Il nostro programma di ricerca è focalizzato sulla comprensione di come vengono regolate le diverse forme di morte cellulare. Generalmente studiamo la morte cellulare nel contesto delle terapie antitumorali con l'obiettivo di apprendere come funzionano i farmaci per attivare la morte cellulare e come rendere queste risposte migliori e più specifiche. Sta diventando sempre più chiaro che esistono molti tipi diversi di morte cellulare regolata.
Il campo ha attualmente identificato almeno 14 tipi di morte meccanicisticamente distinti. La maggior parte di questi causa una morte morfologicamente necrotica e, in generale, sappiamo molto poco su come funzionano questi percorsi. Un modo efficace per studiare la regolazione della morte cellulare è utilizzare la genomica funzionale.
In altre parole, per perturbare sistematicamente ogni gene e determinare come queste perturbazioni influenzano la morte cellulare. Quando viene eseguito nel contesto di farmaci, Questo è chiamato profilo chemiogenetico. Gli screening chemiogenetici in genere valutano il modo in cui i knockout genici influenzano la dimensione finale della popolazione.
Tuttavia, la dimensione della popolazione può essere influenzata da cambiamenti nel tasso di crescita, nel tasso di mortalità o in entrambi. Gli attuali metodi di screening non riescono a identificare i geni regolatori della morte a causa degli effetti limitanti della variazione del tasso di crescita. Medusa utilizza simulazioni della risposta ai farmaci per modellare come la variazione del tasso di crescita o del tasso di mortalità influenzi la dimensione finale della popolazione.
Queste simulazioni ci permettono di estrarre il tasso di mortalità indotto da farmaci per ogni gene nello schermo e di rimuovere altri fattori confondenti. Per iniziare, le cellule piastrellate in piastre nere a fondo chiaro da 96 pozzetti a densità di semina comprese tra 1500 e 5.000 cellule per pozzetto. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e umidità per 16-24 ore. Preparare la diluizione del farmaco in terreni contenenti la concentrazione di citotos, ottimizzata in precedenza.
Lyce una piastra utilizzando Triton X alla concentrazione ottimizzata. Quindi posizionare la piastra nel lettore di piastre e misurare la fluorescenza della citotostra nelle piastre sperimentali a T0 utilizzando le impostazioni ottimizzate, quindi in un momento successivo adatto. Dopo l'ultimo punto di tempo, le piastre sperimentali utilizzano Triton X per determinare la dimensione finale della popolazione di ciascuna condizione.
Calcola la vitalità frazionaria utilizzando i dati del punto finale e adatta i risultati alle curve dose-risposta. Valutare le curve dose-risposta per identificare le dosi di farmaci che inducono circa il 50% di morte cellulare. Dopo aver ottimizzato la dose del farmaco per indurre la morte cellulare, assegnare in modo casuale gli RNA SG non bersaglio ai geni non bersaglio.
Tagliare gli RNA SG con conteggi bassi in base a una strategia di cutoff scelta. Simula tutte le possibili perturbazioni del tasso di crescita netto della popolazione o NPG utilizzando un ciclo for per valutare un intervallo di valori NPG. Per ogni singolo SG RNA sperimentale, abbinare la variazione di piega simulata più vicina ai dati osservati e assegnare il corrispondente tasso di crescita relativo all'SG RNA.
Quindi determinare il tasso di crescita indotto dal farmaco prima della morte dai dati di conteggio delle cellule vive. Adatta i dati a una semplice equazione esponenziale per derivare il tasso di crescita. Calcola il tasso di crescita indotto dal farmaco dopo l'insorgenza della morte combinando i dati di conteggio delle cellule vive e i valori del grado del farmaco.
Tracciare il grado per la dose di farmaco selezionata su un grafico di grado. Utilizzando il coordinamento determinato sperimentalmente tra la crescita indotta dai farmaci e il tasso di mortalità, crea un modello per simulare le dimensioni della popolazione indotta dai farmaci nel tempo. Quindi sviluppare un modello Medusa che includa NPG, tassi di crescita indotti da farmaci prima e dopo l'insorgenza della morte in raddoppi all'ora e il tasso di mortalità indotta da farmaci.
Impostare il punto temporale iniziale su zero ore e definire i punti temporali finali sia per le condizioni non trattate che per quelle trattate. Simula tutte le possibili perturbazioni dei tassi di crescita e mortalità per il modello di base. Per ciascuna combinazione, calcolare il logaritmo in base due della variazione di piega osservata al punto finale del saggio.
Per ogni RNA SG, triangolare il tasso di mortalità indotto dal farmaco che produrrebbe il cambiamento di piega osservato. Inizia estraendo il tasso di crescita relativo predeterminato. Determinare i tassi di crescita indotta da farmaci prima e dopo l'insorgenza della morte.
Applicare il tasso di crescita relativo dell'NPG per calcolare i tassi di crescita proporzionali per i tassi di crescita indotti da farmaci prima e dopo l'insorgenza della morte. Utilizzando i vincoli per NPG, il tasso di crescita indotto dal farmaco prima e dopo l'insorgenza della morte, identificare il cambiamento di piega simulato più vicino al cambiamento di piega osservato per ciascun RNA SG. Determina il livello genico, la crescita e i tassi di mortalità per ciascun gene nella libreria.
Calcola i tassi medi di crescita e mortalità per tutti gli RNA SG associati a ciascun gene, in genere da 4 a 10 RNA SG. Per calcolare i valori empirici di P, avviare i dati a livello di RNA SG e applicare una correzione del tasso di falsa scoperta utilizzando la procedura di Benjamin Hochberg. La vitalità frazionaria delle cellule OS U2 è diminuita in modo dose-dipendente con circa il 50% di letalità osservata a cinque micromolari di etoposide dopo 96 ore.
La popolazione recuperata è diminuita dal 40% al 50% dopo quattro giorni di esposizione a cinque micromolari di etoposide, confermando la morte cellulare durante il trattamento farmacologico. L'analisi dei gradi ha proiettato che cinque etoposide micromolari hanno causato una riduzione significativa del tasso di crescita con la morte cellulare iniziata solo dopo il completo arresto della crescita. L'analisi di Medusa ha rivelato che le cinque cellule knockout XRCC hanno mostrato una crescita lenta in condizioni non trattate e alti tassi di mortalità indotta da farmaci durante il trattamento con etoposide.
Gli esperimenti di validazione hanno confermato che le cellule knockout XRCC 5 hanno mostrato una crescita più lenta in condizioni non trattate e tassi di mortalità elevati sotto etoposide, in linea con le previsioni di Medusa.
