize etmek için sekiz mililitre tam kültür ortamı ekleyin, ardından hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü 400G'de beş dakika santrifüjleyin.
Supra natanı attıktan sonra, hücre peletini F12 ortamı ile beş mililitre tam DMEM'de yeniden süspanse edin. Ardından alt kısmı 500 mikrolitre tam DMEM F12 ortamı ile doldurun. PVA nanolifli membrana bağlı eki transwell'e aktarın ve 50 mikrolitre MLE-12 hücre süspansiyonu ekleyin.
Daha sonra, alt kısımdaki PCL nanofibröz membranı 500 mikrolitre NIH3T3 hücre süspansiyonu ile doldurun. Hücreleri iki saat inkübe ettikten sonra, transwell kurulumunda ek içeren MLE-12 hücresini ve alt kuyu içeren NIH3T3 hücresini birleştirin, Kokültür sistemindeki NIH3T3 hücrelerinin ve MLE-12 hücrelerinin uzamsal dağılımı açıkça ayırt edilebilirdi, yeşil NIH3T3 hücreleri değişen derinliklerde dağılmış ve kırmızı MLE-12 hücreleri katmanlar oluşturur. NIH3T3 hücreleri PCL nanofibröz membrana sızar ve nanofiber eksenler boyunca uzanırken, MLE-12 hücreleri PDA nanofibröz membranın yüzeyine yapışır ve bir agregasyon sergiler.
