Biz tüm Caldwell Lab üyeleri işbirliği ruhu kabul etmek istiyoruz. Dimes, Mart ve Ulusal Bilim Vakfı GAC KARİYER Ödülü Basil O&#39;Connor Scholar Ödülü yanı sıra, Alabama Üniversitesi ile Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Araştırma Lisans Programı Hibe, nöronal uyarılabilirliği ve finanse Caldwell Lab epilepsi araştırma.

Aldicarb Pozlama paradigması <ol><li> İlk gün, her genotip ve her çoğaltmak en az otuz genç yetişkin aşamada solucanlar aldicarb testlerin ikinci gününde kullanılabilir olmasını sağlamak. E. içeren taze NGM plakalar üzerine elli veya daha fazla L4 aşamada solucanlar (en iyi nystatin olmadan), bir deneyci seçerse en iyisidir bir besin kaynağı olarak coli (tercihen OP50), tutarlı ve müsamahakar sıcaklığında (20 ° C - 22 ° C 25 ° C tamam olmasına rağmen, en iyi), 12-24 saat boyunca onları büyümeye </li><li> Ikinci gününde,% 70 etanol (EtOH) ve% 30 GKD 2 O. aldicarb 100 mM stok solüsyonu Istenen aldicarb konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda aldicarb tanımlanan hacimli NGM eksi nistatin plakalar üzerine sürün. Biz sürekli olarak 7.5 ml NGM plakalar üzerine kaplama ile 100 mM aldicarb 37.5 mcL 0.5 mM aldicarb kullanabilirsiniz. Aldicarb plakaları oda sıcaklığında yaklaşık 30-60 dakika kurumasını bekleyin. Bu kapaklar çatlak için gerekli değildir. Alternatif olarak, aldicarb NGM eklendi ve 4 ° C de bir hafta boyunca saklanan olabilir. &nbsp;</li><li> E. kurutma, plaka tutarlı hacimleri sonra Her aldicarb plaka merkezi ve başka bir 30-60 dakika oda sıcaklığında kuru üzerine coli (tercihen OP50). Biz sürekli aşırı kalabalık olmayan, küçük bir noktada yoğunlaşmış solucanlar tutmak için yeterli büyüklükte bir gıda çim oluşturur plaka OP50 25 mcL. &nbsp;</li><li> Gıda çim kuru olduğunda, bir aldicarb deneyleri ile devam edebilir. Aldicarb deneyleri öznel doğası nedeniyle, son derece deneyleri &quot;körü körüne&quot; yapılması tavsiye edilir. Birincil deneyci bir meslektaşım çalışılmalıdır solucanlar orijinal plakaları yeniden-etiket. Aynı şekilde, iş arkadaşı, bir zamanlayıcı başlamadan hemen önce, orijinal plakalardan şifreli aldicarb plakaları solucanlar transfer olabilir. Deneyci solucanlar gibi uncoordination gibi karakteristik bir fenotip, belirli bir gerginlik assaying öngörüyor, sonra da orada yanlılığı azaltmak için benzer bir fenotip bir kontrol edilmelidir. Dahası, deneyci deneyleri deneyler standardize yardımcı paralel yabani tip bir gerginlik yanı sıra dirençli ve aşırı duyarlı bir gerginlik, eğer en iyisidir. Deneyci solucanlar her çoğaltmak için tutarlı bir analiz etmek için gayret göstermelisiniz. Biz sürekli olarak her çoğaltmak için tek bir genotip otuz solucanlar analiz eder. Biz de en az üç gerçekleştirin her bir deney için çoğaltır. Deneyimli bir deneyci bir defada en az altı suşları analiz etmek gerekir. &nbsp;</li><li> Tutarlı bir şekilde dürtüsüyle bir platin tel ile her solucan felç solucanlar sayısını. Biz iki kez baş ve kuyruk üç saat olmak üzere toplam her 30 dakikada iki kez sürekli solucanlar eşya. Faringeal pompalama durması da deneyci, tüm çalışmalar boyunca felç tutarlı bir tanım istihdam sadece felç tanımlamak için kullanılır, ama olabilir. Ayrıca, özellikle bazı solucanlar, aldicarb karşı dayanıklı bu plaka tarama deneyebilir fazlalaştı. Bu durumda, deneyci aldicarb plakaların etrafında, palmitik asit, solucan lokomosyon fiziksel bir bariyer tutarlı bir miktarda yayılabilir. Biz 10 mg palmitik asit / ml EtOH 25 mcL yayıldı. </li></ol> PTZ Pozlama Paradigma <ol><li> İlk gün, her genotip ve her çoğaltmak en az otuz genç yetişkin aşamada solucanlar ikinci gününde PTZ testleri için kullanılabilir olmasını sağlamak. E. içeren taze NGM plakalar üzerine elli veya daha fazla L4 aşamada solucanlar (en iyi nystatin olmadan), bir deneyci seçerse en iyisidir bir besin kaynağı olarak coli (tercihen OP50), tutarlı ve müsamahakar sıcaklığında (20 ° C - 22 ° C 25 ° C tamam olmasına rağmen, en iyi), 12-24 saat boyunca onları büyümeye </li><li> Ikinci gününde, PTZ 0.5 g PTZ / ml GKD 2 O stok solüsyonu olun. PTZ uygun miktarda, istenilen PTZ konsantrasyonları elde etmek için tanımlanmış hacimli NGM eksi nistatin plakalar üzerine sürün. PTZ için doz-yanıt deneyleri tercih Çünkü plaka 7.5 mL NGM plakalar üzerine PTZ değişen miktarlarda. Örneğin, bir plaka PTZ stok solüsyonu 7.5 ml NGM tabağa mcL 37.5, 5 mg PTZ / ml çözüm haline getirmektedir. PTZ plakaları oda sıcaklığında yaklaşık 60-120 dakika kurumasını bekleyin. Bu kapaklar çatlak için gerekli değildir. Alternatif olarak, PTZ NGM direkt olarak ilave edilebilir, ancak hemen katılaşmadan sonra deneyleri için kullanılmalıdır. PTZ istikrarı aldicarb bu çok daha az. Bu nedenle, eski PTZ plakaları ile testlerin daha az güvenilir. PTZ kullanmadan önce kurutucu bir desikatöre -20 ° C&#39;de muhafaza edilmelidir. Biz istikrarı sağlamak için açtıktan sonra yaklaşık iki ay PTZ atmak için tercih ediyor. </li><li> E. kurutma, plaka tutarlı hacimleri sonra coli (tercihen OP50)Her PTZ plaka ve başka bir 30-60 dakika oda sıcaklığında kuru merkezi üzerine. Biz sürekli aşırı kalabalık olmayan, küçük bir noktada yoğunlaşmış solucanlar tutmak için yeterli büyüklükte bir gıda çim oluşturur plaka OP50 25 mcL. &nbsp;</li><li> Gıda çim kuru olduğunda, bir PTZ testleri devam edebilir. PTZ testleri aldicarb testleri daha az öznel olmakla birlikte, hala çok deneyleri &quot;körü körüne&quot; yapılması tavsiye edilir. Birincil deneyci bir meslektaşım çalışılmalıdır solucanlar orijinal plakaları yeniden-etiket. Aynı şekilde, iş arkadaşı, bir zamanlayıcı başlamadan hemen önce orijinal plakalardan şifrelenmiştir PTZ plakaları solucanlar transfer olabilir. Deneyci solucanlar gibi uncoordination gibi karakteristik bir fenotip, belirli bir gerginlik assaying öngörüyor, sonra da orada yanlılığı azaltmak için benzer bir fenotip bir kontrol edilmelidir. Ayrıca, deneyci deneyleri deneyler standardize yardımcı paralel ön veya tam vücut konvülsiyonlar ile yabani tip gerginlik yanı sıra suşları, eğer iyi olur. Deneyci solucanlar her çoğaltmak için tutarlı bir analiz etmek için gayret göstermelisiniz. Biz sürekli olarak her çoğaltmak için tek bir genotip otuz solucanlar analiz eder. Biz de en az üç gerçekleştirin her bir deney için çoğaltır. Deneyimli bir deneyci bir defada en az üç tür analiz etmek gerekir. Ancak, solucanlar ilaç gelmesini felç olmak veya bazı durumlarda, PTZ ile indüklenen maruz kalma 15-30 dakika arasında genellikle tepe konvülsiyonlar ve sıklığını ve şiddetini zayıflatmak. </li><li> Toplam bir saatlik bir &quot;sara gibi&quot; solucanlar çırpınan her 30 dakika sayısını. Solucanlar sayısı tam vücut konvülsiyonlar, tam vücut felç, &quot;tonik&quot; diyoruz, ya da bir kombinasyonu ile ayrı ayrı &quot;kafa kafaya bobs&quot; diyoruz ön konvülsiyonlar, solucanlar sayısını skor iyi , &quot;tonik-klonik&quot; diyoruz BWM felç anterior konvülsiyonlar,. Çoğu tek bir genotip solucanlar konvülsiyon sadece bir tür sergiler. Ancak, tonik-klonik solucanlar genellikle tamamen tonik, bu yüzden tüm solucanlar zaten konvülsiyonlar sergilenmektedir olsa bile bir 30 dakika geçmiş tahlil devam etmelidir. Ayrıca, bazı solucanlar plaka tarama deneyebilir fazlalaştı. Bu durumda, deneyci tutarlı bir PTZ plakaların etrafında palmitik asit miktarı yayılabilir. Biz 10 mg palmitik asit / ml EtOH 25 mcL yayıldı. </li></ol> Aldicarb ve PTZ Seçilmiş C. elegans Sinaptik İletim Mutants Davranış Yanıtları <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> Mutant Adı </th><th> Synaptic Rolü </th><th> İlaç olmayan davranışı </th><th> Aldicarb Davranış Tepki (yabani tip N2 göre) </th><th> PTZ için Davranışsal Tepki </th></tr><tr><td> tom-1 (ok188) </td><td> sinaptik iletim inhibe </td><td> koordinasyonsuz </td><td> gelişmiş felç oranı </td><td> wild-tip ayırt edilemez </td></tr><tr><td> unc-43 (n498n1186) </td><td> karmaşık </td><td> koordinasyonsuz </td><td> gelişmiş felç oranı </td><td> tam vücut konvülsiyonlar </td></tr><tr><td> unc-25 (e156) </td><td> GABA iletim teşvik </td><td> koordinasyonsuz </td><td> gelişmiş felç oranı </td><td> ön konvülsiyonlar, tam vücut felci </td></tr><tr><td> SNB-1 (md247) </td><td> sinaptik iletim teşvik </td><td> koordinasyonsuz </td><td> felç düşük oranda </td><td> ön konvülsiyonlar </td></tr><tr><td> unc-4 (E120) </td><td> ACh iletim teşvik </td><td> koordinasyonsuz </td><td> felç düşük oranda </td><td> wild-tip ayırt edilemez </td></tr></tbody></table> Pentylenetetrazole (PTZ) olarak adlandırılan iki sinir uyarıcı aldicarb denilen bir asetilkolinesteraz inhibitörü ve GABA reseptör antagonisti, C. elegans sinaptik iletim mutantlar karakterize etmek için tamamlayıcı bir şekilde kullanılabilir. Aşırı eksitatör asetilkolin (Ach) solucan vücut duvarı nöromüsküler kavşaklar (NMJs) ACh iletim negatif düzenleyiciler zararlı mutasyonlar birikir (mesela tom-1 ve unc-43) veya inhibitör GABA şanzıman (örneğin, amc-25) pozitif düzenleyiciler. Tersine, solucan NMJs eksitatör ACh düzeyleri, zararlı mutasyonların genel sinaptik iletim (örneğin, SNB-1) veya ACh özel iletim genler (örneğin unc-4) pozitif düzenleyiciler azaldı. Alçaltılmış eksitatör ACh iletim mutant solucanlar aldicarb kaynaklı felç azalmış oranları göstermektedir ise yabani tip N2 solucanlar karşılaştırıldığında, NMJs yükseltilmiş eksitatör ACh şanzıman ile mutant solucanlar, aldicarb kaynaklı felç gelişmiş oranları sergilerler. PTZ, C. elegans vücut duvarı kasları aldicarb aksine nöronal senkronizasyonunu bozan rağmen, PTZ C. elegans baş kasları da inhibitör GABA antagonize. Sonuç olarak, aldicarb hassasiyet, PTZ hassasiyetini doğru tahmin edemez. Negatif ya da pozitif Regul özel kusurları olan Mutant solucanlarACh iletim ation PTZ varlığı yabani tip N2 solucanlar ayırt edilemez, inhibitör GABA iletim sergi sağlam PTZ ile indüklenen ön konvülsiyonlar genel sinaptik iletim ya da belirli kusurlar olumlu yönetmelikte kusurları ile mutant solucanlar ise. Ayrıca, PTZ varlığı unc-43-fonksiyon kaybı mutantlar tam vücut konvülsiyonlar görüntüler ve muhtemelen kendilerine özgü ilaç yanıtları katkıda bulunan ek sinaptik iletim anormallikleri var.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

C ile aldicarb maruziyet için mevcut protokoller elegans mutantlar iki sınıfları aldicarb direnç gösterirler deneyciler, sinaptik iletim genelleştirilmiş açıkları ile ACh iletim ve mutantlar belirli eksiklikler ile mutantlar arasında ayrım izin vermez. Aynı şekilde, aldicarb mutantlar iki sınıfları aldicarb aşırı duyarlılık sergileyen mutantlar olumsuz ACh iletim düzenleyen GABA iletim veya genelleştirilmiş hataları belirli eksiklikler varsa belirlemek için kullanılan olamaz. PTZ maruz deneyler...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

Caenorhabditis elegans, nematod, nörotransmisyon çalışmak için bir çare bir model haline gelmiştir. Sinir sistemi anatomisi ve bağlantı elektron mikrograflar belirlenir ve farmakolojik testlerin rafine olarak C. elegans, hayvan modelleri arasında eşsizdir. Bu video, özellikle C. elegans nöromüsküler kavşaklarda sinyalizasyon karakterize pentylenetetrazole (PTZ) olarak adlandırılan iki tamamlayıcı sinir uyarıcı, aldicarb denilen bir asetilkolinesteraz inhibitörü ve bir gama-amino butirik asit (GABA) reseptör antagonisti, istihdam nasıl tarif (NMJs) ve antagonist nöral devrelerin anlaşılmasını kolaylaştırmak. 302 C. elegans nöronlar, ondokuz GABAerjik D-tipi motor nöronlar innerve vücut duvarı kasları (BWMs), Of iken RMEs adlı dört GABAerjik nöronlar, innerve baş kasları. Tersine, otuz dokuz motor nöronların asetilkolin eksitatör nörotransmitter ifade (ACh) ve GABA iletim lokomosyon koordine etmek BWMs antagonize. Vücut duvarı NMJs GABAerjik ve kolinerjik motor nöronların antagonistik doğa başlangıçta lazer ablasyon tarafından belirlenir ve daha sonra aldicarb maruz tarafından desteklenebilir. Yabani tip solucanlar bir zaman kurs veya doz-yanıt felç Akut aldicarb pozlama sonuçları. Ancak, daha az ACh, solucan NMJs birikir gibi eksitatör ACh iletim kaybı, BWMs az stimülasyonuna yol, aldicarb direnç bahşeder. ACh özel veya genel sinaptik fonksiyon mutantlar aldicarb için direnç görülebilir. GABA antagonistik ve ACh şanzıman, GABA iletim kaybı ya da olumsuz ACh serbest düzenlemek için bir başarısızlık ile tutarlı, aldicarb aşırı duyarlılık bahşeder. Aldicarb maruz aldicarb maruz kalma, çok sayıda solucan homologları nörotransmisyon genlerin izolasyonu yol olmasına rağmen, tek başına verimli özel C. elegans motor nöronların genler ve yollar için geçerli olan rolleri tespit edemez. Bu amaçla, tamamlayıcı bir deneysel yaklaşım, PTZ kullanır girmiştik. Nörotransmisyon mutantlar PTZ yanıt aldicarb-kaynaklı felç farklı açık fenotipleri, gösterir. Wild-tip solucanların yanı sıra, ACh salınımı veya almak için özel Yetersizliklerimizle ile mutantlar, PTZ için belirgin hassasiyet görünmüyor. Bununla birlikte, GABA mutantlar yanı sıra genel sinaptik fonksiyon mutant zaman kurs veya doz duyarlı bir şekilde ön konvülsiyonlar. Genel nörotransmitter serbest olumsuz düzenleyen ve böylece, Mutants PTZ üzerinde felç haline BWMs üzerine ACh aşırı miktarda salgılar. Ayrık mutant sınıfların PTZ ile indüklenen fenotipleri C. elegans aldicarb ve PTZ maruz paradigmalar ile tamamlayıcı bir yaklaşım nörotransmisyon anlayışımız hızlandırmak olduğunu göstermektedir. Ayrıca, biz farmakolojik testlerin nasıl performans gösteren videolar C. elegans araştırma için tutarlı yöntemler oluşturmalıdır.

Watch this Scientific Journal Video about Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants at JoVE.com

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Bu video iki sinir uyarıcı, aldicarb ve pentylenetetrazole (PTZ), nematod, C. elegans sinaptik fonksiyonu çalışma tamamlayıcı yollardan nasıl istihdam göstermektedir. Bu modüle nöronal senkronizasyonu için evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları tamamlayıcı bir yaklaşım da ışık tutmak için kullanılan ve epilepsi ve nöbet etkileri olabilir.

C. elegans Sinaptik İletim Mutants farmakolojik karakterizasyonu için Paradigmalar

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

paradigms-for-pharmacological-characterization-c-elegans-synaptic

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Görüntüleme.  University of Alabama. Bu video iki sinir uyarıcı, aldicarb ve pentylenetetrazole (PTZ), nematod, C. elegans sinaptik fonksiyonu çalışma tamamlayıcı yollardan nasıl istihdam göstermektedir. Bu modüle nöronal senkronizasyonu için evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları tamamlayıcı bir yaklaşım da ışık tutmak için kullanılan ve epilepsi ve nöbet etkileri olabilir.

Video: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

, Epilepsi Mutants Nöbetler Neurocircuit Tahliller Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em&gt; C. elegans</em&gt; Hücreler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Iskemi / reperfüzyon içinde bir anoksisi-açlık Modeli<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Içinde Yara Yanıtları Cilt yaralayarak Yöntemleri ve Testler<em&gt; ° C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...