Meme veya pankreasın katı tümörleri teşhisi konan hastalar için, metastaz veya tedavi direnci gibi hastalık ilerlemesi olayları ile kötü sonuçlar arasında güçlü bir ilişki vardır. Doku homeostazını ve fibrozu yöneten hücresel moleküler mekanizmaların katı tümör ilerlemesini de kontrol ettiği bilinmektedir. Laboratuvarım bu mekanizmaları anlamakla ilgileniyor, böylece hastalara yardımcı olacak tedavileri ve tanısal önlemleri daha iyi geliştirebiliriz.
Ana deneysel zorluklardan biri, fizyolojik ve patofizyolojik süreçler sırasında hücreler arası etkileşimleri yakalayabilen 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç duyulması ve daha sonra bu etkileşimleri anlayarak, hastalıklara ilişkin ek içgörülerin anlaşılabilmesi ve daha sonra yeni tedavi stratejileri geliştirilmesidir. Protokolümüz, in vivo doku mikroçevre özelliklerini kopyalayan uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir 3D hücre kültürü yöntemi sağlayacaktır. Protokolümüz, heterojen hücresel etkileşimleri ölçebileceğimiz kolay ve hızlı, iskelesiz ve iskele tabanlı 3D hücre kültürü yöntemleri sağlayacaktır.
İskelesiz modellerle kullanılabilecek, aynı zamanda hücre istilasını ve davranışını ölçmek için iskele tabanlı sistemlerle birleştirilebilen 3D küresel kültürleri verimli bir şekilde formüle etmenin bir yolunu keşfettik. Başlamak için, biyogüvenlik kabininin içini 15 dakika boyunca sterilize etmek için ultraviyole ışığı açın. Hava akışını stabilize etmek için biyogüvenlik kabini pencere kanadını açın ve vakum aspirasyon sistemini açın.
Kaputun iç yüzeyini ve vakum aspirasyon sisteminin borusunu %70 etanol ile temizleyin. Hücre kültürü ortamını, PBS'yi ve% 0.25 tripsin EDTA'yı bir boncuk banyosunda 37 santigrat dereceye ısıtın. Şimdi, %70 ila 80 birleşmeyi doğrulamak için hücreleri mikroskop altında inceleyin.
Bir vakum aspiratörü kullanarak, kültür ortamını kaplanmış hücrelerden aspire edin ve atın. Kalan ortamı iki mililitre PBS ile bir kez yıkayın, ardından yıkamadan sonra PBS'yi aspire edin ve atın. Daha sonra, bir mikropipet kullanarak, hücre kültürü kabına bir mililitre tripsin ekleyin ve plakayı beş dakika boyunca 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.
Şimdi, tripsini etkisiz hale getirmek için plakaya PBS'de bir mililitre soya fasulyesi tripsin inhibitörü ekleyin. Hücre kümelerini dağıtmak için, sıvı karışımı bir P-1000 mikropipet kullanarak pipetleyin. Hücre süspansiyonunu plakanın altından toplayın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 100 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı vakum aspiratörü kullanarak atın. Moleküler floresan probların 37 santigrat derecede temperlenmiş bir boncuk banyosunda 15 dakika oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Bir mikropipet kullanarak, hücreleri ilgili çalışan hücre izleyici boya ortamı çözeltilerinin iki mililitresinde yeniden süspanse edin.
Tüpleri 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörde inkübe edin. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 100 G'de santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı aspire etmek ve atmak için bir vakum aspiratörü kullanın.
Bir mikropipet kullanarak peleti bir mililitre %10 FBS içeren DMEM içinde iyice yeniden süspanse edin. Şimdi, hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini toplayın ve eşit hacimde tripan mavisi içeren bir mikrotüpe aktarın. Hücreleri karıştırdıktan sonra, bir hücre sayma odası slaytına 20 mikrolitre hücre tripan çözeltisi ekleyin.
Hücre numarasını belirlemek için slaydı otomatik bir hücre sayacına yerleştirin. İki okumadan ortalama toplam canlı hücre sayısını hesaplayın. Her hücre tipi için mililitre başına üç hücrenin gücüne 6.67 kat 10 konsantrasyonda, 300 mikrolitre başına 2.000 hücreye eşdeğer çalışma hücresi stokları hazırlayın.
Bir mikropipet kullanarak, üç teknik kopya için gerekli hacmi ve bir ekstra hacmi bir mikrotüpe aktarın. Bir pipetle iyice karıştırdıktan sonra, numunenin 300 mikrolitresini U şeklinde bir alt ultra düşük ataşmanlı 96 oyuklu mikroplakaya aktarın. 96 oyuklu plakayı 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.
Bir faz kontrast mikroskobu kullanarak her 24 saatte bir, 96 saate kadar sferoid büyümesi ve morfolojisini görüntüleyin. Görüntüleme ve otomatik inkübatör cihazlarını açın. BJ-5ta fibroblastları ile birlikte kültürlenmiş BT-474 sferoidlerinin ve hücre izleyici boyaları ile boyanmış EA.hy926 endotel hücrelerinin sırasıyla mavi, turuncu ve koyu kırmızı renkleriyle boyanmış 48 saatlik büyümesini yakalamak için görüntüleme yazılımının görev yöneticisinde yeni bir görüntüleme protokolü oluşturun.
Bazal membran ekstrakt solüsyonunu soğuk tutmak için bir buz kovasını buzla doldurun ve solüsyonu buzun üzerine yerleştirin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, kültür kabından yaklaşık 170 mikrolitre ortam aspire edin. Küçük sferoidleri yakından gözlemlemek için bir büyüteç ve mini bir ışık kutusu edinin.
96 delikli küresel plakayı ışık kutusunun üzerine yerleştirin ve büyüteci baş üstüne yerleştirin. Bir P-200 pipetini 30 mikrolitreye ayarlayın ve üç mikro damlacık oluşturmak için bazal membran ekstraktını toplayın. 96 oyuklu plakanın düz olduğundan emin olun ve pipeti kürenin üzerine dikey olarak yerleştirin.
Şimdi, kuyunun dibine dokunmadan damlacığı serbest bırakın. Plakayı 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. İnkübasyondan sonra, sferoidleri oyuk başına ilave 50 mikrolitre bazal membran ekstrakt çözeltisi ile kaplayın ve plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.
Daha sonra, bir mikropipet kullanarak, her bir oyuğa 100 mikrolitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Kaplamadan 72 saat sonra, EA.hy926 ve THP-1 veya BJ5-ta ve THP-1 ile birlikte kültürlenen MCF-10A, MCF-10Ca1H ve BT-474 hücreleri, monokültür epitel sferoidlerine kıyasla sferoid alanında önemli bir artış gösterdi. Buna karşılık, ko-kültürlenmiş MDA-MB-468 hücreleri, monokültüre kıyasla sferoid alanda önemli bir azalma gösterdi.
Hücre izleyici boyanın sferoid oluşumundan önce BT-474 tümörjenik epitel hücrelerine ve stromal hücrelere uygulanması, EA.hy926 ve BJ-5ta dahil olmak üzere stromal hücrelerin, merkezi BT-474 sferoidlerinin çevresinde tomurcuklanan yapıları oluşturduğunu gösterdi. Kaplamadan 24 saat sonra, stromal hücrelerle birlikte kültürlenmiş BT-474 tümörjenik epitel hücrelerinin üzerine bir bazal membran yerleştirildi ve bu da invaziv yapıların oluşumunu gösterdi.
