Name: techniques to induce and quantify cellular senescence
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Denna studie stöddes av Intramural forskningsprogram National Institutes of Health, National Institute on Aging. Författarna vill tacka Myriam Gorospe och Kotb Abdelmohsen för många hjälp diskussioner om åldrande och Kotb Abdelmohsen för också kritiskt läsa manuskriptet. Vi tackar också våra laboratorie medlemmar, särskilt Douglas Dluzen för kritiskt läsa manuskriptet.

1. Induktion replikativt åldrande <ol><li> Tö låg-passage humana diploida fibroblaster (t ex WI-38 och IMR-90) eller andra cellinjer. OBS: Här var humana diploida fibroblaster används, men dessa protokoll kan användas för att bedöma åldrande i andra celltyper, såsom endotelceller, epitelceller eller mesenkymala stamceller. Odlingsbetingelser kan optimeras för olika celltyper som används på grund av olika tillväxttakt eller odlingsbetingelser. OBS: Celler bör vara prolifererande oc...

Här, har vi beskrivit metoder för replikativ och DNA-skada inducerad senescens som använder humana diploida fibroblaster. Dessutom är tekniker för att kvantifiera protein och mRNA-nivåer av olika hudåldrande associerade proteiner inkluderas, liksom färgning för SA-β-gal och för DNA-skador markör γ-H2AX. Dessa protokoll kan ofta används för att bedöma senescenta fenotyper både in vitro och in vivo, även om många varningar existerar för karakterisering senescens in vivo <sup ...

Mer än ett halvt sekel sedan, Hayflick och kollegor beskrev hur otransformerade celler förökar sig i kultur, men för bara en begränsad tid en. Långsiktig odling av humana fibroblaster orsakade cellerna att stoppa prolifererande; men de var metaboliskt aktiva, och detta kallades cellulärt åldrande. Senescens kan vara fördelaktigt för att hämma tumörgenes, men det kan också vara skadligt, eftersom det är tänkt att bidra till förlust av regenerativ kapacitet som uppstår med åldrandet 2, 3. Åldrande celler har visat sig ackumuleras i vävnader som människor ålder 4 och har varit inblandade i ett antal biologiska processer, inklusive embryoutveckling, sårläkning, vävnadsreparation, och åldersrelaterad inflammation 2. Kontinuerlig passage av celler i kultur inducerar replikativ senescens, vilket har kopplatsatt telomer attrition och genomisk instabilitet. Olika cellspänningar, inklusive DNA-skador och onkogener, kan också orsaka senescens 3. Senescens orsakas av andra än telomer attrition faktorer kallas ofta stressinducerad eller för tidig senescens och i allmänhet beror på p16 INK4a / Rb-vägen 5. Fastän prolifererande, otransformerade celler visas normalt spindel i form, kan åldrande celler identifieras såsom att ha vissa egenskaper, innefattande en platt, stor morfologi och ökade senescens-associerade β-galaktosidasaktivitet (SA-β-gal) (figurerna 1 och 2). Åldrande celler ackumuleras även DNA skada markörer, inklusive γ-H2AX (figur 3) 6, och, potentiellt, senescens-associerade heterokromatin foci (SAHF) (Figur 4) 7. Åldrande celler har högre nivåer av cellcykelregulatorer, inklusive p<html> 16 (p16 INK4a) och / eller p21 och p53 (fig 5) 8, 9. Dessutom har nya data visat att åldrande celler kan ha icke-autonoma effekter genom att utsöndra ett antal pro-inflammatoriska cytokiner och kemokiner som kallas senescens-associerade sekretorisk fenotyp (SASP) 10. Även om denna SASP fenomen kan variera från celltyp till celltyp, i allmänhet är det visas genom en ökning av interleukin-6 (IL-6), IL-8, granulocyt-makrofag kolonistimulerande faktor (GM-CSF), tillväxt- reglerad onkogen α (GRO-α) och GRO-β, bland andra (Figur 6). Den speciella stress eller skada som inducerar senescens kan också påverka den sekretoriska fenotypen 11, 12, 13. SASP kan detekteras genom att mäta nivåerna av utsöndrade proteiner med användning av ELISA eller cytokin / proteinchips = &quot;xref&quot;&gt; 10, 14. Även om post-transkriptionella mekanismer kan reglera SASP proteinnivåer 11, 15, 16, 17, förändringar i mRNA-nivåer kan också detekteras i många fall. Dessa förändringar är i allmänhet känsligare och lättare att kvantifiera än mätningar proteinnivå. Andra åldrande markörer kan också bedömas, inklusive ihållande DNA-skada nukleärt foci, som kallas DNA-segment med kromatin förändringar armerings senescens (DNA-SCARS) 18, och diverse andra markörer 3, 19, 20. Här beskriver vi vanliga tekniker för att inducera senescens i celler i odling och även för mätning av flera markörer för åldrande, inklusive SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, och proteinet och mRNA av åldrasiou-associerade molekyler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Tris-glycine gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td colspan="2">XP00160BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol ChCl3</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa-Fluor 568 goat anti-mouse antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11031</td>
			<td>1:300 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lifters</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>3008</td>
			<td>Cell scraper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP linked antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL Plus Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>32132</td>
			<td>ECL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>MP01306</td>
			<td>stock 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-32233</td>
			<td>1:1,000-5,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histone H3 dimethyl K9 monoclonal antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>1220</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D6050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-8 Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>D8000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GROa Quantikine ELISA assay</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DRG00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-N-dimethylformamide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
			<td>DMF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p16 monoclonal antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>51-1325gr</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p21 monoclonal antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-345</td>
			<td>1:750 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p53 monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td>1:500 dilution clone DO-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phospho-H2AX (Ser139) FITC conjugate antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9719</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POWER SYBR-green PCR master mix&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-stained molecular weight markers</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Ambion/Life Tech</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques to induce and quantify cellular senescence

Som svar på cellulär stress eller skada, kan prolifererande celler inducerar ett specifikt program som initierar ett tillstånd av långsiktig cellcykelstopp, benämnd cellulärt åldrande. Ackumulering av åldrande celler inträffar med organism åldrande och genom ständig odling in vitro. Åldrande celler påverkar många biologiska processer, inklusive embryoutveckling, vävnad reparation och förnyelse, tumörundertryckning, och åldrande. Kännetecken åldrande celler innefattar, men är inte begränsade till, ökad senescens-associerade β-galaktosidasaktivitet (SA-β-gal); p16 INK4a, p53, och p21-nivåer; högre nivåer av DNA-skada, inklusive γ-H2AX; bildandet av Åldrande-associerad heterochromatin Foci (SAHF); och förvärvet av en Åldrande associerat Sekretorisk Fenotyp (SASP), ett fenomen som kännetecknas av utsöndring av ett antal pro-inflammatoriska cytokiner och signalmolekyler. Här beskriver vi protokoll för både replika ochDNA-skada-inducerad senescens i odlade celler. Dessutom belyser vi tekniker för att övervaka senescent fenotypen med användning av flera hudåldrande-associerade markörer, inklusive SA-β-gal, γ-H2AX och SAHF färgning, och för att kvantifiera protein och mRNA-nivåer av cellcykelregulatorer och SASP faktorer. Dessa metoder kan tillämpas vid bedömningen av åldrande i olika modeller och vävnader.

Figurer till 2 - 6 visar representativa resultat från SA-β-gal-färgning; färgning för γ-H2AX och SAHF; bedömning av proteinnivåer av p16 INK4a, p21, och p53; och mRNA och proteinnivåer av åldrande-associerade molekyler. Ökade SA-β-gal-färgning sker med replikativ och DNA-skada-inducerad senescens. Också observera morfologiska förändringar som sker med åldrande. Celler blir förstorad och platta jämfört med spindel utseende prolifererande fib...

Watch this Scientific Journal Video about Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence at JoVE.com

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Cellulärt åldrande, den irreversibla tillstånd av cellcykelstopp, kan induceras genom olika cellulära påkänningar. Här beskriver vi protokoll för att framkalla cellulärt åldrande och metoder för att bedöma markörer för åldrande.

Tekniker för att inducera och kvantifiera cellulärt åldrande

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 2

Cell Proliferation

SCIENTISTS IN ACTION

BioMEMS and Cellular Biology: Perspectives and Applications

BioMEMS and Cellular Biology: Perspektiv och program

The ability to culture cells has revolutionized hypothesis testing in basic cell and molecular biology research. It has become a standard methodology in ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Mikroinjektion Tekniker för att studera Mitos i Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Reparation och cellulära svaren på DNA-skador i Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Aseptiska laboratorietekniker: Plating Metoder

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

RNAi screening identifiera Postembryonic fenotyper i C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Telomerlängd och telomerasaktivitet, A Yin och Yang av cellåldrande

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avancerad konfokalmikroskopi tekniker för att studera Protein-protein interaktioner och kinetik på DNA lesioner

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel och effektiv Administration och visualisering av mikropartiklar i cirkulationssystemet av små fiskar använder njure injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Nasal potentialskillnaden att kvantifiera Trans-epitelial Ion Transport i möss

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Tillämpningar av plats och tid kartläggning och partikel analystekniker för att kvantifiera intracellulära Ca2 + signalering In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...