우리 연구그룹은 폴리비닐알코올, PVA, 폴리엡실론-카프로락톤, PCL, 나노섬유막을 사용하여 3D 공동배양 시스템을 개발합니다. 이 연구는 멤브레인이 상피 및 섬유아세포 세포를 지원하는 방법, 조직 환경을 모방하는 방법에 대한 답을 제시하고 패터닝, 신호 전달 및 세포 상호 작용에 대한 연구를 촉진하는 것을 목표로 합니다. 우리는 다공성 전기 방적 나노 섬유막이 상피 세포가 상피 조직을 형성하도록 하여 다층과 섬유아세포가 각각의 추가 매트릭스에서 성장할 수 있도록 한다는 것을 보여줄 것입니다.
이 방법은 확장된 3D 시스템이 기존의 2D 배양에 비해 성장하는 조직에 더 나은 환경을 제공할 수 있는 방법을 강조합니다. 우리는 분화된 상피 세포를 사용하는 공동 배양 시스템을 제공합니다. 줄기세포를 사용하여 조직하려면 복잡한 분화 절차가 필요하지만, 우리 모델은 3D 공동 배양 시스템 개발에서 단순성과 시간 절약이라는 장점이 있습니다.
우리는 coculture에서 나노 섬유 멤브레인과 오버 레이어 하이드로겔을 결합하여 나노 섬유 스캐폴드의 한계를 극복하는 데 중점을 둡니다. 시작하려면 마그네틱 바가 들어 있는 깨끗한 유리병에 폴리아크릴산 0.02g과 PVA 1g을 추가합니다. 병에 증류수 7.8ml를 넣은 다음 병을 접시 교반기에 놓습니다.
병이 실온으로 냉각되면 0.2ml의 글루타르알데히드를 넣고 실온에서 500RPM으로 30분 동안 플레이트 교반기에 다시 놓습니다. 전기 방사를 위해 5ml 주사기를 사용하십시오. 배럴에서 플런저를 분리하고 배럴 내부의 작은 플라스틱 파편과 플런저 끝을 청소합니다.
그런 다음 바늘을 사용하여 액체 흐름을 차단하고 PVA 용액을 각 주사기 배럴에 붓습니다. 플런저를 배럴에 조립하고 바늘을 제거합니다. 새로운 27 게이지 금속 바늘을 조립한 후 전기 방적기에 넣습니다.
수집기를 알루미늄 호일로 단단히 감쌉니다. 인젝터 패널이 원래 위치로 돌아오면 전기 방사기를 주입 부피 2ml, 사출 속도 분당 6마이크로리터, 롤러 속도 100RPM, 팁에서 수집기 거리 14cm로 설정합니다. 각 펌프의 액체 흐름을 확인한 다음 약 12kW의 전위로 전기 방사기를 가동합니다.
전기 방사 공정이 완료된 후 수집기에서 섬유 매트가 포함된 호일을 분리합니다. 나노섬유 매트를 진공 상태에서 건조제에 보관하십시오. 깨끗한 유리병에 PCL 1.5g과 클로로포름 8.5ml를 넣습니다.
병을 플레이트 교반기에 놓고 PCL을 실온에서 12시간 동안 클로로포름에 녹입니다. 나노 섬유 멤브레인의 작은 조각을 자르고 5 분 동안 자동 스퍼터 공정을 사용하여 얇은 금층으로 조각을 코팅합니다. 시작하려면 제작된 PVA 나노섬유 매트를 트랜스웰 인서트에 대해 원하는 크기의 조각으로 자릅니다.
1.5ml의 순수 염산이 들어있는 작은 접시를 준비합니다. 염산이 든 접시와 나노 섬유 조각을 진공 챔버에 넣고 뚜껑을 닫습니다. 그런 다음 진공 펌프에 연결된 밸브를 열고 염산 연기가 올라갈 때까지 10초 동안 기다립니다.
밸브를 닫고 2 분 동안 염산 연기로 멤브레인을 처리하십시오. 염산 처리 후 멤브레인에 증류수 한 방울을 첨가하십시오. 멤브레인을 유리 슬라이드에 놓고 호일에서 제거합니다.
자동 스퍼터 코팅기를 사용하여 탄소 테이프의 멤브레인을 얇은 금 층으로 코팅합니다. 그런 다음 염산과 가교 결합 된 PVA 나노 멤브레인을 PBS로 3 회 세척하고 배양 배지에 담근다. 담근 후 pH를 확인하여 잔류 염산이 없는지 확인하십시오.
시작하려면 나노 섬유 매트를 PVA 나노 멤브레인의 경우 직경 10mm, PCL 나노 멤브레인의 경우 13mm의 둥근 조각으로 자릅니다. SYLGARD 184 염기와 경화제를 플라스틱 컵에 10:1 질량비로 혼합합니다. 깨끗한 유리 슬라이드를 사용하여 기포가 형성될 때까지 2-3분 동안 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 용액을 세게 혼합합니다.
PDMS를 유리 슬라이드에 고르게 펴 놓습니다. 인서트의 하단 가장자리를 PDMS에 약간 잘 담그십시오. 그런 다음 PDMS가 굳을 때까지 10-15분 동안 슬라이드 워머에 인서트를 거꾸로 놓습니다.
200마이크로리터 피펫 팁으로 PDMS를 점검하여 더 이상 끈적거리지 않는지 확인하십시오. 이제 인서트 웰의 바닥이 멤브레인의 나노 섬유 면을 향하도록 PVA 나노 멤브레인 조각에 인서트 웰을 부드럽게 누릅니다. 우물 중앙에 증류수 한 방울을 넣고 집게를 사용하여 호일을 조심스럽게 제거합니다.
그런 다음 인서트를 새 24웰 플레이트에 잘 넣고 멤브레인을 건조시킵니다. 나노 멤브레인 조각을 부착할 때 200마이크로리터 피펫 팁을 PDMS 혼합물에 담그고 웰의 네 모서리와 중앙에 정확하게 점을 찍습니다. 플레이트를 슬라이드 워머에 놓고 PDMS가 5-7분 동안 경화되도록 합니다.
다음으로, 나노섬유 측면이 PDMS에 부착된 웰이 포함된 PDMS에 PCL 나노멤브레인 피스를 놓습니다. 작고 깨끗한 브러시를 사용하여 멤브레인의 호일 면을 약간 눌러 완전히 부착합니다. 그런 다음 호일 제거를 용이하게 하기 위해 0.2ml의 70% 에탄올을 웰에 추가합니다.
밤새 자외선 아래에서 트랜스웰 설정에서 인서트와 바닥을 잘 살균하십시오. 다음 날에는 인서트에 200마이크로리터의 PBS를 추가하고 하단 웰에 500마이크로리터를 각각 10분씩 3회 추가하여 인서트와 바닥 웰을 세척합니다. 세포가 70-80%의 포화도에 도달하면 10ml의 PBS로 세척하고 2ml의 0.05%트립신 EDTA를 첨가하여 트립신화합니다.
접시를 부드럽게 두드려 바닥에서 세포를 제거합니다. 트립신 효소를 중화하기 위해 8ml의 완전 배양 배지를 첨가한 다음 세포 현탁액을 50ml 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 400G에서 5분 동안 원심분리합니다.
supra natant를 버린 후 F12 배지를 사용하여 5ml의 완전한 DMEM에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 500마이크로리터의 완전한 DMEM F12 여과지로 바닥 웰을 채웁니다. 부착된 PVA 나노섬유막 삽입물을 트랜스웰에 옮기고 50마이크로리터의 MLE-12 세포 현탁액을 추가합니다.
다음으로, 바닥에 부착된 PCL 나노섬유막 웰에 500마이크로리터의 NIH3T3 세포 현탁액을 채웁니다. 세포를 2시간 동안 배양한 후, 트랜스웰 설정에서 인서트가 포함된 MLE-12 세포와 바닥 웰이 포함된 NIH3T3 세포를 조립하고, 공동 배양 시스템에서 NIH3T3 세포와 MLE-12 세포의 공간 분포는 녹색 NIH3T3 세포가 다양한 깊이로 분산되어 있고 빨간색 MLE-12 세포가 층을 형성하여 명확하게 구별되었습니다. NIH3T3 세포는 PCL 나노섬유막에 침투하여 나노섬유 축을 따라 확장되는 반면, MLE-12 세포는 PDA 나노섬유막의 표면에 부착되어 응집을 나타냅니다.
