Name: quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
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Diese Arbeit wurde gefördert von National Science Foundation gewährt IOS-1256565 und IOS-1557638 an AWS. Wir danken Patricia Wittkopp und drei anonymen Rezensenten für ihre hilfreiche Kommentare zu einer früheren Version dieses Artikels.

1. Probenmontage HINWEIS: Tote Fliegen in 70% Ethanol in Wasser vor der Bildgebung. <ol><li> Gießen Sie 10 ml 1,25% Agar in kochendem Wasser in einer 60 mm x 15 mm Petrischale aufgelöst und lassen Sie es einstellen. </li><li> Unter einem Sektionsmikroskop verwenden Sie ein Paar Feinpinzetten, um eine ~ 20 mm ong, 2 mm breite, 1 mm tiefe Rille in der Oberfläche des Gels zu machen. Mit feinen Zangen, eingebettet die ventrale Seite einer erwachsenen Fliege in die Nut, wobei die dorsale Seite der Fliege über das Gel vorspringt. HINWEIS: Die Lockerheit des Gels ermöglicht eine einfache Neupositionierung ohne Beschädigung der Probe. Die gleiche Rille kann für mehrere Exemplare verwendet werden, obwohl es schmutzig, aufgebrochen und unbrauchbar mit der Zeit wird. Der Benutzer kann dann eine weitere Nut in demselben Gel machen. Jede Platte kann verwendet werden, um ~ 200 Fliegen abzubilden. </li><li> Die Probe in 70% igem Ethanol vollständig in Wasser abdecken, um Lichtreflexionen aus der wachsartigen Nagelhaut zu reduzieren und die Flügelschäden zu verhindernProbekörpermanipulation. </li></ol> 2. Mikroskop-Setup HINWEIS: Die Bilder werden unter Verwendung eines Sektionsbereichs, einer Durchlichtbasis, einer Digitalkamera und einer Schwanenhals-Kaltlichtquelle, die an einem Computer angeschlossen sind, der eine Bilderfassungssteuerungssoftware ausführt, aufgenommen. Software-Anweisungen sind spezifisch für Micro-Manager v1.4.20 44 , die eine Open-Source-Software ist, die ImageJ 45 enthält . <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, Digitalkamera, Doppel-Schwanenhals Kaltlichtquelle und Computer. </li><li> Führen Sie die Bildaufnahme-Software aus, um ein Micro-Manager-Fenster und ein ImageJ-Fenster zu öffnen. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf &quot;Image&quot;&gt; &quot;Type&quot;&gt; &quot;8-Bit&quot;, um alle Bilder als 8-Bit zu setzen. Klicken Sie im Mikro-Manager-Fenster auf &quot;live&quot;, um ein Fenster &quot;Snap / Live&quot; zu öffnen, das eine Echtzeitvorschau von der Kamera zeigt. <ol><li> Maximieren Sie die Größe des &quot;Snap / Live&quot; -Fensters, wenn neCessary Wählen Sie im Pulldown-Menü &quot;Display-Modus&quot; im Register &quot;Kontrast&quot; des Micro-Manager-Fensters &quot;Graustufen&quot;. </li></ol></li><li> Schalten Sie die kalte Lichtquelle auf ihre maximale Intensität ein und positionieren Sie die Spitzen jedes Schwanenhalses auf ca. 120 mm von der Bühne, eine auf der linken und eine auf der rechten Seite. HINWEIS: Die Benutzer können auch einen ringförmigen Illuminator verwenden, obwohl dies einen Ring von reflektiertem Licht um den Fliegenabdomen erzeugen kann. </li><li> Manuelles Setzen der Mikroskopvergrößerung auf 60X, so dass das Gesichtsfeld eine Fläche von etwa 3 mm Durchmesser auf der Bühne einfängt. </li><li> Legen Sie ein 2 mm Bühnenmikrometer auf die Bühne (Umschalten des Hintergrundes auf Weiß, wenn nötig). Beim Betrachten der Live-Vorschau konzentrieren Sie sich auf den Bühnenmikrometer und passen die Belichtung im Micro-Manager-Fenster an, indem Sie die Belichtungszeit in ms im Feld &quot;Exposure&quot; eingeben. </li><li> Um die Kamera räumlich zu kalibrieren, wählen Sie das Werkzeug &quot;Gerade&quot; in tEr ImageJ Fenster und zeichne eine Linie die Länge der Bühnenmikrometer. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf &quot;Analysieren&quot;&gt; &quot;Set Scale&quot;, um das Fenster &quot;Set Scale&quot; zu öffnen, geben Sie die Länge des Mikrometers in μm in das Feld &quot;Bekannte Distanz&quot; ein und geben Sie &quot;μm&quot; in die &quot;Längeneinheit&quot; Box. <ol><li> Beachten Sie, dass das Fenster &quot;Set Scale&quot; dann die Skala in &quot;Pixel / μm&quot; anzeigt. Notieren Sie sich die Skala und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Klicken Sie im Fenster &quot;Snap / Live&quot; auf &quot;Stop&quot; und dann &quot;Snap&quot;, um ein Bild des Bühnenmikrometers zu erfassen. </li><li> Speichern Sie das Bild als 8-Bit-Graustufen-TIFF, um die Möglichkeit zu gewährleisten, die Bilder bei Bedarf räumlich zu kalibrieren. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf &quot;Datei&quot;&gt; &quot;Speichern unter&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot; Geben Sie an, wo die Datei im Dateibrowser gespeichert werden soll, benennen Sie die Datei und klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Schalte die Bühne schwarz und platzEine Petrischale, die eine Fliege in Agar (Schritte 1.1-1.2) auf der Bühne montiert hat. </li><li> Schauen Sie durch das Mikroskop und positionieren Sie die Fliege, um sicherzustellen, dass die dorsale Mittellinie gerade ist, um das Pigmentmuster am besten zu sehen. Bewegen Sie alle Flügel und Anhänge, um sicherzustellen, dass der Blick auf den Bauch ist ungehindert. Wenn die pigmentierte Nagelhaut (a2-a5) nicht sichtbar ist, quetschen Sie den Bauch seitlich, bis er ist (obwohl der Abdomen der Fliegen in 70% Ethanol in Wasser gespannt ist, so dass dies normalerweise nicht notwendig ist). HINWEIS: Bei der Positionierung der Fliege muss der Benutzer eine niedrigere Vergrößerung (20X) verwenden. Die Vergrößerung muss auf 60X zurückgesetzt werden, bevor Sie fortfahren. </li><li> Manuell auf den dorsalen Abdomen der Fliege fokussieren Manuell die Spitzen der Lichtquelle einstellen, um die Schatten und die Reflexion auf dem Rückenabfall zu minimieren. </li><li> Beim Betrachten der Live-Vorschau auf dem Computerbildschirm und mit dem Pixelwert-Histogramm auf der Registerkarte &quot;Kontrast&quot; des Micro-Manager-Fensters,Stellen Sie die Belichtung wie in Schritt 2.4 beschrieben ein, um den Bereich der Pixelwerte des Vorschaubildes zu maximieren. </li><li> Entfernen Sie die Fliege und Petrischale und ersetzen Sie sie mit einer LED (spektrale Ausgabe von 430-660 nm), die an einen Spannungsmesser angeschlossen ist, der im Sichtfeld an der gleichen Position wie die Fliege zentriert ist. Verwenden Sie die LED und den Spannungsmesser als Lichtzähler 46 und notieren Sie die Spannung, die durch das auf die LED auftreffende Licht (~ 125 mV) erzeugt wird. HINWEIS: Der LED- und Spannungsmesser wird verwendet, um sicherzustellen, dass die Lichtwerte über mehrere Bildgebungssitzungen in einem einzigen Experiment konstant sind. </li><li> Für die Dauer des Experiments darf die Position oder Intensität der Lichtquelle, die Vergrößerung des Mikroskops oder die Belichtung der Kamera nicht weiter verändert werden. </li></ol> 3. Probenbildgebung <ol><li> Legen Sie eine Petrischale mit einer Fliege in Agar (Schritte 1.1-1.3) auf dem schwarzen Mikroskopstadium montieren. Stellen Sie die Position der Fliege so ein, dass die dritte und vierteH Abdominalsegmente sind sichtbar und die dorsale Mittellinie ist gerade, wie in Schritt 2.9 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Vergrößerung bei 60x ist, bevor Sie fortfahren. </li><li> Manuell fokussieren Sie das Mikroskop so, dass die dritte und vierte dorsale Bauch-Tergite im Fokus sind. Verwenden Sie die Bildaufnahme-Software, um ein Bild als 8-Bit-Graustufen-TIFF zu erfassen, wie in Schritt 2.6 beschrieben. HINWEIS: Das Bild kann farbig aufgenommen und anschließend zur Analyse in Graustufen umgewandelt werden. </li><li> Speichern Sie das Bild als &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot;, wie in Schritt 2.7 beschrieben. HINWEIS: Hier ist [SESH] konstant, [000] ist die Sitzungsnummer und ist variabel, muss aber drei Ziffern lang sein und [sampleID] ist was auch immer der Benutzer wünscht, obwohl er keine zusätzlichen Unterstrichzeichen (_) enthalten muss Muss eine konstante Länge haben. [SampleID] sollte Details der Faktoren enthalten, die bei der Analyse der Pigmentierungsdaten ( z. B. Temperatur oder Abstammung) verwendet werden, die durch ein unverwechselbares Nicht-Alphabeti getrennt sindCal-Charakter, wie ein Bindestrich (-). Dies ermöglicht es, diese Faktoren einfach aus [sampleID] unter Verwendung von standardisierter statistischer Software zu analysieren. </li><li> Entfernen Sie die Petrischale von der Bühne und ersetzen Sie die Fliege mit dem nächsten Exemplar. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.3, bis alle Exemplare abgebildet wurden, ohne die Beleuchtungsstärke, die Vergrößerung oder die Belichtung weiter einzustellen. </li></ol> 4. Imaging über mehrere Sessions <ol><li> Wenn Bilder über mehrere Sitzungen aufgenommen werden müssen, pflegen Sie die Lichtintensität, die Belichtung und die Vergrößerung über die Sitzungen. Prüfen Sie zu Beginn jeder Sitzung die räumliche Kalibrierung der Kamera (Schritt 2.4) und die Lichtintensität auf der Bühne (gemessen am LED / Spannungsmesser, Schritt 2.12). </li><li> Erfassen und Speichern eines Bildes des Bühnenmikrometers (Schritte 2.5-2.7), um die Möglichkeit zu gewährleisten, die Bilder bei Bedarf räumlich zu kalibrieren. </li><li> Verwenden Sie mindestens 15 Kontrollproben und geben Sie sie nach dem Zufallsprinzip in jeder Sitzung nach allo vorW für die Erkennung und Beseitigung von Session-Effekten. Stellen Sie sicher, dass doppelte Kontrollproben zwischen den Sitzungen die gleiche [sampleID] aber unterschiedliche [SESH000] haben. ANMERKUNG: Die Kontrollproben sind Fliegen, die gesammelt, gespeichert und identisch an experimentelle Exemplare angebracht werden, aber über Sessions neu abgebildet werden. Die genaue Anzahl der Kontrollproben hängt vom experimentellen Setup des Benutzers ab. Weitere Details finden Sie in der Diskussion. </li></ol> 5. Bildanalyse HINWEIS: Die Bildanalyse wird in ImageJ 45 durchgeführt und verwendet das Makro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot;, das als Ergänzungsdatei zur Verfügung gestellt wird. <ol><li> Platzieren Sie alle zu analysierenden Bilder im selben Ordner. </li><li> Starten Sie ImageJ und führen Sie das Makro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; durch Klicken auf &quot;Plugins&quot;&gt; &quot;Macro&quot;&gt; &quot;Run&quot;, &quot;Auswählen von&quot; Pigmentation.ijm &quot;im Dateibrowser und klicken Sie auf&quot;öffnen.&quot; HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte befinden sich im Makro. Jeder Schritt ist ein einzelner Makrobefehl. </li><li> Beachten Sie, dass ein Dialogfeld &quot;Action Required&quot; geöffnet wird, unter Angabe von &quot;Wählen Sie den Ordner, in dem Bilder gespeichert sind&quot;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; und verwenden Sie den Dateibrowser, um den Ordner auszuwählen, der die Bilder enthält, und klicken Sie dann auf &quot;Auswählen&quot;. </li><li> Beachten Sie, dass ein Dialogfeld &quot;Action Required&quot; geöffnet wird, indem Sie &quot;Wählen Sie den Ordner, in dem die Daten gespeichert werden sollen&quot;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot; und wählen Sie mit dem Dateibrowser den gewünschten Ordner zum Speichern der Pigmentprofile aus. Klicken Sie auf &quot;wählen&quot;. </li><li> Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet und &quot;Wie viele Zeichen in Ihrer Beispiel-ID?&quot; Geben Sie im Eingabefeld Eingabe die Anzahl der Zeichen in [SampleID] ein, wie in Schritt 3.3 angegeben, und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Beachten Sie, dass ein Dialogfenster geöffnet wird und fragt: &quot;Wie weit ist dein ROI?&quot; Geben Sie im Eingabefeld Eingabe die Pixelbreite des anterior-Posteriorer Streifen, entlang dem das Pigmentierungsprofil zu lesen ist (grünes Rechteck, Abbildung 1G , Abbildung 2A und 2A &#39;). OK klicken;&quot; Die Voreinstellung ist 20 Pixel. ANMERKUNG: Das Pigmentprofil wird über einen Streifensäge und nicht durch eine Linie gelesen, um Lärm durch Haare und Borsten zu reduzieren. Die Breite dieses Streifens hängt von der Auflösung des Bildes ab, aber es sollte ~ 1 / 20th der Breite des Bauches in Pixeln sein. </li><li> Beachten Sie, dass das Makro das Bild der ersten Fliege öffnet und ein Dialogfenster fragt, ob die aktuelle Fliege zu messen ist (klicken Sie auf &quot;Ja&quot;), um zur nächsten Fliege zu gelangen (klicken Sie auf &quot;Nein&quot;) oder um das zu verlassen Makro (klicken Sie auf &quot;Abbrechen&quot;). </li><li> Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet, unter Angabe von &quot;Definieren Sie die Mittellinie des dorsalen Abdomens, von ANTERIOR bis POSTERIOR&quot;. Das Werkzeug &quot;Gerade Linie&quot; wird bereits ausgewählt. Zeichne eine Linie von vorne nach hintenUm die Mittellinie des dorsalen Bauches zu definieren. OK klicken;&quot; Siehe Abbildung 2A und 2A &#39;, gelbe Linie. HINWEIS: Dies wird verwendet, um das Bild neu auszurichten, so dass die dorsale Mittellinie horizontal über dem Bildschirm liegt, mit dem vorderen auf der linken Seite, wodurch die nachfolgenden Schritte erleichtert werden. </li><li> Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet, unter Angabe von &quot;Definieren Sie die POSTERIOR-Kante von Tergite 4 direkt hinter dem Pigmentband.&quot; Das Werkzeug &quot;Gerade Linie&quot; wird bereits ausgewählt. Zeichnen Sie eine Linie von der hinteren Mittellinienkante zur rechten Seitenkante, so dass die Mitte der Linie (markiert durch ein weißes Quadrat) gerade nach hinten zum hinteren Rand des Pigmentbandes (Nagelhaut a5) sitzt. OK klicken;&quot;. Siehe Abbildung 2A und 2A &#39;, Magenta-Linie. HINWEIS: Das R- Skript erkennt automatisch die hintere Kante des Pigmentbandes aus dem Pigmentprofil. </li><li> Beachten Sie, dass ein DialogKasten öffnet sich und sagt: &quot;Definiere die ANTERIOR Kante von Tergite 4 an der vorderen Kante der pigmentierten Nagelhaut (a2).&quot; Das Werkzeug &quot;Gerade Linie&quot; wird bereits ausgewählt. Zeichnen Sie eine Linie von der vorderen Mittellinie zur rechten Seitenkante, so dass die Mitte der Linie (markiert durch ein weißes Quadrat) am vorderen Rand der pigmentierten Nagelhaut (Nagelhaut a2) sitzt. OK klicken;&quot;. Siehe Abbildung 2A und 2A &#39; , Cyan-Linie. HINWEIS: Das R- Skript definiert diesen Punkt als die vordere Kante der pigmentierten Nagelhaut der Tergite. Auf dem Bild zeigt das Makro den interessierenden Bereich (ROI) an, entlang dem das Pigmentierungsprofil gelesen wird (grünes Rechteck, Fig. 2A und 2A &#39;, vergrößert in Fig. 2B und 2B &#39;). Das Makro öffnet auch ein zweites Fenster mit dem Pigmentprofil für den ROI ( Figur<html> E 2C und 2C &#39;), wobei die x-Achse die Position ist, ausgedrückt als Anzahl der Pixel von der hinteren Kante des Profils, und die y-Achse ist der durchschnittliche Pixelwert an jeder Position. </li><li> Sehen Sie sich die Plots des Pigmentierungsprofils an, das vom Makro geöffnet wird. Wenn nötig, klicken Sie im Profilfenster auf &quot;Live&quot;, um die Position des ROI so einzustellen, dass es keine Strukturen ( zB Borsten) enthält, die das Pigmentprofil beeinflussen würden. Sobald das Profil zufrieden stellend ist, klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.8-5.11 für Tergite 3. HINWEIS: Das Makro exportiert dann die Pigmentierungsprofile als zwei CSV-Dateien, die jeweils &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot; genannt werden, wobei [SESH000_samplename] der Bildname ist und [TX] entweder T3 oder T4 für die dritte und vierte Tergite ist. </li><li> Beachten Sie, dass das Makro das nächste Bild öffnet. Wiederholen Sie die Schritte 5.7-5.13, bis alle Bilder analysiert wurden. </li></ol>Jove_title &quot;&gt; 6. Datenvorverarbeitung, Analyse und Sitzungskorrektur HINWEIS: Alle Datenanalyse wird in R 47 durchgeführt und verwendet das Skript &quot;Analyse von Pigmentation.R&quot;. Unten, &quot;L ...&quot; gibt an, welche Zeile (n) des Skripts für jeden Teil der Analyse laufen soll. Weitere Informationen darüber , wie die Analyse durchgeführt wird, finden Sie in den ergänzenden Informationen. <ol><li> Bearbeiten Sie das R- Skript, um das Arbeitsverzeichnis (L6) einzustellen und den Dateipfad in den Ordner zu definieren, der die .csv-Profile enthält (L11). </li><li> Führen Sie L13-15 aus, um eine Liste der im Profilordner gespeicherten Pigmentierungsprofile zu erzeugen. </li><li> Laden und führen Sie die Funktionen &quot;Leser&quot; und &quot;addPrimaryKey&quot; (L17-41), um die Profile in einem einzelnen Datenrahmen zu lesen. </li><li> Bearbeiten Sie das Skript bei L43, um die räumliche Kalibrierung der Bilder in μm / Pixel anzugeben, wie in Schritt 2.5 bestimmt. </li><li> Laden und führen Sie die &quot;adjusTionen &quot;-Funktion (L46-58), um die Profilposition (x-Achse, Abbildung 2C und 2C &#39;) von Pixeln von-posterior-edge-of-ROI zu μm-von-anterior-edge-of-ROI und dem zu konvertieren Profilwert (y-Achse, Bild 2C und 2C &#39;) vom Pixelwert (0 = schwarz, 255 = weiß) zum Pigmentierungswert (0 = kein Pigment, 255 = maximales Pigment). </li><li> Laden Sie die Funktion &quot;spline.der.er&quot; (L60-71), um die kubische Spline der Pigmentierungsprofile und ihre ersten und zweiten Ableitungen zu erzeugen ( Abbildung 2D - 2F und 2D &#39;- 2F &#39;). </li><li> Laden Sie die &quot;coord&quot; und &quot;assmbly.coord&quot; -Funktionen (L74-163), um zuerst die Position der hinteren (T 3 ) und anterior (T 2 ) Kanten des Pigmentbandes zu extrahieren (Abbildung 2D und 2D &#39;(T1, Fig. 2D und 2D &#39;) und dann die maximalen (P max ) und minimalen (P min ) Pigmentierungswerte, die bei T 3 bzw. T 1 aufgenommen wurden, extrahieren. HINWEIS: Die vordere Kante der a2-Nagelhaut wurde bereits in Schritt 5.9 definiert. </li><li> Optional: Laden und starten Sie die Funktion &quot;chek&quot; (L165-175), um zu prüfen, ob die &quot;Coord&quot; -Funktion die Positionen T 1-3 für ein zufällig ausgewähltes Pigmentprofil korrekt identifiziert. </li><li> Laden Sie die Index- und Metrikfunktionen (L178-193), um eine Datentabelle mit den Überschriften &quot;Session&quot;, &quot;Sample&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot; (eine Verkettung von Sample und Tergite), &quot;P max &quot;, zu erzeugen. &quot;P min &quot;, &quot;W- Band &quot; (Breite des Pigmentbandes, = T3 - T 2 ) und &quot;W tergit &quot; (Breite des pigmentierten cUticles a2-a5, = T 3 ). </li><li> Laden und starten Sie die Funktion &quot;Korrektur&quot; (L196-234), um eine Datentabelle zu erzeugen, die P max und P min für irgendwelche Störungsfaktoren korrigiert, die durch Session-Effekte entstehen. Verwenden Sie die durchschnittliche Erhöhung (oder Abnahme) in P max oder P min von den Kontrollproben, die über die zeitlich benachbarten Sitzungen neu abgebildet wurden. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Methodik ermöglicht die präzise, ​​schnelle und wiederholbare Erfassung von Pigmentierungsdaten in quantitativer Form, die für mehrere nachgeschaltete Analysen geeignet ist. Die Methode wurde verwendet, um Daten über die Wirkung der Temperatur auf die Bauchpigmentierung in einer isogenen Linie von Fliegen zu erwerben. Allerdings könnte die Methodik in Forward-Genetics-Studien verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die den Pigmentierungsunterschieden zwischen Individuen, Populationen oder Spezies zug...

Die Pigmentierung zeigt eine enorme phänotypische Variation zwischen Arten, Populationen und Individuen und sogar innerhalb von Individuen während der Ontogenese 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Obwohl es in einer Vielzahl von Tieren unzählige Pigmenttests gibt, ist die Pigmentierung am besten in Drosophila melanogaster untersucht worden , wo die volle Kraft der Molekulargenetik verwendet wurde, um die Entwicklungs- und physiologischen Mechanismen zu erforschen, die die Pigmentierung regulieren und wie sich diese Mechanismen entwickeln 1 , 6 Es ist viel über die Gene bekannt, die die biochemische Synthese von Pigmenten in D. melanogaster 7 , 8 und den Genen, die das zeitliche und räumliche di kontrollieren, regulierenVerteilung dieser Biosynthese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Darüber hinaus hat die genetische Kartierung die genetischen Loci identifiziert, die intra- und interspezifischen Unterschiede in der Pigmentierung in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 liegen . Auch die Beziehungen zwischen Pigmentierung und pleiotropen Merkmalen wie Verhalten 18 , 19 und Immunität 19 , 20 wurden ebenso erforscht wie die adaptive Bedeutung der Pigmentierungsmuster 15 , 21 , 22 . Als solches ist die Pigmentierung in D. melanogaster als eine mächtige und dennoch einfache m aufgetauchtOdel für die Entwicklung und Entwicklung von komplexen Phänotypen. Pigmentierung im erwachsenen D. melanogaster zeichnet sich durch deutliche Melanisierungsmuster über den Körper, besonders an den Flügeln und dem dorsalen Thorax und Bauch. Es ist die Pigmentierung jeder cuticular Platte (tergite) auf dem dorsalen Abdomen, jedoch, die die meisten Forschung Aufmerksamkeit erhalten hat. Es gibt eine beträchtliche Variation in dieser Pigmentierung (Abbildung 1A- F ), weil sowohl genetische 17 , 23 und Umwelt 24 , 25 Faktoren. Die Nagelhaut eines abdominalen Tergits besteht aus vorderen und hinteren Entwicklungsfächern (Abbildung 1G ), die jeweils je nach Pigmentierung und Ornamentierung weiter unterteilt werden können. Das vordere Fach umfasst sechs NagelhautTypen (a1-a6), und das hintere Kompartiment enthält drei (p1-p3) (Abbildung 1G ). Von diesen werden die p1, p2 und a1 Nagelhaut typischerweise unter dem Tergit in ungedehnten Abdomen gefaltet, so dass sie verborgen sind. Die zuverlässig sichtbare Nagelhaut zeichnet sich durch eine Bande von schwerer Pigmentierung aus, die hier als &quot;Pigmentband&quot; bezeichnet wird und aus Nagelhauttypen a4 (haarig mit mäßigen Borsten) und a5 (behaart mit großen Borsten) mit dem hinteren Rand des Bandes besteht Intensiver pigmentiert als die vordere Kante (Abbildung 1G ). Anterior zu dieser Band ist eine Region von leicht pigmentierten behaarten Nagelhaut, die Borsten nach hinten (a3) ​​aber nicht anteriorly (a2) hat. Eine Variation der Pigmentierung zwischen Fliegen wird sowohl in der Intensität der Pigmentierung als auch in der Breite des Pigmentbandes beobachtet. Im Allgemeinen ist die Variation am stärksten in den hintersten Segmenten (Bauchsegmente 5, 6 und 7) und ist in den anterioren Segmenten niedriger (abdominal seGionen 3 und 4) 24 . Darüber hinaus gibt es einen sexuellen Dimorphismus in D. melanogaster Pigmentierung, wobei Männer im Allgemeinen vollständig pigmentierte fünfte und sechste Bauch-Tergite (Abbildung 4C ) haben. In den meisten Untersuchungen der Bauchpigmentierung in D. melanogaster wurde die Pigmentierung als kategorisches oder ordinales Merkmal behandelt, wobei das Muster qualitativ 27 , 28 , 29 oder halbquantitativ auf einer Skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 gemessen wurde , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Diese Methoden leiden unweigerlich an einem Mangel an Präzision, und weil sie sich auf die subjektive Bewertung der Pigmentierung verlassen, ist es schwierig, die Daten über Studien zu vergleichen. Mehrere Autoren haben die räumlichen Dimensionen der Pigmentierung 38 , 39 , die Intensität der Pigmentierung eines bestimmten Häutchen Typ 23 , 25 , 39 , 40 oder die durchschnittliche Intensität der Pigmentierung über die Bauch-Tergit als Ganzes 41 , 42 , 43 quantifiziert. Dennoch messen diese Quantifizierungsmethoden nicht sowohl die Intensität als auch die räumliche Verteilung der Bauchpigmentierung gleichzeitig und erfassen daher nicht die Nuancen, wie sich die Pigmentierung über den Abd unterscheidetOminal tergite Weiterhin erfordern mehrere dieser Quantifizierungsverfahren 38 , 41 , 42 , 43 die Dissektion und Montage der Bauchhöhle. Dies ist sowohl zeitaufwändig als auch zerstört die Probe, so dass es für weitere morphologische Analysen nicht verfügbar ist. Als das Verständnis der Entwicklung und Entwicklung der Bauchpigmentierung vertieft, werden anspruchsvollere Werkzeuge zur schnellen und präzisen Messung sowohl der räumlichen Verteilung als auch der Intensität der Pigmentierung erforderlich sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die digitale Bildanalyse zu nutzen, um eine replizierbare und präzisere Messung der Bauchpigmentierung in D. melanogaster zu erhalten . Die Methodik umfasst drei Stufen. Zuerst wird die erwachsene Fliege zerstörungsfrei montiert und ein digitales Bild des dorsalen Bauches genommen. Zweitens, mit einem ImageJ-Makro, der BenutzerDefiniert einen anterior-posterioren Streifen von Pixeln, der sich von der vorderen Seite der a2-Nagelhaut bis zum hinteren der a5-Nagelhaut (grüner Kasten, Abbildung 1G ) auf dem dritten und vierten Bauchsegment erstreckt. Der mittlere Pixelwert über die Breite dieses Streifens wird dann entlang seiner langen Achse extrahiert, wodurch ein Profil erzeugt wird, das die räumliche Verteilung und die Intensität der Pigmentierung einfängt, wenn es sich von der vorderen zur hinteren des Tergits ändert. Drittens wird ein R-Skript verwendet, um das Pigmentprofil mathematisch mit einem kubischen Spline zu beschreiben. Das R-Skript verwendet dann das Spline und seine erste und zweite Ableitung, um die Breite der a2-a5-Nagelhaut, die Breite des Pigmentbandes und die maximale und minimale Pigmentierung zu extrahieren. Die Methode quantifiziert daher sowohl die räumlichen Eigenschaften als auch die Tiefe der Bauchpigmentierung. Diese Methodik quantifiziert die Pigmentierung der dritten und vierten Bauch-Tergite,Die im Fokus zahlreicher früherer Studien 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 waren , entweder ausschließlich oder in Kombination mit mehr posterioren Tergiten. Obwohl weniger variabel als die fünfte und sechste Bauch-Tergite, die dritte und vierte Tergite sind nicht vollständig pigmentiert bei Männern, so dass dieses Protokoll kann sowohl für Männer und Frauen angewendet werden. Dennoch kann, wie hier gezeigt, das Protokoll verwendet werden, um die Pigmentierung in der fünften und sechsten Bauch-Tergite bei Frauen zu messen. Darüber hinaus sollten kleinere Modifikationen der Skripte, die verwendet werden, um die Eigenschaften des Pigmentierungsprofils zu extrahieren, das Verfahren zur Quantifizierung der Variation der Pigmentierung in einer Vielzahl von anderen verwendenOrganismen

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Biology Forceps</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>Gooseneck Cold Light Source</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>Image Acquisition Control Software</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Image Analysis Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Fluke</td><td>Fluke 75 Series II</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

Pigmentierung ist ein morphologisch einfaches, aber sehr variables Merkmal, das oft anpassungsfähige Bedeutung hat. Es hat vielmehr als Modell für das Verständnis der Entwicklung und Entwicklung von morphologischen Phänotypen gedient. Die Bauchpigmentierung in Drosophila melanogaster war besonders nützlich, so dass Forscher die Locus identifizieren können, die inter- und intraspezifischen Variationen in der Morphologie zugrunde liegen. Bisher wurde jedoch die D. melanogaster- Bauchpigmentierung weitgehend qualitativ durch Scoring statt quantitativ untersucht, was die Formen der statistischen Analyse begrenzt, die auf Pigmentationsdaten angewendet werden können. Diese Arbeit beschreibt eine neue Methodik, die die Quantifizierung verschiedener Aspekte des Bauchpigmentierungsmusters des erwachsenen D. melanogaster ermöglicht . Das Protokoll umfasst Probenmontage, Bildaufnahme, Datenextraktion und Analyse. Die gesamte Software, die für die Bildaufnahme und Analyse verwendet wird, verfügt über MakrosGeschrieben für Open-Source-Bildanalyse. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, Pigmentierungsmerkmale präzise zu messen, wobei eine Methodik verwendet wird, die über verschiedene Abbildungssysteme hoch reproduzierbar ist. Während die Technik verwendet wurde, um die Variation in den tergischen Pigmentierungsmustern des erwachsenen D. melanogaster zu messen , ist die Methodik flexibel und breit auf Pigmentierungsmuster in unzähligen verschiedenen Organismen anwendbar.

Das Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung der Aufzuchttemperatur auf die Bauchpigmentierung zu untersuchen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Entwicklungstemperatur zu einer Verringerung der Ausbreitung der Bauchpigmentierung bei mehreren Arten von Drosophila führt , einschließlich D. melanogaster 30 , 32 . Speziell bei den Bauch-Tergiten 3 und 4 nimmt das Ausmaß der Pigmentierung (B...

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Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung.

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

8.9K Aufrufe.  Lake Forest College.  Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung. 

Serie: Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Eine Screening-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin-fördernden Medikamenten mit Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Forschung

Genetik

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Färben Insekten für Verhaltenstests: die Paarungsverhalten von narkotisierten<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Neurowissenschaften

<meta charset="utf8"></head><body>Unverzerrte Quantifizierung von Ommatidien in Drosophila-Augenmodellen

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal pattern. This regularity and ease of observation make the Drosophila eye system a powerful tool to model various human neurodegenerative diseases. However, ways of quantifying abnormal phenotypes, such as manual ranking of eye severity scores, have limitations, especially when ranking weak alterations in eye morphology. To overcome these limitations, computational approaches have been developed such as Flynotyper. The use of a ring light allows for better qualitative images accessing the intactness of individual ommatidia. However, these images cannot be analyzed by Flynotyper directly due to shadows on ommatidia introduced by the ring light. Here, we describe an unbiased way to quantify rough eye phenotypes observed in Drosophila disease models by combining two software, ilastik and Flynotyper. By preprocessing the images with ilastik, successful quantification of the rough eye phenotype can be achieved with Flynotyper.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Quantifizierung von Phänotypen rauer Augen in Drosophila-Modellen der amyotrophen Lateralsklerose mit frontotemporaler Demenz

The Drosophila eye system is a useful tool for studying various biological processes, particularly human neurodegenerative diseases. However, manual quantification of rough eye phenotypes can be biased and unreliable. Here we describe a method by which ilastik and Flynotyper are used to quantify eye phenotype in an unbiased way.

Quantifizierung von Drosophila melanogaster Augenphänotypen: Ein computergestützter Ansatz zur Integration von Ilastik und Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

Entwicklungsbiologie

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biologie

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

Elektrophysiologische Methoden zur Messung des Photopigmentgehalts in Drosophila-Photorezeptoren

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

Methoden zur Inszenierung Pupal Perioden und Messung der Flügel Pigmentierung der Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in

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Eine Screening-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin-fördernden Medikamenten mit Drosophila

Färben Insekten für Verhaltenstests: die Paarungsverhalten von narkotisierten

Quantifizierung von Drosophila melanogaster Augenphänotypen: Ein computergestützter Ansatz zur Integration von Ilastik und Flynotyper

Quantifizierung von Drosophila melanogaster Augenphänotypen: Ein computergestützter Ansatz zur Integration von Ilastik und Flynotyper

Quantifizierung von Drosophila melanogaster Augenphänotypen: Ein computergestützter Ansatz zur Integration von Ilastik und Flynotyper

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster

Elektrophysiologische Methoden zur Messung des Photopigmentgehalts in Drosophila-Photorezeptoren

Optische Quantifizierung der intrazellulären pH in Drosophila Melanogaster Malpighian Röhrchen Epithelien mit einem fluoreszierenden genetisch codierte pH Indikator

Methoden zur Inszenierung Pupal Perioden und Messung der Flügel Pigmentierung der Drosophila guttifera