Araştırma programımız, farklı hücre ölümü biçimlerinin nasıl düzenlendiğini anlamaya odaklanmıştır. Hücre ölümünü genellikle kanser tedavileri bağlamında, ilaçların hücre ölümünü nasıl açtığını ve bu yanıtların nasıl daha iyi ve daha spesifik hale getirileceğini öğrenmek amacıyla inceliyoruz. Birçok farklı düzenlenmiş hücre ölümü türü olduğu giderek daha açık hale geliyor.
Alan şu anda mekanik olarak farklı en az 14 ölüm türü tanımladı. Bunların çoğu morfolojik olarak nekrotik bir ölüme neden olur ve genel olarak bu yolların nasıl çalıştığı hakkında çok az şey biliyoruz. Hücre ölümü regülasyonunu incelemenin etkili bir yolu, fonksiyonel genomik kullanmaktır.
Başka bir deyişle, her bir geni sistematik olarak bozmak ve bu bozulmaların hücre ölümünü nasıl etkilediğini belirlemek. İlaçlar bağlamında gerçekleştirildiğinde, Buna kemogenetik profilleme denir. Kemogenetik taramalar tipik olarak gen nakavtlarının nihai popülasyon büyüklüğünü nasıl etkilediğini değerlendirir.
Bununla birlikte, nüfus büyüklüğü büyüme hızındaki, ölüm oranındaki veya her ikisindeki değişikliklerden etkilenebilir. Mevcut tarama yöntemleri, büyüme hızı değişiminin sınırlayıcı etkileri nedeniyle ölüm düzenleyici genleri tanımlamada başarısız olmaktadır. Medusa, büyüme hızının veya ölüm oranının değiştirilmesinin nihai popülasyon büyüklüğünü nasıl etkilediğini modellemek için ilaç yanıtının simülasyonlarını kullanır.
Bu simülasyonlar, ekrandaki her gen için ilaca bağlı ölüm oranını çıkarmamıza ve diğer kafa karıştırıcı faktörleri ortadan kaldırmamıza izin verir: Başlamak için, kuyu başına 1500 ila 5.000 hücre arasında tohumlama yoğunluklarında siyah, net tabanlı 96 oyuklu plaka hücreleri. Plakaları 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve nem ile 16 ila 24 saat inkübe edin. Daha önce optimize edilmiş sitotoks konsantrasyonunu içeren ortamda ilaç seyreltmesini hazırlayın.
Optimize edilmiş konsantrasyonda Triton X kullanarak bir plaka oluşturun. Daha sonra plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve optimize edilmiş ayarları kullanarak T0'da ve ardından uygun bir sonraki zaman noktasında deney plakalarındaki sitotoks floresansını ölçün. Son zaman noktasından sonra, her bir koşulun nihai popülasyon boyutunu belirlemek için Triton X kullanarak deney plakalarını lyce.
Uç nokta verilerini kullanarak fraksiyonel canlılığı hesaplayın ve sonuçları doz yanıt eğrilerine uygun hale getirin. Yaklaşık% 50 hücre ölümüne neden olan ilaç dozlarını belirlemek için doz yanıt eğrilerini değerlendirin. Hücre ölümünü indüklemek için ilaç dozunu optimize ettikten sonra, hedef olmayan SG RNA'larını hedef olmayan genlere rastgele atayın.
Seçilen bir kesme stratejisine dayalı olarak düşük sayımlarla SG RNA'larını kesin. Bir dizi NPG değerini değerlendirmek için bir for döngüsü kullanarak net nüfus artış hızına veya NPG'ye yönelik tüm olası bozulmaları simüle edin. Her deneysel tek SG RNA için, gözlemlenen verilere en yakın simüle edilmiş kat değişikliğini eşleştirin ve karşılık gelen nispi büyüme oranını SG RNA'sına atayın.
Daha sonra canlı hücre sayımı verilerinden ölümden önce ilaca bağlı büyüme oranını belirleyin. Büyüme oranını elde etmek için verileri basit bir üstel denkleme sığdırın. Canlı hücre sayımı verilerini ve ilaç derecesi değerlerini birleştirerek ölüm başlangıcından sonra ilaca bağlı büyüme oranını hesaplayın.
Seçilen ilaç dozunun derecesini bir sınıf grafiği üzerinde çizin. İlaca bağlı büyüme ve ölüm oranı arasında deneysel olarak belirlenen koordinasyonu kullanarak, zaman içinde ilaca bağlı popülasyon büyüklüğünü simüle etmek için bir model oluşturun. Daha sonra, NPG, ölüm başlangıcından önce ve sonra ilaca bağlı büyüme oranlarını saatte iki katına çıkaran ve ilaca bağlı ölüm oranını içeren bir Medusa modeli geliştirin.
Başlangıç zaman noktasını sıfır saat olarak ayarlayın ve hem tedavi edilmemiş hem de tedavi edilmiş durumlar için son zaman noktalarını tanımlayın. Temel model için büyüme ve ölüm oranlarındaki tüm olası bozulmaları simüle edin. Her kombinasyon için, tahlil uç noktasında gözlemlenen kat değişikliğinin logaritma tabanı ikisini hesaplayın.
Her SG RNA için, gözlemlenen kıvrım değişikliğini üretecek ilaca bağlı ölüm oranını üçgenleyin. Önceden belirlenmiş nispi büyüme oranını çıkararak başlayın. Ölüm başlangıcından önce ve sonra ilaca bağlı büyüme oranlarını belirleyin.
Ölüm başlangıcından önce ve sonra ilaca bağlı büyüme oranları için orantılı büyüme oranlarını hesaplamak için NPG'den nispi büyüme oranını uygulayın. NPG kısıtlamalarını kullanarak, ölüm başlangıcından önce ve sonra ilaca bağlı büyüme hızı, her SG RNA için gözlemlenen kıvrım değişikliğine en yakın simüle edilmiş kıvrım değişikliğini belirleyin. Kütüphanedeki her gen için gen seviyesi büyüme ve ölüm oranlarını belirleyin.
Tipik olarak 4 ila 10 SG RNA arasında değişen, her bir genle ilişkili tüm SG RNA'ları için ortalama büyüme ve ölüm oranlarını hesaplayın. Ampirik P değerlerini hesaplamak için, SG RNA seviyesi verilerini önyükleyin ve Benjamin Hochberg prosedürünü kullanarak yanlış bir keşif oranı düzeltmesi uygulayın. U2 OS hücrelerinin fraksiyonel canlılığı, 96 saat sonra beş mikromolar etopositte gözlenen yaklaşık% 50 ölümcüllük ile doza bağlı bir şekilde azalmıştır.
İyileşen popülasyon büyüklüğü, beş mikromolar etoposite dört gün maruz kaldıktan sonra %40 ila %50 oranında azaldı ve ilaç tedavisi sırasında hücre ölümünü doğruladı. Derece analizi, beş mikromolar etopositin büyüme hızında önemli bir azalmaya neden olduğunu ve hücre ölümünün ancak tam büyüme durmasından sonra başladığını öngördü. Medusa analizi, XRCC beş nakavt hücresinin tedavi edilmeyen koşullarda yavaş büyüme ve etoposid tedavisi altında ilaca bağlı yüksek ölüm oranları gösterdiğini ortaya koydu.
Doğrulama deneyleri, XRCC 5 nakavt hücrelerinin tedavi edilmeyen koşullarda daha yavaş büyüme gösterdiğini ve Medusa tahminleriyle uyumlu olarak etoposid altında yüksek ölüm oranları sergilediğini doğruladı.
