Name: quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Detta arbete finansierades av National Science Foundation beviljar IOS-1256565 och IOS-1557638 till AWS. Vi tackar Patricia Wittkopp och tre anonyma granskare för deras hjälpsamma kommentarer till en tidigare version av detta dokument.

1. Provmontering OBS: Förvara döda flugor i 70% etanol i vatten före bildning. <ol><li> Häll 10 ml 1,25% agar löst i kokande vatten i en 60 mm x 15 mm petriskål och låt den sätta. </li><li> Under ett dissekeringsmikroskop, använd ett par fintpunktappar för att skapa en ~ 20 mm grov, 2 mm bred, 1 mm djup spår i gelens yta. Med hjälp av fina pincett, lägg in den ventrala sidan av en vuxen flyga i spåret, med den dorsala sidan av flugan som skjuter ut ovanför gelén. OBS...

Denna metod möjliggör det exakta, snabba och repeterbara förvärvet av pigmenteringsdata i en kvantitativ form som är lämplig för flera nedströmsanalyser. Metoden har använts för att erhålla data om effekten av temperatur på abdominal pigmentering i en isogen linje av flugor. Metoden kan emellertid användas i fram-genetikstudier för att identifiera gener som ligger till grund för pigmentationsskillnader mellan individer, populationer eller arter eller omvandlingsgenetiska studier för att utforska effekter...

Pigmentering visar enorm fenotypisk variation mellan arter, populationer och individer, och även inom individer under ontogeni 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Även om det finns otaliga studier av pigmentering i ett stort antal djur har pigmentering kanske bäst studerats i Drosophila melanogaster , där molekylärgenetics fulla kraft har använts för att belysa de utvecklings- och fysiologiska mekanismer som reglerar pigmentering och hur dessa mekanismer utvecklas 1 , 6 . Mycket är känt om gener som reglerar den biokemiska syntesen av pigment i D. melanogaster 7 , 8 och de gener som styr den tidsmässiga och rumsliga diFördelning av denna biosyntes 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Vidare har genetisk kartläggning identifierat de genetiska loci som ligger bakom intra- och interspecifika skillnader i pigmentering i D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Förhållandena mellan pigmentering och pleiotropa egenskaper, såsom beteende 18 , 19 och immunitet 19 , 20 har också undersökts, liksom den adaptiva betydelsen av pigmenteringsmönstren 15 , 21 , 22 . Som sådan har pigmentering i D. melanogaster framkommit som en kraftfull men enkel mOdel för utveckling och utveckling av komplexa fenotyper. Pigmentering i vuxen D. melanogaster kännetecknas av tydliga mönster av melanisering över kroppen, särskilt på vingarna och dorsalt thorax och buken. Det är pigmentering av varje kutikulär platta (tergit) på dorsaltabben, men det har fått mest forskningsinspektion. Det finns stor variation i denna pigmentering ( Figur 1A- F ), på grund av både genetiska 17 , 23 och miljömässiga 24 , 25 faktorer. Kutiklet i en buk-tergit består av främre och bakre utvecklingsfack ( Figur 1G ), som var och en kan vidareuppdelas beroende på pigmentering och ornamentation 26 . Det främre facket innehåller sex nagelbandTyperna (a1-a6) och det bakre facket innehåller tre (p1-p3) ( figur 1G ). Av dessa foldas pl, p2 och a1-kutiklet typiskt under tergiten i osträckta buken så att de är gömda. Den tillförlitliga synliga nageln kännetecknas av ett band av tung pigmentering, här kallad &quot;pigmentband&quot;, bestående av nageltyper a4 (hårig med måttliga borstar) och a5 (håriga med stora borstar) med bandets bakre kant Mer intensivt pigmenterad än den främre kanten ( figur 1G ). Anterior till detta band är en region av lätt pigmenterad hårig kutikula, som har borst posteriorly (a3) ​​men inte främre (a2). Variation i pigmentering mellan flugor observeras både i pigmentens intensitet och i pigmentbandets bredd. I allmänhet är variationen störst i de mest bakre segmenten (buksegment 5, 6 och 7) och är lägre i de mer främre segmenten (bukSegment 3 och 4) 24 . Vidare finns det en sexuell dimorfism vid D. melanogasterpigmentering , där män generellt har fullpigmenterad femte och sjätte buk-tergit ( Figur 4C ). I de flesta studier av bukpigmentering i D. melanogaster har pigmentering behandlats som en kategorisk eller ordinär egenskap, mönstret mätt kvalitativt 27 , 28 , 29 eller halvkvantitativt i en skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Dessa metoder har oundvikligen en brist på precision, och eftersom de är beroende av den subjektiva bedömningen av pigmentering är det svårt att jämföra data mellan studier. Flera författare har kvantifierat de rumsliga dimensionerna för pigmentering 38 , 39 , intensiteten av pigmentering av en särskild kutikeltyp 23 , 25 , 39 , 40 eller pigmentens genomsnittliga intensitet över hela buk-tergiten som helhet 41 , 42 , 43 . Ändå mäter dessa kvantifieringsmetoder inte både intensiteten och den rumsliga fördelningen av bukpigmentering samtidigt och därmed fångar inte nyanser av hur pigmentering varierar över abdomenOminal tergit. Vidare fordrar flera av dessa kvantifieringsmetoder 38 , 41 , 42 , 43 dissektion och montering av bukpartikeln. Detta är både tidskrävande och förstör provet, vilket gör det otillgängligt för ytterligare morfologiska analyser. Eftersom förståelsen för utveckling och utveckling av bukpigmentering fördjupas, kommer mer sofistikerade verktyg att snabbt och exakt mäta både rumsfördelningen och pigmentens intensitet. Det övergripande målet med denna metod är att utnyttja digital bildanalys för att erhålla ett replikerbart och mer exakt mått på bukpigmenteringen i D. melanogaster . Metoden omfattar tre steg. För det första är den vuxna flyget icke destruktivt monterad, och en digital bild av dorsal buken tas. För det andra använder användaren ett ImageJ-makroDefinierar en främre-posterior remsa av pixlar som sträcker sig från framsidan av a2-kutiklet till den bakre delen av a5-kutiklet (grön lådan, figur 1G ) på både det tredje och det fjärde buksegmentet. Det genomsnittliga pixelvärdet över bredden av denna remsa extraheras sedan längs sin längdaxel, vilket alstrar en profil som fångar rumsfördelningen och intensiteten av pigmenteringen när den ändras från den främre till den bakre delen av tergiten. För det tredje används ett R-skript för att beskriva pigmenteringsprofilen matematiskt med hjälp av en kubisk spline. R-skriptet använder sedan spline och dess första och andra derivat för att extrahera bredden på a2-a5-kutiklet, pigmentbandets bredd och pigmentens maximala och minsta nivåer. Metoden kvantifierar därför både de rumsliga egenskaperna och djupet av bukpigmenteringen. Denna metod kvantifierar pigmenteringen av den tredje och fjärde buken tergiten,Som har varit i fokus för många tidigare studier 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , antingen exklusivt eller i kombination med mer bakre tergiter. Även om det är mindre variabelt än den femte och sjätte buk-tergiten, är den tredje och fjärde tergiten inte helt pigmenterad hos män, så detta protokoll kan tillämpas på både män och kvinnor. Trots detta kan protokollet användas för att mäta pigmentering i femte och sjätte buk-tergiten hos kvinnor. Vidare bör mindre modifieringar av de skript som används för att extrahera pigmenteringsprofilens egenskaper låta metoden användas för att kvantifiera variationen i pigmentering i en mängd andraorganismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Biology Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck Cold Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Control Software</td>
			<td>Micro-Manager v1.3.20</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>R 3.3.2</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDWE-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 75 Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Klarman Rulings, Inc.</td>
			<td>KR-867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

Pigmentering är ett morfologiskt enkelt men mycket variabelt drag som ofta har adaptiv betydelse. Den har fungerat i stor utsträckning som en modell för att förstå utvecklingen och utvecklingen av morfologiska fenotyper. Abdominal pigmentering i Drosophila melanogaster har varit särskilt användbar, så att forskare kan identifiera de loci som ligger till grund för inter- och intraspecifika variationer i morfologi. Hittills har D. melanogaster bukpigmentering i stor utsträckning analyserats kvalitativt, genom scoring, snarare än kvantitativt, vilket begränsar formerna för statistisk analys som kan appliceras på pigmentationsdata. Detta arbete beskriver en ny metod som möjliggör kvantifiering av olika aspekter av abdominalpigmenteringsmönstret hos vuxen D. melanogaster . Protokollet innehåller provmontering, bildinspelning, datautvinning och analys. All programvara som används för makroer för bildinspelning och analysfunktionSkrivet för open-source bildanalys. Fördelen med detta tillvägagångssätt är möjligheten att exakt mäta pigmenteringsegenskaper med hjälp av en metod som är mycket reproducerbar över olika bildsystem. Medan tekniken har använts för att mäta variation i tergalpigmenteringsmönstren hos vuxen D. melanogaster är metoden flexibel och i stor utsträckning tillämplig på pigmenteringsmönster i otaliga olika organismer.

Protokollet användes för att undersöka effekten av uppfödningstemperatur på bukpigmentering. Tidigare studier har visat att en ökning av utvecklingstemperaturen resulterar i en minskning av spridningen av bukpigmentering hos flera arter av Drosophila , inklusive D. melanogaster 30 , 32 . Specifikt, i buk-tergiterna 3 och 4, minskar pigmentens omfattning (bredden av pigmentbandet) från 17 ° C till 25 ° C...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Detta arbete presenterar en metod för att snabbt och exakt kvantifiera abdominal pigmentering av Drosophila melanogaster med hjälp av digital bildanalys . Denna metod effektiviserar förfarandena mellan fenotypförvärv och dataanalys och innefattar provmontering, bildförvärv, pixelvärdesutvinning och egenskapsmätning.

Kvantifiering av bukpigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Märkning av mitokondrie-DNA-replikering i Drosophila vuxen Äggstockar från edu färgning

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

High Fat Diet utfodring och hög genomströmning Triacylglyceride test på Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Hög upplösning fluorescerande In Situ hybridisering i Drosophila embryon och vävnader med Tyramide Signal förstärkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System (REQS)

Measuring Exercise Levels in Drosophila melanogaster Using the Rotating Exercise Quantification System REQS

Mäta motion nivåer i Drosophila melanogaster använder den roterande motion kvantifiering systemet (REQS)

Drosophila melanogaster is a new model organism for studies in exercise biology. To date, two main exercise systems, the Power Tower and the Treadwheel ...

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

Motionsredskap: Intervall träning protokoll för försiktigt inducerad övning i Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Rening av låg-riklig celler i Drosophila visuella systemet

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Ett test för att kvantifiera protein-RNA-bindning i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funktionell studie av sjukdomsassocierade sällsynta humana varianter med hjälp av Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo framåt genetisk skärm för att identifiera nya neuroprotektiva gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

En robust Polymerase kedjereaktion-baserad analys för att kvantifiera cytosin-guanine-Guanintrinukleotidrepetitioner i bräcklig X mental retardation-1 gen

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...