Nosso programa de pesquisa está focado em entender como as diferentes formas de morte celular são reguladas. Geralmente estudamos a morte celular no contexto de terapias contra o câncer com o objetivo de aprender como as drogas funcionam para ativar a morte celular e como tornar essas respostas melhores e mais específicas. Está se tornando cada vez mais claro que existem muitos tipos diferentes de morte celular regulada.
O campo identificou atualmente pelo menos 14 tipos mecanicamente distintos de morte. A maioria deles causa uma morte morfologicamente necrótica e, em geral, sabemos muito pouco sobre como essas vias funcionam. Uma maneira eficaz de estudar a regulação da morte celular é usar a genômica funcional.
Em outras palavras, perturbar sistematicamente cada gene e determinar como essas perturbações afetam a morte celular. Quando realizado no contexto de drogas, Isso é chamado de perfil quimiogenético. As triagens quimiogenéticas geralmente avaliam como os nocautes genéticos afetam o tamanho final da população.
No entanto, o tamanho da população pode ser influenciado por mudanças na taxa de crescimento, na taxa de mortalidade ou em ambas. Os métodos de triagem atuais não conseguem identificar genes reguladores de morte devido aos efeitos confinantes da variação da taxa de crescimento. Medusa usa simulações da resposta ao medicamento para modelar como a mudança na taxa de crescimento ou na taxa de mortalidade influencia o tamanho final da população.
Essas simulações nos permitem extrair a taxa de mortalidade induzida por drogas para cada gene na tela e remover outros fatores de confusão Para começar, células em placas pretas de fundo transparente com 96 poços em densidades de semeadura entre 1500 e 5.000 células por poço. Incube as placas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e umidade por 16 a 24 horas. Preparar a diluição do fármaco em meios contendo a concentração de citotox, otimizada previamente.
Lice uma placa usando Triton X na concentração otimizada. Em seguida, coloque a placa no leitor de placas e meça a fluorescência do citotox nas placas experimentais em T0 usando as configurações otimizadas e, em seguida, em um ponto de tempo posterior adequado. Após o ponto de tempo final, ligue as placas experimentais usando Triton X para determinar o tamanho final da população de cada condição.
Calcule a viabilidade fracionária usando os dados do endpoint e ajuste os resultados às curvas de resposta à dose. Avalie as curvas de resposta à dose para identificar doses de medicamentos que induzam aproximadamente 50% de morte celular. Depois de otimizar a dose do medicamento para induzir a morte celular, atribua aleatoriamente RNAs SG não-alvo a genes não-alvo.
Corte RNAs SG com contagens baixas com base em uma estratégia de corte escolhida. Simule todas as perturbações possíveis para a taxa líquida de crescimento populacional ou NPG usando um loop for para avaliar um intervalo de valores de NPG. Para cada RNA SG experimental único, combine a mudança de dobra simulada mais próxima dos dados observados e atribua a taxa de crescimento relativa correspondente ao RNA SG.
Em seguida, determine a taxa de crescimento induzida por drogas antes da morte a partir de dados de contagem de células vivas. Ajuste os dados a uma equação exponencial simples para derivar a taxa de crescimento. Calcule a taxa de crescimento induzida por drogas após o início da morte combinando os dados de contagem de células vivas e os valores de grau da droga.
Plote o grau para a dose de medicamento selecionada em um gráfico de notas. Usando a coordenação determinada experimentalmente entre o crescimento induzido por drogas e a taxa de mortalidade, crie um modelo para simular o tamanho da população induzida por drogas ao longo do tempo. Em seguida, desenvolva um modelo Medusa que inclua NPG, taxas de crescimento induzidas por drogas antes e depois do início da morte em duplicações por hora e a taxa de mortalidade induzida por drogas.
Defina o ponto de tempo inicial em zero horas e defina os pontos de tempo finais para condições não tratadas e tratadas. Simule todas as perturbações possíveis nas taxas de crescimento e mortalidade para o modelo de linha de base. Para cada combinação, calcular a base logarítmica dois da alteração de dobras observada no ponto final do ensaio.
Para cada RNA SG, triangule a taxa de mortalidade induzida por drogas que produziria a mudança de dobra observada. Comece extraindo a taxa de crescimento relativa predeterminada. Determine as taxas de crescimento induzido por drogas antes e depois do início da morte.
Aplique a taxa de crescimento relativo do NPG para calcular as taxas de crescimento proporcionais para as taxas de crescimento induzidas por drogas antes e depois do início da morte. Usando as restrições para NPG, taxa de crescimento induzida por drogas antes e depois do início da morte, identifique a mudança de dobra simulada mais próxima da mudança de dobra observada para cada RNA SG. Determine o crescimento do nível do gene e as taxas de mortalidade para cada gene na biblioteca.
Calcule as taxas médias de crescimento e mortalidade para todos os RNAs SG associados a cada gene, normalmente variando de 4 a 10 RNAs SG. Para calcular os valores empíricos de P, inicialize os dados de nível de RNA SG e aplique uma correção de taxa de descoberta falsa usando o procedimento de Benjamin Hochberg. A viabilidade fracionada das células U2 OS diminuiu de maneira dependente da dose, com aproximadamente 50% de letalidade observada em cinco etoposídeos micromolares após 96 horas.
O tamanho da população recuperada diminuiu de 40% a 50% após quatro dias de exposição a cinco etoposídeos micromolares, confirmando a morte celular durante o tratamento medicamentoso. A análise de grau projetou que cinco etoposídeo micromolar causaram uma redução significativa na taxa de crescimento com a morte celular iniciada somente após a parada completa do crescimento. A análise da Medusa revelou que as cinco células knockout do XRCC mostraram crescimento lento em condições não tratadas e altas taxas de mortalidade induzida por drogas sob tratamento com etoposídeo.
Experimentos de validação confirmaram que as células knockout para XRCC 5 exibiram crescimento mais lento em condições não tratadas e taxas de mortalidade elevadas sob etoposídeo, alinhando-se com as previsões da Medusa.
