The authors have no acknowledgements.

필드 1. 면봉 샘플링 <ol><li> 장갑의 깨끗한 쌍을 착용 할 것. </li><li> 측정 테이프자를 사용하여 표면을 만지지 않고 샘플링 에리어의 크기를 측정한다. 가능한 한 정확하게 영역을 추정하고 보고서 양식 (보충 표 1)를 작성하려고합니다. </li><li> 가능한 누출 및 라벨 샘플 수송 가방과 면봉 키트에 대한 면봉 키트를 확인합니다. </li><li> 다음 샘플링 에리어 걸쳐 면봉 이동 : 수평 방향의 하나의 선, 세로 방향으로 하나의 스트로크와, 대각 방향에 하나의 획. 700cm 2보다 표면적이 큰 면봉하지 마십시오. </li><li> 튜브에 각각 면봉을 놓고 안전하게 뚜껑을 조입니다. </li></ol> 실험실에 면봉 2. 보관 및 운송 <ol><li> 최대 48 시간 동안 4 ° C에서 면봉을 유지합니다. 오랜 기간 동안 보관이 필요한 경우, -20 ° C에서 면봉을 저장 (또는 -70 ° C). </li><li> 0-4 ℃에서 튜브를 유지 (즉,. 컬렉션의 24 ~ 48 시간 이내에 실험실 및 선박에 운송 중 절연 된 용기에) 콜드 팩을 사용합니다. </li></ol> 3. 바이러스 농도 바이러스 RNA 추출 및 정제 주 : 달리 명시되지 않는 한 모든 원심 분리 단계는 실온에서 5 분 동안 5,000 XG에서 테이블 탑 원심 분리기를 사용한다. 보편적 인 핵산 추출 (UNEX) 버퍼로 작업 할 때 추가로주의해야합니다. 고글 또는 안면 보호대를 착용하십시오. <ol><li> 한 15 ML의 튜브와 각 샘플에 대해 하나의 RNA 미디 열 레이블. 각 실험에 부정적인 추출 컨트롤을 포함합니다. </li><li> 10 면봉 대한 분해 용액을 제조 PBST 25 mL로 UNEX 완충액 25 ㎖를 혼합하여 (0.02 %를 함유하는 PBS pH를 7.2 트윈 80). </li><li> 용해 액 50 ㎖에 coliphage의 MS2 서스펜션 (10 6 PFU / μL) 50 μL를 추가합니다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 면봉을 넣고 5 ml의 용해 액을 추가합니다. 혼합하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li>10 초 동안 각 튜브와 소용돌이에 5 ml의 100 % 에탄올을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 15 ML의 튜브에서 면봉을 제거 초과 액체를 제거하고 면봉을 폐기 튜브의 측면에 살짝 누르면 (이 UNEX 버퍼를 포함). 나머지 볼륨은 9 ~ 10 mL의 사이에 있어야한다. </li></ol> 4. 미디 열 바이러스 핵산 추출 <ol><li> 조심스럽게 미디 컬럼, 원심 분리기에 단계 3.6에서 4.5 mL의 UNEX / 에탄올 혼합물을 전송하고, 여과 액을 버린다. </li><li> 동일한 열, 원심 분리기에 같은 혼합물로부터 또 다른 4.5 mL로로드하고, 여과 액을 버린다. </li><li> 제 씻지 미디 칼럼, 원심 분리기에 70 % 에탄올 3.5 mL를 추가하고, 여과 액을 버린다. </li><li> 제 씻지 미디 컬럼에 70 % 에탄올의 또 다른 3.5 mL의 추가. 원심 분리기 여과 액을 버리고. </li><li> 건조 스핀를 들어, 에탄올의 모든 흔적을 (부정적인 바이러스 성 RNA 복구에 영향을 미칠 수있는)을 제거하기 위해 미디 열을 원심 분리기. </li><li>새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브의 미디 열을 놓습니다. 미디 칼럼에 250 μL 용출 버퍼를 추가; 가장 높은 바이러스 성 RNA 복구를 얻기 위해 원심 분리하기 전에 1 분 동안 기다립니다. </li><li> -70 ° C에서 추출 된 핵산을 저장하거나 5 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> RNA 깨끗하고 집중 키트를 사용하여 바이러스 핵산의 5 농도 <ol><li> RNA는 10 초 동안 위의 단계 4.7과 와동에 용출 된 RNA의 250 μL에 버퍼를 바인딩의 500 μL를 추가합니다. </li><li> 10 초 동안 750 μL 100 %를 에탄올과 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 각 샘플에 대한 스핀 열 레이블. 스핀 칼럼에 750 μL 샘플을로드합니다. </li><li> 1 분 동안 12,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 1 분 동안 12,000 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기 상에 남아있는 750 μL를로드합니다. </li><li> 프리 워시를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 각 스핀 컬럼 및 원심 분리기 400 μL RNA 준비 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 첫 번째 세척를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 각 스핀 컬럼 및 원심 분리기 800 μL RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 두 번째 세척를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 열 원심 분리기를 회전 400 μL RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오. </li><li> 건조 스핀를 들어, 2 분 동안 12,000 XG에 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거하는 스핀 컬럼을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 스핀 컬럼을 전송합니다. </li><li> 스핀 컬럼 상에 25 μL의 용출 완충액을 첨가하고 실온에서 1 분 동안 배양한다. 이 컬럼으로부터 RNA 바이러스의 회수를 증가시킬 것이다. </li><li> 1 분 동안 10,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리하여 RNA를 수집합니다. </li><li> 어느 -70 ° C에서 RT-qPCR에 (6 단계) 또는 저장 RNA에 직접 진행합니다. </li></ol> 6. 유전자형 I의 Mutiplex RT-qPCR에 탐지 및 II Noroviruses 및 Coliphage MS 2 (보충 표 2) <ol><li> 청소 작업 표면 pipettES,의 RNase의 오염 제거 용액와 원심 분리기는 오염 가능성을 줄일 수 있습니다. </li><li> 얼음에 RT-qPCR에 시약을 녹여. (별도의 영역 / 방에) 얼음에 해동 RNA. </li><li> 반응의 수를 결정하고 적어도 10 % 이상을 추가 (열 반응이 필요한 경우, 예를 들면, 11의 마스터 믹스를 확인). </li><li> 5 초 동안 25 배 RT-qPCR에 효소를 제외 소용돌이 개별 마스터 믹스 구성 요소. 조심스럽게 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 효소를 혼합한다. </li><li> 5 초 동안 간단히 원심 분리기 마스터 믹스 구성 요소. </li><li> 키트 지침에 따라 노로 바이러스 GI과 GII의 실시간 RT-PCR 검출을위한 마스터 믹스를 준비하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관 (보충 표 3)에서 노로 바이러스 특이 적 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 추가합니다. </li><li> 위아래로 5 ~ 10 회 피펫 팅하여 마스터 믹스 믹스 (텍싱하지 않는 것이 좋습니다). 실시간 PCR을 96 웰 플레이트의 각 웰에서의 마스터 믹스를 22 μL 분취. </li><li> 소용돌이 샘플 RNA5 초 동안, 그리고 짧은 (5 초) 원심 분리하여 수집합니다. </li><li> RT-qPCR에 판 (표 2에서 템플릿을 따라)에 샘플 RNA와 GI과 GII 양성 대조군의 3 μL를 추가합니다. 노 템플릿 제어 (NTC) 우물에 클레아 제-freewater의 3 μL를 추가합니다. </li><li> 광학 접착제 필름 실시간 플레이트를 밀봉. </li><li> 1 분 웰에 존재할 수있는 임의의 기포 또는 액체 방울을 제거하기 위해주의 깊게 1300 XG에서 실시간 플레이트를 원심 분리. </li><li> 10 분 동안 1) RT 단계 : 실시간 PCR 장비 및 설정 다음 열 순환 조건을 설정합니다. Taq 중합 효소의 45 ° C (2) 활성화, 10 분에서. 95 ° C에서 및 (3) 95 ℃에서 15 초간 45 사이클, 그리고 60 ℃에서 60 초. </li></ol> 면봉 샘플에서 노로 바이러스의 7 정량화 <ol><li> RT-qPCR의 결과 (보충 표 3)의 유효성을 검사 양성 및 음성 대조군의 결과를 확인합니다. </li><li> 각각의 표준 곡선이 사항을 만족하는지 확인사용할 수있는 값은 보조 표 2에 주어진 수학 식 (1)를 사용하여 표준 곡선의 전체 표준 편차를 계산합니다. (식 1) %의 효율 = 100 × 10 (평균 코네티컷 값 절편) / 경사. </li><li> PCR을 열 순환기 소프트웨어는 각각의 표준 곡선에 대한 기울기를 계산하지 않으면 기울기 R 통계 소프트웨어를 이용하여 회귀 2 값 (예를 들어 엑셀, SPSS 또는 SAS)를 결정한다. 또한, 방정식 나는 다음과 같은 표준 곡선에 대한 %의 효율을 계산 </li><li> 보충 표 4에 명시된 기준에 맞는 표준 곡선에 기초하여 모든 테스트 샘플에 대한 열 순환기 소프트웨어에 의해 산출 된 RNA 카피 수를 기록한다. 기준을 충족하거나 거짓 양성 대조군이없는 표준 곡선 t 모자와 함께 어떤 샘플을 다시 실행하십시오. PCR 억제를 모니터링 할 수있는 내부 통제로 추가 된 coliphage MS2의 코네티컷 값을 확인합니다. </li><li> RNA 카피 (P)의 총 개수를 결정는 RT-qPCR의 반응에 사용 된 RNA (3 μL 5)의 것과 총 RNA의 용출 부피 (25 내지 50 μL)의 비율로 단계 7.2에서 계산 된 RNA 복사 개수를 곱하여 ER 샘플. 대안 적으로, 분석 대상물의 표면적 (cm 2)에 의해 총 RNA 복사 개수를 분할함으로써 RNA 농도를 계산한다. </li></ol> 헤미 중첩 된 기존의 PCR 증폭에 의해 실시간 RT-PCR 긍정적 인 샘플의 8 유전자형 <ol><li> RT-PCR 분석의 각 프라이머 세트에 대한 마스터 믹스의 첫 번째 라운드를 준비합니다 (보충 표 2, 5). </li><li> 마스터 믹스 20 μL에 노로 바이러스 양성 RNA의 5 μL를 추가합니다. </li><li> 다음과 같은 조건에서 RT-PCR을 실행하여, (1) 실온에서 95 ° C에서 Taq 중합 효소의 42 ° C (2) 활성화, 15 분에서 30 분 동안 단계, 및 (3) 95 ℃에서 30 초, 40주기 50 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 60 초. 40 사이클 후, 72 ℃에서 추가로 10 분 동안 배양한다. </li><li>RT-PCR 분석 각각의 프라이머 세트 (보충 표 2와 5)에 대한 이잖아요 믹스의 두 번째 라운드를 준비합니다. </li><li> 23 μL 마스터 믹스를 추가하고 각 튜브 (이상적으로 1 차 제품의 RNase없는 물에 1/10 희석한다)에 (첫 라운드에서) 1 라운드 RT-PCR 제품의 2 μL를 추가합니다. </li><li> 단계를 반복 8.3. </li><li> (PH 8.3에서 40 mM 트리스, 20 mM의 아세트산 및 1 mM의 EDTA) 100 ㎖ 1X 트리스 - 아세테이트 EDTA 2 % 아가 로스 겔을 제조. 전자 레인지의 혼합물을 가열하여 아가로 용해한 후, 60 ~ 70 ℃로 냉각 한 후, 혼합물을 제조 된 겔을 100㎖ 당 핵산 얼룩 10 μL를 추가 겔 붓고 콤 삽입. 겔은 적어도 30 분 동안 정착하자. </li><li> 6X 로딩 염료 3 μL 각 RT-PCR 생성물의 15 μl를 섞는다. 로드 각 시료 15 μL 및 1 시간 동안 100 V의 아가로 오스 겔 electrophorese. </li><li> 겔에서 적절한 크기 (GI 330 BP와 GII 341 BP)의 소비세 대상 RT-PCR 단편상업적 겔 추출 키트를 사용하여 RNA를 정제 거라고. 정제 된 PCR 생성물은 이제 생거 시퀀싱에 사용될 수있다. </li></ol>

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Authors have no conflicting interest. The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the official position of the Centers for Disease Control and Prevention.

Noroviruses 18 10 3 바이러스 입자 20 ~ 50 %의 인간 감염 복용량을 가지고있다. 따라서, 표면도 낮은 수준의 오염은 공중 보건 위험을 초래할 수 있습니다. 내부 대조군으로서 추출 운송 중 1) 면봉 다른 재료, 2) 저장 조건 면봉 3) 바이러스 성 RNA 농도, 4) coliphage MS2 : 면봉 샘플링 프로토콜의 여러 측면을 포함하여 평가 하였다. 최근까지,면, 폴리 에스테르, ...

<html> 인간의 noroviruses는 전염병과 산발적 급성 위장염 전 세계적으로 1, 2, 3의 주요 원인이다. 이 바이러스는 매우 전염성이 전송은 사람의 상호 작용으로 또는 간접적으로 오염 된 음식, 물 또는 환경 표면과 접촉을 통해 직접 사람을 통해 발생합니다. Noroviruses는 장시간 흘리고 연장 환경면에서의 바이러스 생존 1, 2, 3에 설명 된 수있다. 피크 흘리는 동안 바이러스 입자 수십억 대변 그램 당 방출하고, 구토 같은 감염 4, 5, 6, 7, 8 일으키는 바이러스 입자의 충분한 개수를 포함EF &quot;&gt; 9,10. 또한 무생물 표면과 사람의 피부의 바이러스의 이동이 발생하기 쉬운 2, 11, 12. 따라서, 환경 오염의 모니터링이 발생 조사 돕기 및 정화의 효과를 평가할 수 있으며 소독 절차. 몇몇 환경 샘플링 프로토콜 로타 바이러스의 검출에 대해 설명되었지만, coliphage MS2, 고양이 calicivirus (FCV) 및 박테리오파지 P22 13, 14, 15, 16. 그러나, 고속 탈수 (&lt;1 시간) 작은 표면적을 포함하여이 연구에 기술 검증 조건 (25 X 100cm 2), 적절 필드 설정을 표현하지 않을 수 있습니다. 또한 ENVIRO 낮은 오염 수준을 예상nmental 표면은 거의 바이러스 입자를 감지 할 수있는 프로토콜을 필요로한다. 우리는 노로 바이러스의 검출 및 입력을위한 macrofoam 기반 표면 샘플링 방법을 개발했다. 이 방법은 여러 노로 바이러스 발생시 검증되었습니다. 프로토콜이 포함 1) (2) 최선의 방법 실험실에 수집 및 운송 중에 샘플의 무결성을 유지하고, 노로 바이러스 3) 실험실 테스트 및 타이핑 환경면에서 면봉 샘플을 수집하는 방법에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Generic name for kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Macrofoam swab&lt;/strong&gt;</td><td>Premoistened EnviroMax Swab kit&amp;nbsp;</td><td>Puritan</td><td>2588060PFUW</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA Lysis buffer&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>CDC UNEX buffer</td><td>Microbiologics</td><td>Cat No MR0501</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA extraction spin column&lt;/strong&gt;</td><td>Midi column</td><td>Omega Biotek</td><td>Cat No R6664-02</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;RNA purification spin column&lt;/strong&gt;</td><td>Zymol RNA Clean and Concentrator kit&amp;nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>Cat No R1016</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Real time RT-PCR kit&lt;/strong&gt;</td><td>AgPath kit One-Step RT-PCR Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Cat No 4387391</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Conventional RT-PCR kit&lt;/strong&gt;</td><td>Qiagen one step RT-PCR kit</td><td>Qiagen kit</td><td>Cat No 210212</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Gel extraction kit&lt;/strong&gt;</td><td>Qiagen QIAquick gel extraction kit</td><td>Qiagen kit</td><td>Cat No 28704 or 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Cat No 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>RNA run-off transcripts</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Realtime PCR platform</td><td>Applied Biosystems</td><td>Model ABI 7500</td></tr><tr><td></td><td>Optical 96-well reaction plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4316813</td></tr><tr><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp;amp;showAddButton=true&amp;amp;productID=4306311&amp;amp;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAI1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacF6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx%0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D&amp;amp;returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*&quot;&gt;MicroAmp Clear Adhesive Film&amp;nbsp;&lt;/a&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat No 4306311</td></tr></tbody></table>

swab sampling method for the detection of human norovirus on surfaces

인간의 noroviruses는 전염병이 전 세계적으로 산발적 위장염의 주요 원인입니다. 대부분의 감염이 어느 환경 표면 또는 음식을 통해 간접적으로 개인 대 개인 경로를 통해 직접 전파 또는 때문에, 오염 fomites과 무생물 표면은 노로 바이러스의 발생시 바이러스의 확산을위한 중요한 차량이다. 우리는 개발 검출 및 하드 표면에서 인간의 noroviruses의 입력에 대한 macrofoam 면봉을 사용하여 프로토콜을 평가 하였다. 섬유로 만들어진 면봉 또는 정전기 방지 물티슈에 비해 macrofoam 면봉는 최대 700cm 2의 변기 표면에서 바이러스 복구 (범위 1.2-33.6 %)을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 스핀 열을 사용하여 바이러스 성 RNA의 면봉에서 바이러스의 추출과 더 집중하는 단계를 포함한다. 노로 바이러스 위장염이 있었다 유람선 및 장기 요양 시설의 표면에서 수집 한 217 면봉 샘플의 총, 127 (58.5 %)RT-qPCR에 의한 GII의 노로 바이러스 양성 반응보고했다. 이 29 (22.8 %)의 성공적 유전자형을 할 수있다. 결론적으로, 우리는 임상 샘플을 사용할 수없는 경우 바이러스의 검출뿐만 아니라 발생시 환경 오염의 수준을 결정하는데 도움이 될 수 개발 된 프로토콜을 사용하여 환경 표면 노로 바이러스의 검출; 또한 치료 전략의 효과의 모니터링을 용이하게 할 수있다.

도 1은 면봉 샘플링 프로토콜의 흐름도를 나타낸다. 이 프로토콜은 네 가지 주요 단계로 구성; 1) 샘플 수집, 2) 시료의 저장 및 수송, 3) 바이러스 성 RNA의 정제 및 농도 4) RT-qPCR의 분석 및 유전자형. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.jpg" /> 그림 1 : 노로 바이러스의 환경 표면 샘플링에 대한 최종...

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Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.5K 조회수.  Centers for Disease Control and Prevention. A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces. 

비디오: Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 바이러스 샘플의 I. 컬렉션

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

연구

환경과학

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

면역학 및 감염병학

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

엔테로 바이러스 및 문화 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. II. 총 배양 가능한 바이러스 분석

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

운동 유발성 Apoptosis 림프구의 결정을위한 손가락 - 스틱 혈액 샘플링 방법론

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of hospitalizations in children with a public health impact similar to that of Rotavirus. NoVs are RNA viruses of great genetic diversity and there is a continuous appearance of new strains. Five genogroups are recognized; GI and GII with their many genotypes and subtypes being the most important for human infection. However, the diagnosis of these two genotypes remains problematic, delaying diagnosis and treatment. 1, 2, 3
For RNA extraction from stool specimens the most commonly used method is the QIAmp Viral RNA commercial kit from Qiagen. This method combines the binding properties of a silica gel membrane, buffers that control RNases and provide optimum binding of the RNA to the column together with the speed of microspin. This method is simple, fast and reliable and is carried out in a few steps that are detailed in the description provided by the manufacturer. 
 Norovirus is second only to rotavirus as the most common cause of diarrhea. Norovirus diagnosis should be available in all studies on pathogenesis of diarrhea as well as in outbreaks or individual diarrhea cases. At present however norovirus diagnosis is restricted to only a few centers due to the lack of simple methods of diagnosis. This delays diagnosis and treatment 1, 2, 3. In addition, due to costs and regulated transportation of corrosive buffers within and between countries use of these manufactured kits poses logistical problems. As a result, in this protocol we describe an alternative, economic, in-house method which is based on the original Boom et al. method4 which uses the nucleic acid binding properties of silica particles together with the anti-nuclease properties of guanidinium thiocyanate.
For the detection and genogrouping (GI and GII) of NoVs isolates from stool specimens, several RT-PCR protocols utilizing different targets have been developed. The consensus is that an RT-PCR using TaqMan chemistry would be the best molecular technique for diagnosis, because it combines high sensitivity, specificity and reproducibility with high throughput and ease of use. Here we describe an assay targeting the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region; the most conserved region of the NoV genome and hence most suitable for diagnosis. For further genetic analysis a conventional RT-PCR that targets the highly variable N-terminal-shell from the major protein of the capsid (Region C) using primers originally described by Kojima et al. 5 is detailed. Sequencing of the PCR product from the conventional PCR enables the differentiation of genotypes belonging to the GI and GII genogroups.

A One-Step RT-PCR assay for detection and genogroup identification of Norovirus isolates from children&#x2019;s stools, that utilizes primers and TaqMan probes specific to the open reading frame 1 (ORF1)-ORF2 junction region, the most conserved region of the Norovirus genome is described. A non-commercial, cost-effective RNA extraction method is detailed.

Taqman함으로써 어린이 Stools에서 Noroviruses의 감지 및 Genogrouping 한 단계 RT-PCR

Noroviruses (NoVs) are the leading cause of outbreaks of sporadic acute gastroenteritis worldwide in humans of all ages. They are important cause of ...

의학

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

도시 환경 면봉 - 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을 위한 파이프라인

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

생물학

An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria

After preparing the reagents, antibodies, and bacteria as described in the manuscript, assemble all the materials in a BSL II biosafety cabinet.
Virus-like particles for human norovirus are listed as BSL II pathogens, and all work performed using VLPs should be conducted in a certified biosafety cabinet.
Add 10 micrograms of human norovirus VLPs to each tube of bacteria, and mix thoroughly by pipetting. Incubate the tubes for 1 hour at 37 degrees Celsius with constant rotation. After incubation, centrifuge the tubes at 10,000 times g for 5 minutes.
Aspirate and discard the supernatant and resuspend the bacterial pellet in 1 milliliter of PBS. After repeating the wash steps once, centrifuge the tubes again at 10,000 times g for 5 minutes. Discard the supernatant and resuspend the VLP bacteria pellet in 150 microliters of 5% blocking buffer.
A common error that occurs is that tubes are swapped and the wrong treatment is added. To prevent this, arrange all tubes in lines that correspond to the correct treatment, and add one treatment all at once to the tubes.
For each bacterial sample, prepare 50 microliters of diluted human norovirus G2 antibody. Using 5% blocking buffer, dilute the antibody 1 to 125 for E. coli case samples. Prepare 50 microliters of diluted isotype antibody for each bacterial sample using the same dilution ratios. Divide each attachment assay sample into 350-microliter aliquots by transferring them into clean 1.5-milliliter centrifuge tubes.
To create unstained controls, add 50 microliters of blocking buffer to the first aliquot from each bacterial sample. For the stained samples, add 50 microliters of the G2 antibody dilution to the second set of aliquots. Create the isotype controls by adding 50 microliters of the diluted isotype antibody to the third set of aliquots.
Incubate all the samples on ice and in the dark for 30 minutes. Then, centrifuge all the samples at 10,000 times g for 5 minutes. Discard the supernatants and resuspend each sample in 150 microliters of FCSB. Again, centrifuge all the samples at 10,000 times g for 5 minutes. Again, discard the supernatants and resuspend the samples in 100 microliters of FCSB.
After centrifuging the samples one final time and discarding the supernatant, resuspend the samples in 150 microliters of FCSB. Transfer each sample to a tube containing 400 microliters of FCSB for a total volume of 550 microliters. Store the samples at 4 degrees Celsius until they are analyzed by flow cytometry.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

요약

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