Notre programme de recherche vise à comprendre comment les différentes formes de mort cellulaire sont régulées. Nous étudions généralement la mort cellulaire dans le contexte des thérapies anticancéreuses dans le but d’apprendre comment les médicaments fonctionnent pour activer la mort cellulaire et comment rendre ces réponses meilleures et plus spécifiques. Il devient de plus en plus clair qu’il existe de nombreux types différents de mort cellulaire régulée.
À l’heure actuelle, le domaine a permis d’identifier au moins 14 types de décès distincts sur le plan mécaniste. La plupart d’entre eux provoquent une mort morphologiquement nécrotique et, en général, nous savons très peu de choses sur le fonctionnement de ces voies. Une façon efficace d’étudier la régulation de la mort cellulaire est d’utiliser la génomique fonctionnelle.
En d’autres termes, perturber systématiquement chaque gène et déterminer comment ces perturbations affectent la mort cellulaire. Lorsqu’il est effectué dans le contexte de médicaments, on parle de profilage chimiogénétique. Les dépistages chimiogénétiques évaluent généralement comment les désactivations de gènes affectent la taille finale de la population.
Cependant, la taille de la population peut être influencée par les changements dans le taux de croissance, le taux de mortalité ou les deux. Les méthodes de dépistage actuelles ne permettent pas d’identifier les gènes régulateurs de la mort en raison des effets limitatifs de la variation du taux de croissance. Medusa utilise des simulations de la réponse médicamenteuse pour modéliser comment la modification du taux de croissance ou du taux de mortalité influence la taille finale de la population.
Ces simulations nous permettent d’extraire le taux de mortalité induit par le médicament pour chaque gène du crible et d’éliminer d’autres facteurs de confusion. Pour commencer, les cellules en plaques noires et les plaques à fond transparent de 96 puits à des densités d’ensemencement comprises entre 1500 et 5 000 cellules par puits. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et d’humidité pendant 16 à 24 heures. Préparer la dilution du médicament dans des milieux contenant la concentration de cytotox, optimisée précédemment.
Licez une plaque en utilisant Triton X à la concentration optimisée. Placez ensuite la plaque dans le lecteur de plaques et mesurez la fluorescence du cytotox dans les plaques expérimentales à T0 en utilisant les paramètres optimisés, puis à un moment ultérieur approprié. Après le dernier point temporel, lyce les plaques expérimentales ont utilisé Triton X pour déterminer la taille finale de la population de chaque condition.
Calculez la viabilité fractionnelle à l’aide des données du paramètre et ajustez les résultats aux courbes dose-réponse. Évaluer les courbes dose-réponse pour identifier les doses de médicament qui induisent environ 50 % de mort cellulaire. Après avoir optimisé la dose de médicament pour induire la mort cellulaire, attribuez au hasard des ARN SG non cibles à des gènes non cibles.
Coupez les ARN SG avec un faible nombre en fonction d’une stratégie de coupure choisie. Simulez toutes les perturbations possibles du taux de croissance nette de la population ou NPG à l’aide d’une boucle for pour évaluer une plage de valeurs NPG. Pour chaque ARN SG expérimental, associez le changement de pli simulé le plus proche des données observées et attribuez le taux de croissance relatif correspondant à l’ARN SG.
Déterminez ensuite le taux de croissance induit par le médicament avant la mort à partir des données de comptage de cellules vivantes. Ajustez les données à une équation exponentielle simple pour calculer le taux de croissance. Calculez le taux de croissance induit par le médicament après le début de la mort en combinant les données de comptage des cellules vivantes et les valeurs de qualité du médicament.
Tracez le grade de la dose de médicament sélectionnée sur un graphique de grade. À l’aide de la coordination déterminée expérimentalement entre la croissance et le taux de mortalité induits par les médicaments, créez un modèle pour simuler la taille de la population induite par les médicaments au fil du temps. Ensuite, élaborez un modèle Medusa qui inclut la NPG, les taux de croissance induits par le médicament avant et après le début de la mort en doublant par heure et le taux de mortalité induit par le médicament.
Définissez le point de départ à zéro heure et définissez les points finaux pour les conditions non traitées et traitées. Simulez toutes les perturbations possibles des taux de croissance et de mortalité pour le modèle de référence. Pour chaque combinaison, calculer le logarithme en base deux de la variation de pli observée au point final du dosage.
Pour chaque ARN SG, triangulez le taux de mortalité induit par le médicament qui produirait le changement de pli observé. Commencez par extraire le taux de croissance relatif prédéterminé. Déterminer les taux de croissance induits par le médicament avant et après le début de la mort.
Appliquez le taux de croissance relatif de la NPG pour calculer les taux de croissance proportionnels des taux de croissance induits par le médicament avant et après le début de la mort. À l’aide des contraintes de la NPG, le taux de croissance induit par le médicament avant et après le début de la mort, identifiez le changement de pli simulé le plus proche du changement de pli observé pour chaque ARN SG. Déterminez les taux de croissance et de mortalité au niveau des gènes pour chaque gène de la bibliothèque.
Calculez les taux de croissance et de mortalité moyens de tous les ARN SG associés à chaque gène, allant généralement de 4 à 10 ARN SG. Pour calculer des valeurs P empiriques, amorcez les données de niveau d’ARN SG et appliquez une correction du taux de fausses découvertes à l’aide de la procédure de Benjamin Hochberg. La viabilité fractionnée des cellules U2 SG a diminué de manière dose-dépendante avec une létalité d’environ 50 % observée à cinq micromolaires d’étoposide après 96 heures.
La taille de la population rétablie a diminué de 40 à 50 % après quatre jours d’exposition à cinq micromolaires d’étoposide, confirmant la mort cellulaire pendant le traitement médicamenteux. L’analyse des grades a révélé que cinq micromolaires d’étoposide provoquaient une réduction significative du taux de croissance, la mort cellulaire ne commençant qu’après un arrêt complet de la croissance. L’analyse de Medusa a révélé que les cinq cellules knock-out du XRCC présentaient une croissance lente dans des conditions non traitées et des taux élevés de mortalité induite par le médicament sous traitement à l’étoposide.
Les expériences de validation ont confirmé que les cellules knock-out XRCC 5 présentaient une croissance plus lente dans des conditions non traitées et des taux de mortalité élevés sous étoposide, ce qui correspond aux prédictions de Medusa.
