Bu protokolün genel amacı, genel mRNA birleştirme değişikliklerini değerlendirmek için minigene E1A2'yi kullanmak için ayrıntılı rehberlik sağlamaktır. Bu, özel rejimlere veya laboratuvar koşullarına gerek kalmadan alternatif birleştirme düzenlemesinde hedef proteinin işlevini değerlendirmek için hızlı, ucuz ve basit bir araçtır. HEK 293 hücrelerini ilgi geninin kararlı ifadesiyle kült ederek başlayın.
Hücreleri % 0.25 tripsin EDTA kullanarak bölün, ardından altı kuyu plakalarında kuyu başına 300.000 hücreyi plakalayın ve% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede 24 saat kuluçkaya yatırın. 24 saat sonra, izdihamı kontrol edin ve HEK 293 kararlı hücrelerini sadece% 70 ila% 80 birleştiğinde transfect edin. Hücre kültürü ortamını bir pipetle dikkatlice çıkarın, ardından antibiyotiksiz iki mililitre tam DMEM ortamı ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.
Transfeksiyon tamponu ile bir tüp hazırlayın, ardından iki mikrogram pMTE1A DNA, girdap ekleyin ve iki mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Vortex tekrar ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatır. Plakaları inkübatörden çıkarın ve transfeksiyon karışımını damla açısından dikkatlice ekleyin.
Transfeksiyondan altı saat sonra, Nek4 ekspresyon indüksiyonu için HEK 293 kararlı hücrelerine tetrasiklin ekleyin. Transfeksiyondan 24 saat sonra, floresan mikroskop kullanarak hücre morfolojisini ve transfeksiyon verimliliğini doğrulayın. Hücre kültürü ortamını çıkarmak için bir pipet kullanın, ardından kemoterapötiklerle hücre kültürü ortamı ekleyin.
Hücreleri 24 saat daha kuluçkaya yatır. RNA toplamak için hücre kültürü ortamını atın ve doğrudan kuyuya 0,5 ila 1 mililitre RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin. Kuyular çok uyumluysa, RNA kalitesini artırmak için bir mililitre RNA ekstraksiyon reaktifi kullanın.
Hücreleri bir pipetle homojenize edin ve 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hemen RNA ekstraksiyonuna devam edin veya örnekleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Numuneleri duman kaputunda çözün ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın.
0,1 ila 0,2 mililitre kloroform ekleyin ve kuvvetlice ajite edin, ardından oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın. 12.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüj, daha sonra üst sulu fazı toplayın ve yeni bir 1,5 mililitre santrifüj tüpüne aktarın. Toplam hacmin yaklaşık% 60'ını toplayın, ancak DNA'yı veya organik fazı toplamayın.
0,25 ila 0,5 mililitre izopropanol ekleyin ve numuneyi dört kez ters çevrilerek ajite edin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın, sonra dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 12.000 kez G'de santrifüjleyin ve üstnatantı atın. RNA peletini etanol ile iki kez yıkayın ve beş dakika boyunca 7.500 kez G'de santrifüjleyin, sonra etanol atın.
Tüpü bir kağıt havlu üzerinde ters çevirerek fazla etanol çıkarın, ardından peleti beş ila 10 dakika boyunca kısmen kurutmak için tüpü bir duman kaputunun içinde açık bırakın. RNA peletini 15 mikrolitre DEPC arıtılmış suda yeniden askıya alın. Toplam RNA'yı ölçün ve absorbansı 230, 260 ve 280 nanometre olarak ölçerek RNA kalitesini doğrulayın.
Toplam RNA kalitesini doğrulamak için, 30 dakika boyunca %2,5 sodyum hipoklorit çözeltisinin %1,2'si ile önceden tedavi edilmiş %1 agarose jel çalıştırın. Toplam RNA'nın bir ila iki mikrogramını kullanarak cDNA sentezi gerçekleştirin. RNA, bir mikroligo d-T mikrolitresi, bir mikrolitre DNTP ve nükleaz içermeyen suyu 12 mikrolitreye birleştirin.
Termo Cycler'daki reaksiyona 65 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatır. Termo Cycler'dan numuneleri çıkarın ve dört mikrolitre ters transkriptaz tamponu, iki mikrolitre DTT ve bir mikrolitre ribonikleaz inhibitörü ekleyin. İki dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yaslanın.
Bir mikroliter termo-kararlı ters transkriptaz ekleyin ve 50 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Enzimi 70 santigrat derecede 15 dakika boyunca etkisiz hale getir. Metin el yazmasında açıklandığı gibi PCR yapın, ardından pcr ürününün 20 ila 25 mikrolitresini nükleik asit lekesi içeren% 3 agarose jel üzerine yükleyin ve yaklaşık bir saat boyunca 100 voltta çalıştırın.
Herhangi bir bant doygunluğundan kaçınarak jeli fotoğraflayın ve bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bantları ölçün. 631, 493 ve 156 baz çiftlerindeki bantlar sırasıyla 13S, 12S ve 9S izoformlarına karşılık gelir. Yazılımın Dosya menüsünden görüntü dosyasını açın ve gri ölçeğe dönüştürün.
Parlaklık ve Kontrast'ı ayarlayın, ardından gerekirse aykırı paraziti giderin. Dikdörtgen seçim aracıyla ilk şeridin etrafına bir dikdörtgen çizin ve Analiz Et, Jeller ve İlk Şeridi Seç komutundan veya klavye kısayolunu kullanarak seçin. İlk şeritteki dikdörtgenin ortasında tıklatıp tutmak için fareyi kullanın ve bir sonraki şeride sürükleyin.
Analiz Et, Gel'ler'e gidin ve Sonraki Şeridi Seç'i seçin. Kalan tüm şeritler için bu adımı yineleyin. Tüm şeritler vurgulandıktan ve numaralandıktan sonra, her şeridin bir profil grafiğini çizmek için Analiz, Jeller ve Çizim Şeritleri'ne gidin.
Arka plan gürültüsünü dışarıda bırakarak her bir banta karşılık gelen her tepenin tabanı boyunca bir çizgi çizmek için düz çizgi seçim aracını kullanın. Her şeritten tüm tepeler kapatıldıktan sonra, asa aracını seçin ve her tepenin içini tıklayın. Ölçümler, vurgulanan her tepe için sonuçlar penceresinde açılmalıdır.
Yalnızca 631, 493 ve 156 baz çift bantlarına karşılık gelen 13S, 12S ve 9S zirvelerini göz önünde bulundurun. Elektronik tablo düzenleyicisi için yoğunluk verilerini kopyalayın ve her örnek için üç banttan da yoğunluğu toplayın, ardından her izoform için toplam göre yüzdeyi hesaplayın. Her izoformun yüzdelerini veya tedavi edilmemiş örneklere göre yüzdedeki farkları çizin.
Üretilen her izoformdan mRNA oranını değerlendirerek alternatif birleştirme üzerindeki etkiyi gözlemlemek için E1A'dan minigene içeren bir plazmid kullanılmıştır. E1A izoformlarının bazal ekspresyolü, E1A ekspresyonunun hücre çizgisine ve zamanına bağlı olarak ortaya çıktı. HEK 293 stabil hücre hattı veya HEK 293 rekombinaz içeren bölge, HeLa hücrelerine kıyasla daha yüksek bir 13S ifadesi gösterdi, ancak 48 saatlik E1A ifadesinden sonra benzer 13S ve 12S izoform seviyeleri gösterdi.
Cisplatin'e maruz kalan hücreler, 12S ekspresyondan yana beş asal S-S birleştirme seçiminde bir kayma gösterdi. Bu etki HEK 293'te Bayrak boş vektörü ve Nek4'ün isoform'larını kasten ifade ederken gözlenmiştir. Paclitaxel tedavisinden sonra alternatif birleştirmedeki değişiklikler çok gizliydi, ancak değişikliklerin yönleri Flag ve Nek4 eksprese hücrelerinde zıttı.
Bu protokolü gerçekleştirirken, özellikle HEK 293 hücrelerini kullanırken endojen E1A ifadesiyle yanlış yorumlamayı önlemek için transtransfected ve ters olmayan transkriptaz kontrolleri kullanmak önemlidir. Olumlu sonuçlar alındıktan sonra kemoterapötik yanıtla ilgili spesifik genlerin alternatif biriktiği değerlendirilebilir. Bazı etkiler gözlendiğinde, bu basit protokol, proteinin örneğin kemoterapi yanıtında alternatif birleştirmeyi düzenleyen bir rol oynadığı daha tutarlı yollar için bu çalışmaları yönlendirebilir.
