이 작품에 대한 자금은 BFBS로 성장 아이오와 값 기금 보너스에 의해 제공되었다.

1. 무균 접착제 테이프로 표면 샘플링 <ol><li> 샘플링에 사용하는 테이프를 선택합니다. 상용 곰팡이 - 테이프 또는 콘 - 전술 - 이건 샘플링 테이프 사용의 용이성에 대한 살균 및 특수 포장됩니다. 그러나, 우리는 투명 (광학 취소) 일반 사무실 테이프도 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. </li><li> 접착 테이프 10cm의 조각 (종이 템플릿을 사용할 수 있습니다)의 비 끈적끈적한 측면에 1cm 두 사각형을 그릴 수있는 영구 마커를 사용합니다. 이것은 테이프의 부분은 음식이나 환경 표면을 샘플하는 데 사용되었습니다 어떤 지적을위한 시각적인 가이드 역할을합니다. </li><li> 샘플로 표면을 향하게 쓰는 측면과 &quot;C&quot;모양의 테이프 루프를 형성합니다. 이렇게하려면 뒤로 (비 끈적 쪽) 테이프 (그림 1)에 그려진 사각형에 대한 엄지와 가운데 손가락 및 위치 검지로 쓰는 끝을 잡고. </li><li> 샘플로 표면에 테이프를 놓고 부드럽게 표면에 대한 표시 영역을 누르십시오. 테이프의 가장자리를 발표하지 않고, 테이프의 끈적한 면이 거품을 피하기 위해, 샘플 표면 전체 접촉할 수 있도록 검지 손가락을 사용합니다. </li><li> 도 동작을 사용하면, 천천히 신체 표면 바운드 미생물을 추출, 멀리 샘플에서 테이프를 가져옵니다. 일반 투명 사무실 테이프를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에, 셀 충전 테이프, 스티커 측면을 고정. 평면이 아닌 중늙은이 표면이 생성되도록 테이프의 적절한 긴장 / 스트레칭을 보장합니다. 이것은 변형 / 하이브리드화하는 동안 이후의 가열하는 동안 테이프의 컬링 문제를 최소화하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 2. 솔리드 - 위상 강화 및 액체 표면 Miniculture <ol><li> 고체 상 농축은 샘플 셀이 한천 표면과 직접 접촉에 배치되도록 자일로 오스 - 라이신 - Tergitol 4 (XLT - 4) 한천 접시에 얼굴을 아래로 테이프를 배치하여 수행됩니다. 테이프 템플릿 / 샘플 접촉 부분은 한천 표면과 테이프의 한쪽 끝을 함께 플러시가 느슨하게 농축 다음 한천 표면에서 테이프의 쉬운 제거를 촉진하기 위해 페트리 접시의 측면 벽을 준수합니다 배치됩니다. </li><li> 번호판 거꾸로 (결로를 방지하기 위해)와 35 incubated 있습니다 - 37 ° C 살모넬라균 종의 충분한 성장을 허용합니다. 감지 수준으로 세포를 풍요롭게하는 데 필요한 잠복기의 길이는 초기 살모넬라균 오염 수준에 따라 달라집니다. 우리는 8 H 농축 후 낮은 초기 inocula에서 우수한 microcolony 형성을 관찰했습니다. </li><li> 원하는 강화 기간 후, 한천 플레이트를 엽니다. 테이프는 부화 기간 동안의 tackiness를 유지합니다. 부드럽게 테이프 한천 인터페이스에서 형성된 microcolonies 최대 회복을 보장하기 위해 검지 손가락을 사용하여 한천에 대한 테이프를 누르십시오. 페트리 접시의 벽에 붙어있는 가장자리의 테이프를 파악하고 느린, 심지어 운동으로 제거합니다. 위의 섹션 1.5에서 설명한대로 현미경 슬라이드에 세포 - 충전 테이프, 최대 스티커 측면을 탑재합니다. 아래의 &quot;고정 및 탈수&quot;단계로 진행합니다. </li><li> 액체 표면 miniculture 들어, 위의 섹션 1.5에서 설명한 것처럼 현미경 슬라이드에 샘플링에 사용되는 테이프를 고정하여 시작합니다. 다음 아래쪽 위쪽을 향하도록 셀 충전 테이프로 구성되어 있습니다 밀폐된 챔버를 형성되지 않은 멸균 실리콘 재관류 챔버 (Coverwell, 그레이스 바이오 연구소, 주식 회사)와 테이프의 템플릿 / 샘플 접촉 부분을 커버. 단호하게, 그러나 부드럽게 방수 도장을 보장하기 위해 장소로 챔버를 누르십시오. </li><li> 피펫 팁, 전송 ≤ 500 μL Trypticase의 간장 스프 또는 챔버의 작은 입구 포트 중 하나를 통해 다른 적합한 농축 매체를 로딩 유연한 젤을 사용합니다. 35 -37에서 증발하고 품어 슬라이드를 방지하기 위해 투명 사무실 테이프로 두 포트를 봉쇄 ° C 충분한 강화를 위해 필요. 모든 작업이 좋은 샘플링 및 처리 관행에 따라 수행되어야하지만, 포트 밀폐 테이프 또는 재관류 챔버스의 불임은 액체 표면 miniculture 동안 필요하지 않습니다. 피시 앤드 유동세포계측법의 조합은 살모넬라균 종 명백한 차별을 활성화합니다. 샘플 자체에서 온 것으로 기대하지 않는 대상 식물의 가장 큰 공헌과 함께, 현재 수 이외의 대상 박테리아. 아래의 &quot;고정 및 탈수&quot;단계로 진행합니다. </li></ol> 3. 고정 및 탈수 <ol><li> 직접 표면 샘플링이나 살모넬라균 종의 견고한 위상 강화를 위해. XLT - 4 한천에 25 30 분 동안 테이프 세포 고정을 수행하면 ° 500 μL 10% 중립과 샘플 연락처 영역을 다루는으로 C는 포르말린 버퍼. </li><li> sea​​lable 컨테이너 (유해 / 자극적 증기에 노출을 최소화하기 위해 화학 후드 아래)로 정착액을 폐기하십시오. </li><li> 에탄올 시리즈 (; 300 μL / 3 분 각 농도 50 %, 80 % 95%)에 탈수. 아래의 &quot;하이브 리다이 제이션&quot;단계로 진행합니다. </li><li> 500 μL 액체 표면 miniculture 샘플의 고정을위한S, 재관류의 여왕님 unsealed 있으며, 유연한 젤 로딩 피펫 팁은 enrichate를 추출하는 데 사용됩니다. 아래 신속하고 pipetting는 모든 나머지 테이프 바운드 세포의 효과적인 제거를 확인하는 데 사용됩니다. </li><li> 다음 전체 500 μL miniculture 볼륨이 microcentrifuge 튜브로 전송 2,000 XG (5 분)에서 다운 소용됩니다. 뜨는은 삭제됩니다, 펠렛은 다음 10 %의 동일한 볼륨에 resuspended, 30-60 s에 대한 적극적 vortexed입니다 중성 포르말린 버퍼. 세포 ° C. 25시 30 분 수정되었습니다 </li><li> 다음, 정착액 제거 및 샘플이 세포 저장소 버퍼 resuspended이며, 다음과 같은. 60 S, 50 % 이외의 변성 에탄올 50 %의 동일한 볼륨에 resuspended 인산염 - - 샘플은 2000 XG (5 분, 25 ° C) 뜨는가 삭제됩니다, 펠렛가 30 적극적으로 vortexed합니다에서 다운 늘인입니다 염분 버퍼. 고정 전지는 -20 ° C.에서 (년) 무기한으로 저장할 수 있습니다 참고 : 액체가 (예를 들어, 정착액 또는 다른 버퍼를 도입하는 경우) 변경 때마다, 그것은 철저하게 (vortexing 포함) 최소 부분에있는 세포 펠릿 (~ 10-20 μL) resuspend하는 것이 중요하다 &quot;나가는&quot;액체 시스템을 . 이것은 clumping을 방지하고 개별 세포도 suspensions 취득되었는지 확인하는 데 도움이됩니다. 아래의 &quot;하이브 리다이 제이션&quot;단계로 진행합니다. </li></ol> 4. 이종 교잡 <ol><li> 상업 분자 생물학 수준의 솔루션 자료 표에 명시된 바와를 사용하여 하이브리드화 / 세탁 버퍼를 준비합니다. 최종 버퍼 구성 요소 농도가 0.7 M NaCl 있으며, 0.1 M 트리스 [산도 8.0], MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 %의 나트륨 dodecyl 황산염은 0.22 μm의 주사기 또는 컵 필터를 사용하여 분자 수준의 물 여과와 최종 원하는 볼륨으로 구성되어 10. 프로브 (아래 참조)의 추가없이 동일한 버퍼는 세척 버퍼로 사용됩니다. 앞서 열을 가하다의 하이브리드화 및 55 버퍼를 세척 ° C. </li><li> 찬란 - 레이블 추가 Sal3 (Nordentoft 외, 1997;. 5&#39; - AAT CAC TTC TAC ACC GTG - 3 &#39;)와 삼 - 63 (Kutter 외, 2006;. 5&#39; - TCG ACT GAC TTC AGC TCC - 3&#39; preheated 하이브 리다이 제이션 버퍼) oligonucleotide 프로브 (자료 표). 5 NG μL -1 총 프로브 농도는 (; 비샤 및 브렘 - Stecher, 2009a 2.5 NG μL -1 각각의 프로브를 예 :)이 사용됩니다. </li><li> 직접 투 - 테이프 견고한 위상 강화 샘플 들어, 프로브 칵테일을 포함 하이브리드화 버퍼 300 μL와 테이프의 템플릿 샘플 접촉 영역을 중첩하고 55 ° C.으로 설정 습기, 밀폐된 배양 챔버에서 테이프 바운드 세포 잡종 슬라이드 모앗 악기 (자료 표)와 같은 직접 연락 인큐베이터를 사용하는 경우, 샘플은 15 분 hybridized하고&gt; 20 슬라이드 동시에 처리할 수 있습니다. 같은 밤비노 악기 (자료 표)로 로타리 스타일 하이브 리다이 제이션 오븐이 사용하는 경우, 슬라이드가 하이브리드화 50 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브, 튜브 당 하나의 슬라이드에 배치됩니다. 열전달 직접 아니기 때문에, 이러한 샘플은 더 이상 기간 (최대 30 분)에 대한 hybridized입니다. </li><li> 하이브리드화 다음, 슬라이드를 제거하고 프로브 함유 하이브리드화 버퍼 오버레이가 삭제됩니다. 슬라이드 preheated 세척 버퍼 오버레이 또는 하나와 다음 (최대 30 분) 중 잠시 부드럽게 기울어져 슬라이드 (300 μL 각 3 rinses)을 통해 버퍼의 작은 볼륨을 pipetting하여 preheated 세척 버퍼 씻어서, 또는 공식적으로 씻어 아르 preheated 세척 버퍼를 포함하는 50 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브의 침수. 우리의 경험에서, 공식적인 세척이 향상된 결과 (언바운드 프로브에서 적은 헤이즈) 제공하지만, 간단한 헹굼은 살모넬라균 종의 모호하지 탐지에 적합합니다. 다음 슬라이드는 아래의 &quot;검색&quot;단계로 이동하기 전에 공기 건조합니다. </li><li> 액체 표면 miniculture 샘플 하이브 리다이 제이션은 활발한 펠렛의 vortexing 및 포함된 100 μL preheated 하이브 리다이 제이션 버퍼에 resuspension 다음, 2000 XG에서 5 분 (-20 ° C에서 갓 고정 또는 저장 버퍼에 보관) 샘플을 회전하여 수행됩니다 프로브 칵테일. 샘플은 55 hybridized 아르 ° 500 μL preheated 세척 버퍼의 또한 다음 열 블록 또는 기타 적합한 배양 스테이션 (재료 표), 30 분 C. 테이프 바운드 샘플과 마찬가지로,이 샘플은 공식적으로 대한 씻어 수 있습니다 최대 55에서 추가 배양과 30 분하는 ° 간헐 vortexing이 세척 버퍼에 C. 또한, 샘플은 철저하게 분석을 위해 즉시 수확 (아래)에 의해 다음, 500 μL preheated 세척 버퍼를 추가 후 vortexed 수 있습니다. </li><li> 살모넬라균 종의 검출을위한 준비. 유동세포계측법 통해 액체 표면 miniculture 샘플은 5 분 2,000 XG에 아래 냈지 있으며, 표면에 뜨는가 무시되고 샘플, 300 μL 상온에서 resuspended 아르 (~ 25 ° C) PBS. 샘플가 먼 시설로 수송해야하는 경우 지연이 하이브리드화 분석 사이에 예상되는 경우, 또는 샘플 전에 아나로 냉장 또는 얼음에서 개최됩니다용해. 또한, 샘플은 셀 저장 버퍼 (PBS와 절대 에탄올의 혼합 50:50)로 전송 및 감지할 수있을 정도의 손실없이 일주일에 최대 -20 ° C에서 개최됩니다 프로브 - 수여 형광 (비샤 및 브렘 - Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. 검색 <ol><li> 살모넬라균 종의 온 - 테이프 감지. 형광 현미경을 통해, 직접 - 투 - 테이프 또는 고체 위상 강화 샘플은 핵 counterstain 4 포함된 ~ 10 μL Vectashield H - 1200 설치 매체 &#39;, 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI), 커버 슬립과 함께 탑재와 overlayed 아르 다음 10 분 동안 짙은 어둠 속에서 incubated. </li><li> 단기 집중 오일 커버 슬립에 배치되며, 샘플은 높은 배율 오일 목표 (63x 또는 100x)를 사용하여 검사하고 있습니다. DAPI 필터가 초점에 샘플을 가지고하는 데 사용됩니다, 현미경은 다음 적절한 필터 (녹색 또는 빨간색, 최종 라벨 프로브에 사용되는 염료에 따라 다름) 및 살모넬라의 세포로 전환됩니다는 (자신의 형광에 따라 시각 득점 아르 피규어 2, 3). </li><li> 액체 표면 miniculture 샘플 cytometric 검출을위한 다양한 악기 현지 예약 상황에 따라 사용할 수 있습니다. 우리 연구실에서는 PBS - 정지 샘플 5 ML 라운드 바텀 샘플링 튜브 (BD 팔콘)에 양도하고 647 nm의 (자료 표)에서 여기로 FACSCanto 흐름 cytometer를 사용하여 검사하고 있습니다. 총 박테리아의 높은 숫자를 포함하는 풍부한 예제에 대해 &quot;낮은 유량&quot;설정 (10 μL 분 -1) 사용되며, 5,000-50,000 이벤트가 수집됩니다. 데이터 FlowJo 소프트웨어 (버전 8.8.6, 나무 스타 (주), 애쉬 랜드, OR) 또는 기타 적합한 분석 소프트웨어 (그림 4, 패널 A와 B)을 사용하여 분석하고 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 살모넬라균 종의 표본 추출을위한 접착 테이프 중 하나를 사용하십시오. 인위적으로 오염된 토마토의 표면에서. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 토마토 (100 X 오일 목적)의 표면에서 직접 - 투 - 테이프 샘플링과 살모넬라균 Typhimurium ATCC 14028의 물고기 탐지를위한 일반적인 결과입니다. 텍사스의 두 프로브 칵테일은 레드 - 라벨 프로브는 (Sal3/Salm-63) 사용되었다 이러한 세포를 분류합니다. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 살모넬라균 Typhimurium ATCC 14028의 Microcolonies 37에서 8 H에 테이프 농축 ° C. 후 초기 inoculum은 인위적으로 오염된 토마토의 표면에서 샘플되었습니다 자일로 오스 라이신 Tergitol - 4 (XLT - 4) 한천의 표면에 형성. 고체 상 농축은 탐지에 사용할 세포의 숫자를 증가 또한 셀룰러 rRNA 컨텐츠를 향상시킵니다. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. S.의 샘플링에 대한 접착 테이프의 사용 enterica serovar Typhimurium 피시 앤드 유동세포계측법 (패널 A)을 통해 500 μL Trypticase 간장 맛을 (패널 B 가득한 재관류 챔버 5 H 아닌 선택적 액체 표면 miniculture 농축 후 직접 분석하여 다음 인위적으로 오염 토마토의 표면에서 ).

<ol>
	<li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples.">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li><li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape.">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adhesive-tape-based+sampling+of+tomato+surfaces+combined+with+rapid+fluorescence+in+situ+hybridization+for+Salmonella+detection.">Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 .</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-through+imaging+cytometry+for+characterization+of+Salmonella+subpopulations+in+alfalfa+sprouts,+a+microbiologically+complex+food+system.">Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system.</a> Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).</li><li>Edwards, R. W., Hartman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+collecting+fungus+specimens+from+infected+surfaces.">A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces.</a> Lloydia. 15, 39-39 (1952).</li><li>Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F., Pouch Downes, F., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+monitoring+of+the+food+processing+environment.">Microbiological monitoring of the food processing environment.</a> Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. , (2001).</li><li>Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+tape+method+for+estimating+microbial+load+on+meat+surfaces.">Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces.</a> J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).</li><li>Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+barley+(Hordeum+vulgare)+with+Salmonella+enterica+and+Listeria+spp.">Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).</li><li>La Cono, V., Urz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+applied+on+samples+taken+with+adhesive+tape+strips.">Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).</li><li>Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+controlling+microbiological+contamination+of+beverage+dispensers+in+university+foodservice+operations.">Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations.</a> Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).</li><li>Langvad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+qualitative+and+quantitative+study+of+the+fungal+flora+of+leaves.">A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves.</a> Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).</li><li>Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+fluorescence-labelled+oligonucleotide+probe+targeting+23S+rRNA+for+in+situ+detection+of+Salmonella+serovars+in+paraffin-embedded+tissue+sections+and+their+rapid+identification+in+bacterial+smears.">Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

생산 표면에 병원균의 검출을위한 간단하고 빠른 방법은 시의 적절하고 실질적인 데이터를 제공함으로써 식인성 질환을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 접착제 테이프 기반 샘플링 방법은 1950 년대 이후, 환경 임상 및 식품 미생물학에서 사용하고 직접 현미경 검사 또는 고체 미디어에 점착 성의 미생물의 양도 다음, 미생물의 제거를위한 표면에 &#39;스카치&#39;스타일 테이프를 눌러 포함되?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fungi-Tape sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL</td>
<td>745</td>
<td>http://www.scientificdevice.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Con-Tact-It sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Birko Corporation, Denver, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.birkocorp.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear office tape, generic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence</td>
</tr>
<tr>
<td>Food surface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local grocery</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypticase Soy Broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>211768</td>
<td>For non-selective liquid surface miniculture enrichment</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>223420</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>235310</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Formalin solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>HT5011</td>
<td>10% solution, neutral, buffered (cell fixative)</td>
</tr>
<tr>
<td>Absolute ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>E7023</td>
<td>Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RNase- and DNase-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slides and cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>S5150</td>
<td>Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>T9285</td>
<td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>L4522</td>
<td>10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies, Coralville, IA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5&#x2019;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified</td>
</tr>
<tr>
<td>Variable speed microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>CoverWell perfusion chamber </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR</td>
<td>PC1R-2.0</td>
<td>Non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>05-408-151</td>
<td>Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum heat block or precision-controlled heating station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Bambino mini hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 230300</td>
<td>Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide Moat slide hybridizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 240000</td>
<td>Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield H-1200 mounting medium with 4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td>
<td>H-1200</td>
<td>Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leitz Laborlux S used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canon PowerShot A640 camera used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used</td>
</tr>
<tr>
<td>Adobe Photoshop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Adobe Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometry analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combination of adhesive-tape-based sampling and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of salmonella on fresh produce

이 프로토콜은 살모넬라균 종의 급속한 문화 독립적인 감지를위한 현장 하이브리드화 (물고기)에서 테이프 형광 다음 토마토와 다른 신선한 농산물 표면의 접착 테이프 기반의 샘플링을위한 간단한 방법을 설명합니다. 셀 - 충전 테이프도 검색하기 전에 고체 상 농축을위한 선택적 한천에 얼굴을 아래로 둘 수 있습니다. 또는 낮은 볼륨 액체 enrichments (액체 표면 miniculture)는 유동세포계측법를 통해 물고기와 분석에 의해 다음이 아닌 선택 국물에있는 테이프의 표면에 수행할 수 있습니다. 시작하려면, 살균 접착 테이프는 신선한 농산물과 접촉을 가지고있다, 부드러운 압력이 적용되고 테이프는 실제로 이러한 표면에 존재하는 미생물을 추출, 제거됩니다. 테이프 유리 현미경 슬라이드에 쓰는 쪽까지를 탑재하고 샘플 세포는 포르말린 (30 분)과 탈수 10 % 등급 에탄올 시리즈 (50, 80, 및 95 %, 3 분 각 농도)를 이용하여 고정합니다. 다음 셀 충전 테이프는 살모넬라균 타겟 DNA 프로브 칵테일을 포함하는 버퍼 발견하고 15 hybridized 아르 - 55시 30 분 ° C, 언바운드 프로브를 제거하는 세척 버퍼 린스 간단한 다음. 자기편, 물고기 표시된 전지는 다음 형광 현미경을 사용하여 볼 수있는 DNA 염색 4 &#39;, 6 diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) 및 결과 counterstained 있습니다. 고체 상 농축 들어, 셀 충전 테이프는 적절한 선택 한천 표면에 얼굴을 아래로 배치하고 위에 설명된대로 피시 앤드 현미경 다음 살모넬라균의 microcolonies의 현장 성장에 수 incubated 수 있습니다. 액체 표면 miniculture 들어, 셀 충전 테이프 끈끈한 측면을 배치하고 실리콘 재관류 챔버 적용되도록 테이프 및 현미경 슬라이드 양식 물이 꽉 챔버로의 하단 Trypticase 콩의 작은 볼륨 (≤ 500 μL) 국물 (TSB)가 도입됩니다. 입구 포트는 봉인되고 회의소는 35 incubated 있습니다 - 37 ° C, 테이프 추출한 미생물의 성장 기반 확대를 수 있도록합니다. 부화 후, 입구 포트 unsealed 있으며, 세포 분리 및 혼합 활발한 뒤로와 앞으로 pipetting, 원심 분리를 통해 수확와 10 %에서 해결된 중성 포르말린 버퍼. 마지막으로 샘플은 hybridized과 살모넬라균 종의 존재를 나타내기 위해 유동세포계측법를 통해 심사하고 있습니다. 여기에 설명한 바와 같이, 우리의 &quot;테이프 - 물고기&quot;접근 방식은 토마토 표면에 간단하고 빠른 샘플링과 살모넬라균의 검출을 제공할 수 있습니다. 또한 시금치와 잘라페노 후추를 포함한 신선한 농산물의 다른 유형을 샘플링이 접근 방식을 사용하고 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce at JoVE.com

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

이 프로토콜은 전체 세포의 급속한 탐지 다음 토마토와 다른 신선한 농산물의 표면 샘플링을위한 간단한 접착제 테이프 기반의 접근 방식을 설명합니다<em&gt; 살모넬라균</em&gt; 형광을 사용하여<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

12.9K 조회수.  Colorado State University. 이 프로토콜은 전체 세포의 급속한 탐지 다음 토마토와 다른 신선한 농산물의 표면 샘플링을위한 간단한 접착제 테이프 기반의 접근 방식을 설명합니다 살모넬라균 형광을 사용하여 현장에서 하이브리드화 (물고기).

비디오: Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

이종 교잡<em&gt; 현장에서</em&gt; 침샘, 난소, 그리고 벡터 모기의 태아의

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

형광성의<em&gt; 현장에서</em모기의 Mitotic의 염색체에&gt; 하이브리드

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서 하이브 리다이 제이션 살모넬라균* 신선한 농산물에 대한*