Name: quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
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Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional da Ciência que concede IOS-1256565 e IOS-1557638 à AWS. Agradecemos a Patricia Wittkopp e a três revisores anônimos por seus comentários úteis sobre uma versão anterior deste artigo.

1. Montagem da amostra NOTA: Armazene as moscas mortas em etanol a 70% na água antes da imagem. <ol><li> Despeje 10 mL de agar 1,25% dissolvido em água fervente em uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm e deixe-o ajustar. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, use um par de pinças de ponto fino para criar um sulco de aproximadamente 20 mm de largura, 2 mm de largura e 1 mm de profundidade na superfície do gel. Usando pinças finas, incorpora o lado ventral de uma mosca adulta no sulco, com o lado dorsal da mosca projetando acima do gel. NOTA: A folga do gel permite um fácil reposicionamento sem danificar a amostra. O mesmo sulco pode ser usado para vários espécimes, embora ele se torne sujo, quebrado e inutilizável com o tempo. O usuário pode fazer outro sulco no mesmo gel. Cada placa pode ser usada para imagens ~ 200 moscas. </li><li> Cubra completamente o espécime em etanol a 70% em água para reduzir quaisquer reflexos de luz da cutícula cerosa e para evitar danos nas asas durManipulação de espécimes. </li></ol> 2. Configuração do microscópio NOTA: As imagens são adquiridas usando um escopo de dissecação, uma base de luz transmitida, uma câmera digital e uma fonte de luz fria de colo de ganso anexada a um computador que executa o software de controle de aquisição de imagens. As instruções de software são específicas do Micro-Manager v1.4.20 44 , que é um software de código aberto que incorpora o ImageJ 45 . <ol><li> Ligue o microscópio, câmera digital, fonte de luz fria de gooseneck e computador. </li><li> Execute o software de captura de imagem para abrir uma janela Micro-Manager e uma janela ImageJ. Na janela ImageJ, clique em &quot;Imagem&quot;&gt; &quot;Tipo&quot;&gt; &quot;8 bits&quot; para configurar todas as imagens como 8 bits. Clique em &quot;live&quot; na janela Micro-Manager para abrir uma janela &quot;Snap / Live&quot; que mostra uma pré-visualização em tempo real da câmera. <ol><li> Maximize o tamanho da janela &quot;Snap / Live&quot; se neCessary. Selecione &quot;Escala de cinza&quot; no menu suspenso &quot;Modo de exibição&quot; na guia &quot;Contraste&quot; da janela Micro-Manager. </li></ol></li><li> Ligue a fonte de luz fria a sua intensidade máxima e posicione as pontas de cada colar de ganso até aproximadamente 120 mm do palco, um à esquerda e um à direita. NOTA: Os usuários também podem usar um iluminador anular, embora isso possa gerar um anel de luz refletida em torno do abdômen da mosca. </li><li> Ajuste manualmente a ampliação do microscópio para 60X, de modo que o campo de visão capture uma área de aproximadamente 3 mm de diâmetro no palco. </li><li> Coloque um micrómetro de estágio de 2 mm no palco (alterando o fundo para o branco, se necessário). Ao olhar para a visualização ao vivo, concentre-se no micômetro do palco e ajuste a exposição na janela do Micro-Manager, digitando o tempo de exposição em ms na caixa &quot;Exposição&quot;. </li><li> Para calibrar espacialmente a câmera, selecione a ferramenta &quot;linha reta&quot; em tEle ImageJ janela e desenhar uma linha do comprimento do micrômetro do palco. Na janela ImageJ, clique em &quot;Analisar&quot;&gt; &quot;Definir Escala&quot; para abrir a janela &quot;Definir Escala&quot;, digite o comprimento do micômetro em μm na caixa &quot;Distância conhecida&quot; e digite &quot;μm&quot; na &quot;Unidade de comprimento&quot; caixa. <ol><li> Veja que a janela &quot;Set Scale&quot;, em seguida, exibe a escala em &quot;pixels / μm&quot;. Anote a escala e clique em &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Na janela &quot;Snap / Live&quot;, clique em &quot;Parar&quot; e depois em &quot;Snap&quot; para capturar uma imagem do micrómetro do estágio. </li><li> Salve a imagem como um TIFF em escala de cinza de 8 bits para garantir a capacidade de calibrar espacialmente as imagens novamente, se necessário. Na janela ImageJ, clique em &quot;Arquivo&quot;&gt; ​​&quot;Salvar como&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot; Especifique onde salvar o arquivo no navegador de arquivos, nomeie o arquivo e clique em &quot;Salvar&quot;. </li><li> Mude o palco para preto e coloqueUma placa de Petri que contém uma mosca montada em ágar (etapas 1.1-1.2) no palco. </li><li> Olhe através do microscópio e posicione a mosca para garantir que a linha média dorsal seja direta para melhor visualizar o padrão de pigmentação. Mova as asas e os apêndices para garantir que a visão do abdome seja desobstruída. Se a cutícula pigmentada (a2-a5) não estiver visível, aperte o abdômen lateralmente até que esteja (embora o abdômen das moscas seja armazenado em etanol a 70% na água, de modo que isso geralmente não seja necessário). NOTA: Ao posicionar a mosca, o usuário pode precisar usar uma ampliação menor (20X). A ampliação deve ser retornada para 60X antes de prosseguir. </li><li> Focalize manualmente o abdômen dorsal da mosca. Ajuste manualmente as pontas da fonte de luz para minimizar as sombras e a reflexão no abdômen dorsal. </li><li> Ao olhar para a visualização ao vivo na tela do computador, e usando o histograma do valor do pixel na guia &quot;Contraste&quot; da janela Micro-Manager,Ajuste a exposição conforme descrito na etapa 2.4 para maximizar o alcance dos valores de pixel da imagem de pré-visualização. </li><li> Remova a mosca e a placa de Petri e substitua-os por um LED (saída espectral de 430-660 nm) conectado a um medidor de tensão, centrado no campo de visão na mesma posição que a mosca. Use o LED e o medidor de tensão como um medidor de luz 46 e grave a tensão gerada pela luz que atinge o LED (~ 125 mV). NOTA: O LED e o medidor de tensão são usados ​​para garantir que os níveis de luz sejam constantes em várias sessões de imagem dentro de uma única experiência. </li><li> Durante a duração da experiência, não altere ainda mais a posição ou intensidade da fonte de luz, a ampliação do microscópio ou a exposição da câmera. </li></ol> 3. Imagem de amostra <ol><li> Coloque uma placa de Petri segurando uma mosca montada em ágar (passos 1.1-1.3) no estágio do microscópio preto. Ajuste a posição da mosca para que o terceiro e o quatroH são visíveis os segmentos abdominais e a linha média dorsal é direta, conforme descrito no passo 2.9. Certifique-se de que a ampliação seja de 60x antes de prosseguir. </li><li> Focalize manualmente o microscópio de modo que o terço e o quarto tergito abdominal dorsal estejam focados. Use o software de captura de imagem para adquirir uma imagem como um TIFF de escala de cinza de 8 bits, conforme descrito no passo 2.6. NOTA: A imagem pode ser capturada em cores e posteriormente convertida em escala de cinza para análise. </li><li> Salve a imagem como &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot;, conforme descrito no passo 2.7. NOTA: Aqui, [SESH] é constante, [000] é o número da sessão e é variável, mas deve ter três dígitos e [sampleID] é o que o usuário deseja, embora não contenha caracteres de sublinhado adicionais (_) e Deve ter um comprimento constante. [SampleID] deve incluir detalhes dos fatores utilizados na análise dos dados de pigmentação ( por exemplo, temperatura ou linhagem), separados por um distintivo não alfabéticoCaracterístico, como um hífen (-). Isso permite que esses fatores sejam facilmente analisados ​​em [sampleID] usando o software estatístico padrão. </li><li> Retire a placa de Petri do palco e substitua a mosca pelo próximo espécime. Repita as etapas 3.1-3.3 até que todos os espécimes tenham sido fotografados, sem ajustar ainda mais os níveis de iluminação, ampliação ou exposição. </li></ol> 4. Imaging entre várias sessões <ol><li> Se as imagens precisam ser tomadas em várias sessões, mantenha a intensidade da luz, a exposição e a ampliação nas sessões. No início de cada sessão, verifique a calibração espacial da câmera (etapa 2.4) e a intensidade da luz no estágio (conforme medido pelo LED / medidor de tensão, etapa 2.12). </li><li> Capture e guarde uma imagem do micrômetro do estágio (etapas 2.5-2.7) para garantir a capacidade de calibrar espacialmente as imagens novamente, se necessário. </li><li> Use pelo menos 15 espécimes de controle e re-crie-os aleatoriamente em cada sessão para alloW para a detecção e eliminação dos efeitos da sessão. Certifique-se de que os espécimes de controle duplicados entre as sessões tenham o mesmo [sampleID] mas diferente [SESH000]. NOTA: As amostras de controle são moscas coletadas, armazenadas e montadas de forma idêntica a espécimes experimentais, mas são reimprimidas em todas as sessões. O número exato de espécimes de controle dependerá da configuração experimental do usuário. Veja a discussão para mais detalhes. </li></ol> 5. Análise de imagem NOTA: A análise de imagem é realizada no ImageJ 45 e usa a macro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; fornecida como um arquivo suplementar. <ol><li> Coloque todas as imagens a serem analisadas na mesma pasta. </li><li> Inicie ImageJ e execute a macro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; clicando em &quot;Plugins&quot;&gt; &quot;Macro&quot;&gt; &quot;Executar&quot;, selecionando &quot;Medição de Pigmentation.ijm&quot; no navegador de arquivos e clicando em &quot;aberto.&quot; NOTA: Todas as etapas subseqüentes estão dentro da macro. Cada passo é um comando de macro individual. </li><li> Observe que uma caixa de diálogo &quot;Ação necessária&quot; é aberta, indicando &quot;Escolha a pasta onde as imagens são armazenadas&quot;. Clique em &quot;OK&quot; e use o navegador de arquivos para selecionar a pasta que contém as imagens e clique em &quot;escolher&quot;. </li><li> Observe que uma caixa de diálogo &quot;Ação necessária&quot; será aberta, indicando &quot;Escolha a pasta onde deseja que os dados sejam armazenados&quot;. Clique em &quot;OK&quot; e use o navegador de arquivos para selecionar a pasta desejada para salvar os perfis de pigmentação. Clique em &quot;escolher&quot;. </li><li> Observe que uma caixa de diálogo será aberta, perguntando &quot;Quantos caracteres em sua identificação de amostra?&quot; Na caixa de entrada de dados, digite o número de caracteres em [SampleID], conforme especificado na etapa 3.3, e clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Observe que uma caixa de diálogo será aberta, perguntando &quot;Quão grande é seu ROI?&quot; Na caixa de entrada de dados, digite a largura do pixel da caixa anterior-Tira posterior ao longo da qual o perfil de pigmentação deve ser lido (retângulo verde, Figura 1G , Figura 2A e 2A &#39;). Clique em &quot;OK&quot;; O padrão é 20 pixels. NOTA: O perfil de pigmentação é lido através de uma tira de cutícula, em vez de uma linha, para reduzir o ruído devido a cabelos e cerdas. A largura desta tira dependerá da resolução da imagem, mas deve ser ~ 1 / 20th da largura do abdômen, em pixels. </li><li> Observe que a macro abrirá a imagem da primeira mosca e uma caixa de diálogo perguntará se deve medir a mosca atual (clique em &quot;Sim&quot;), para passar para a próxima mosca (clique em &quot;Não&quot;) ou para sair da Macro (clique em &quot;Cancelar&quot;). </li><li> Observe que uma caixa de diálogo será aberta, indicando &quot;Definir a linha média do abdômen dorsal, de ANTERIOR a POSTERIOR&quot;. A ferramenta &quot;linha direta&quot; já será selecionada. Desenhe uma linha anterior a posteriorPara definir a linha média do abdômen dorsal. Clique em &quot;OK&quot;; Ver Figura 2A e 2A &#39;, linha amarela. NOTA: Isso é usado para reorientar a imagem de modo que a linha média dorsal esteja horizontalmente na tela, com a anterior na esquerda, facilitando as etapas subseqüentes. </li><li> Observe que uma caixa de diálogo será aberta, indicando &quot;Definir a borda POSTERIOR do Tergite 4 logo atrás da banda de pigmento&quot;. A ferramenta &quot;linha direta&quot; já será selecionada. Desenhe uma linha da borda da linha média posterior para a borda lateral direita, de modo que o centro da linha (marcado por um quadrado branco) se senta apenas posteriormente ao bordo posterior da banda de pigmento (cutícula a5). Clique em &quot;OK;&quot;. Veja a Figura 2A e 2A &#39;, linha magenta. NOTA: O script R irá detectar automaticamente a borda posterior da banda de pigmento a partir do perfil de pigmentação. </li><li> Observe que um diálogoA caixa será aberta, indicando &quot;Definir a borda ANTERIOR do Tergite 4 na borda anterior da cutícula pigmentada (a2)&quot;. A ferramenta &quot;linha direta&quot; já será selecionada. Desenhe uma linha da borda da linha média anterior para a borda lateral direita, de modo que o centro da linha (marcado por um quadrado branco) assente na borda anterior da cutícula pigmentada (cutícula a2). Clique em &quot;OK;&quot;. Veja a Figura 2A e 2A &#39; , linha ciana. NOTA: O script R definirá este ponto como a borda anterior da cutícula pigmentada do tergite. Na imagem, a macro mostrará a região de interesse (ROI) ao longo da qual o perfil de pigmentação é lido (retângulo verde, Figura 2A e 2A &#39;, ampliado na Figura 2B e 2B &#39;). A macro também abrirá uma segunda janela mostrando o perfil de pigmentação do ROI ( Figur<html> E 2C e 2C &#39;), onde o eixo x é a posição, expresso como o número de pixels a partir do bordo posterior do perfil, e o eixo y é o valor médio de pixel em cada posição. </li><li> Veja as parcelas do perfil de pigmentação que serão abertas pela macro. Se necessário, clique em &quot;Live&quot; na janela de perfil para ajustar a posição do ROI para que não inclua estruturas ( por exemplo, cerdas) que influenciem o perfil de pigmentação. Uma vez que o perfil seja satisfatório, clique em &quot;OK&quot;. </li><li> Repita as etapas 5.8-5.11 para o Tergite 3. NOTA: A macro exporta os perfis de pigmentação como dois arquivos CSV, cada um chamado &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot;, onde [SESH000_samplename] é o nome da imagem e [TX] é T3 ou T4 para o terceiro e quarto tergites, respectivamente. </li><li> Observe que a macro abre a próxima imagem. Repita as etapas 5.7-5.13 até que todas as imagens tenham sido analisadas. </li></ol>Jove_title &quot;&gt; 6. Preprocessamento de dados, análise e correção de sessão NOTA: Toda a análise de dados é realizada em R 47 e usa o script &quot;Análise de pigmentação.R&quot; fornecido. Abaixo, &quot;L ...&quot; indica qual linha (s) do script executar para cada parte da análise. Consulte as Informações Suplementares para obter detalhes adicionais sobre como a análise é conduzida. <ol><li> Edite o script R para configurar o diretório de trabalho (L6) e defina o caminho do arquivo para a pasta que contém os perfis .csv (L11). </li><li> Execute L13-15 para gerar uma lista dos perfis de pigmentação armazenados na pasta de perfil. </li><li> Carregue e execute as funções &quot;leitor&quot; e &quot;addPrimaryKey&quot; (L17-41) para ler os perfis em um único quadro de dados. </li><li> Edite o script em L43 para especificar a calibração espacial das imagens em μm / pixels, conforme determinado no passo 2.5. </li><li> Carregar e executar o &quot;ajuste&quot;Tilt &quot;(L46-58) para converter a posição do perfil (eixo dos x, Figura 2C e 2C &#39;) de pixels-de-posterior-borda-de-ROI para μm-de-ângulo anterior-ROI e o Valor do perfil (eixo y, Figura 2C e 2C &#39;) do valor do pixel (0 = preto, 255 = branco) ao valor da pigmentação (0 = nenhum pigmento, 255 = pigmento máximo). </li><li> Carregue e execute a função &quot;spline.der.er&quot; (L60-71) para gerar a spline cúbica dos perfis de pigmentação e suas derivadas primeira e segunda ( Figura 2D -2F e 2D &#39;- 2F &#39;). </li><li> Carregue e execute as funções &quot;coord&quot; e &quot;assmbly.coord&quot; (L74-163), primeiro para extrair a posição das bordas posterior (T 3 ) e anterior (T 2 ) da faixa de pigmento ( Figura 2D e 2D &#39;;) E o bordo posterior da cutícula a2 (T 1 , Figura 2D e 2D &#39;) e, em seguida, extrair os valores de pigmentação máximo (P max ) e mínimo (P min ), tomados em T 3 e T 1 , respectivamente. NOTA: A borda anterior da cutícula a2 já foi definida no passo 5.9. </li><li> Opcional: carregue e execute a função &quot;chek&quot; (L165-175) para verificar se a função &quot;coord&quot; está identificando corretamente as posições T 1-3 para um perfil de pigmentação selecionado aleatoriamente. </li><li> Carregue e execute as funções de índice e métricas (L178-193) para gerar uma tabela de dados com os títulos &quot;Sessão&quot;, &quot;Amostra&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot; (uma concatenação de Sample e Tergite), &quot;P max &quot; &quot;P min &quot;, &quot; banda W&quot; (largura da banda de pigmento, = T3 - T 2 ) e &quot;W tergite &quot; (largura do pigmento cUticles a2-a5, = T 3 ). </li><li> Carregue e execute a função &quot;correção&quot; (L196-234) para gerar uma tabela de dados que corrija P max e P min para quaisquer fatores de incômodo decorrentes dos efeitos da sessão. Use o aumento médio (ou diminuição) em P max ou P min dos espécimes de controle reimprimidos em sessões temporariamente adjacentes. </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Esta metodologia permite a aquisição precisa, rápida e repetitiva de dados de pigmentação em uma forma quantitativa adequada para múltiplas análises a jusante. O método foi utilizado para adquirir dados sobre o efeito da temperatura na pigmentação abdominal em uma linha isogênica de moscas. No entanto, a metodologia poderia ser utilizada em estudos de genética direta para identificar genes que subjazem as diferenças de pigmentação entre indivíduos, populações ou espécies ou estudos genéticos reversos...

A pigmentação mostra uma enorme variação fenotípica entre espécies, populações e indivíduos, e mesmo dentro de indivíduos durante a ontogenia 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Embora existam inúmeros estudos de pigmentação em uma grande variedade de animais, a pigmentação talvez tenha sido melhor estudada em Drosophila melanogaster , onde o poder total da genética molecular tem sido utilizado para elucidar os mecanismos de desenvolvimento e fisiologia que regulam a pigmentação e como esses mecanismos evoluem 1 , 6 . Sabe-se muito sobre os genes que regulam a síntese bioquímica de pigmentos em D. melanogaster 7 , 8 e os genes que controlam o diário temporal e espacialAtribuição desta biossíntese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Além disso, o mapeamento genético identificou os loci genéticos subjacentes às diferenças intra e interespecíficas na pigmentação em D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . As relações entre pigmentação e traços pleiotrópicos, como o comportamento 18 , 19 e a imunidade 19 , 20 , também foram exploradas, assim como o significado adaptativo dos padrões de pigmentação 15 , 21 , 22 . Como tal, a pigmentação em D. melanogaster emergiu como um poderoso e simples mOdel para o desenvolvimento e evolução de fenótipos complexos. A pigmentação no adulto D. melanogaster é caracterizada por padrões distintos de melanização em todo o corpo, particularmente nas asas e tórax dorsal e abdômen. É a pigmentação de cada placa cuticular (tergita) no abdômen dorsal, no entanto, que recebeu a maior atenção na pesquisa. Existe uma variação considerável nesta pigmentação ( Figura 1A- F ), por causa de fatores genéticos 17 , 23 e ambientais 24 , 25 . A cutícula de um tergito abdominal é constituída por compartimentos de desenvolvimento anteriores e posteriores ( Figura 1G ), cada um dos quais pode ser subdividido em função da pigmentação e ornamentação 26 . O compartimento anterior inclui seis cutículasTipos (a1-a6), e o compartimento posterior inclui três (p1-p3) ( Figura 1G ). Destes, a cutícula p1, p2 e a1 são tipicamente dobradas sob o tergito em abdômen não esticado, de modo que estejam escondidas. A cutícula fecamente visível é caracterizada por uma banda de pigmentação pesada, aqui referida como uma &quot;faixa de pigmento&quot;, composta de tipos de cutícula a4 (cabeludo com cerdas moderadas) e a5 (cabeludo com cerdas largas), com a borda posterior da banda Mais intensamente pigmentado do que a borda anterior ( Figura 1G ). Anterior a essa faixa é uma região de cutícula peluda ligeiramente pigmentada, que tem cerdas posterior (a3) ​​mas não anteriormente (a2). A variação na pigmentação entre as moscas é observada na intensidade da pigmentação e na largura da banda de pigmento. Em geral, a variação é maior nos segmentos mais posteriores (segmentos abdominais 5, 6 e 7) e é menor nos segmentos mais anteriores (ponto abdominalGentios 3 e 4) 24 . Além disso, há um dimorfismo sexual na pigmentação de D. melanogaster , com os machos geralmente tendo quinto e sexto tergitos abdominal totalmente pigmentados ( Figura 4C ). Na maioria dos estudos de pigmentação abdominal em D. melanogaster , a pigmentação foi tratada como uma característica categórica ou ordinal, com o padrão medido 27 , 28 , 29 ou semi-quantitativamente na escala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Esses métodos inevitavelmente sofrem de uma falta de precisão, e porque eles dependem da avaliação subjetiva da pigmentação, é difícil comparar os dados entre os estudos. Vários autores quantificaram as dimensões espaciais da pigmentação 38 , 39 , a intensidade da pigmentação de um tipo de cutícula particular 23 , 25 , 39 , 40 ou a intensidade média de pigmentação em todo o tergito abdominal como um todo 41 , 42 , 43 . No entanto, esses métodos de quantificação não medem simultaneamente a intensidade e a distribuição espacial da pigmentação abdominal e, portanto, não captam as nuances de como a pigmentação varia no abd.Tergito ominal. Além disso, vários desses métodos de quantificação 38 , 41 , 42 , 43 exigem a dissecção e a montagem da cutícula abdominal. Isso é demorado e destrói a amostra, tornando-a indisponível para análises morfológicas adicionais. À medida que a compreensão do desenvolvimento e evolução da pigmentação abdominal se aprofunda, serão necessárias ferramentas mais sofisticadas para medir rápida e precisamente a distribuição espacial e a intensidade da pigmentação. O objetivo geral deste método é utilizar a análise de imagem digital para obter uma medida replicável e precisa da pigmentação abdominal em D. melanogaster . A metodologia inclui três estágios. Primeiro, a mosca adulta é montada de forma não destrutiva, e uma imagem digital do abdômen dorsal é tomada. Em segundo lugar, usando uma macro ImageJ, o usuárioDefine uma faixa de pixels anterio-posterior que se estende desde a parte anterior da cutícula a2 até a parte posterior da cutícula a5 (caixa verde, Figura 1G ) tanto no terceiro como no quarto segmentos abdominais. O valor médio de pixels em toda a largura desta tira é então extraído ao longo de seu eixo longo, gerando um perfil que capta a distribuição espacial e a intensidade da pigmentação à medida que ela muda da anterior para a posterior do tergito. Em terceiro lugar, um roteiro R é usado para descrever o perfil de pigmentação matematicamente usando um spline cúbico. O roteiro R então usa o spline e sua primeira e segunda derivada para extrair a largura da cutícula a2-a5, a largura da faixa de pigmento e os níveis máximo e mínimo de pigmentação. O método, portanto, quantifica as características espaciais e a profundidade da pigmentação abdominal. Esta metodologia quantifica a pigmentação do terço e quarto tergitos abdominais,Que tem sido o foco de numerosos estudos anteriores 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , exclusivamente ou em combinação com mais tergitos posteriores. Embora menos variável do que o quinto e sexto tergitos abdominais, o terceiro e o quarto tergitos não são completamente pigmentados em machos, pelo que este protocolo pode ser aplicado tanto aos machos como às fêmeas. No entanto, como mostrado aqui, o protocolo pode ser usado para medir a pigmentação no quinto e sexto tergitos abdominais em fêmeas. Além disso, modificações menores dos scripts utilizados para extrair as características do perfil de pigmentação devem permitir que o método seja usado para quantificar a variação na pigmentação em uma grande variedade de outrosOrganismos.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Biology Forceps</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>Gooseneck Cold Light Source</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>Image Acquisition Control Software</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Image Analysis Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Fluke</td><td>Fluke 75 Series II</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm Petri dish</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>Stage micrometer</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

A pigmentação é uma característica morfologicamente simples, mas altamente variável que muitas vezes tem significância adaptativa. Ele serviu extensivamente como um modelo para a compreensão do desenvolvimento e evolução de fenótipos morfológicos. A pigmentação abdominal na Drosophila melanogaster tem sido particularmente útil, permitindo que os pesquisadores identifiquem os loci subjacentes às variações inter-e intraspecíficas da morfologia. Até agora, no entanto, a pigmentação abdominal de D. melanogaster tem sido amplamente testada qualitativamente, através da pontuação, em vez de quantitativamente, o que limita as formas de análise estatística que podem ser aplicadas aos dados de pigmentação. Este trabalho descreve uma nova metodologia que permite a quantificação de vários aspectos do padrão de pigmentação abdominal de D. melanogaster adulta . O protocolo inclui montagem de amostras, captura de imagem, extração de dados e análise. Todo o software usado para captura e análise de imagens tem macrosEscrito para análise de imagens de código aberto. A vantagem dessa abordagem é a capacidade de medir precisamente os traços de pigmentação usando uma metodologia que é altamente reprodutível em diferentes sistemas de imagem. Embora a técnica tenha sido usada para medir a variação nos padrões de pigmentação tergal do adulto D. melanogaster , a metodologia é flexível e amplamente aplicável aos padrões de pigmentação em inúmeros organismos diferentes.

O protocolo foi utilizado para explorar o efeito da temperatura de criação na pigmentação abdominal. Estudos anteriores mostraram que um aumento na temperatura do desenvolvimento resulta em uma diminuição da disseminação da pigmentação abdominal em várias espécies de Drosophila , incluindo D. melanogaster 30 , 32 . Especificamente, em tergitos abdominais 3 e 4, a extensão da pigmentação (largura d...

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Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Este trabalho apresenta um método para quantificar rápida e precisamente a pigmentação abdominal de Drosophila melanogaster usando a análise de imagem digital. Este método simplifica os procedimentos entre aquisição de fenótipo e análise de dados e inclui montagem de espécimes, aquisição de imagem, extração de valor de pixel e medição de características.

Quantificando pigmentação abdominal em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

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Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

8.9K visualizações.  Lake Forest College.  Este trabalho apresenta um método para quantificar rápida e precisamente a pigmentação abdominal de Drosophila melanogaster usando a análise de imagem digital. Este método simplifica os procedimentos entre aquisição de fenótipo e análise de dados e inclui montagem de espécimes, aquisição de imagem, extração de valor de pixel e medição de características. 

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A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Um método de triagem para identificação de drogas promotoras de heterocromatina usando drosophila

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Genética

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Neurociência

<meta charset="utf8"></head><body>Quantificação imparcial de omatídeos em modelos oculares de Drosophila

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal pattern. This regularity and ease of observation make the Drosophila eye system a powerful tool to model various human neurodegenerative diseases. However, ways of quantifying abnormal phenotypes, such as manual ranking of eye severity scores, have limitations, especially when ranking weak alterations in eye morphology. To overcome these limitations, computational approaches have been developed such as Flynotyper. The use of a ring light allows for better qualitative images accessing the intactness of individual ommatidia. However, these images cannot be analyzed by Flynotyper directly due to shadows on ommatidia introduced by the ring light. Here, we describe an unbiased way to quantify rough eye phenotypes observed in Drosophila disease models by combining two software, ilastik and Flynotyper. By preprocessing the images with ilastik, successful quantification of the rough eye phenotype can be achieved with Flynotyper.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Quantificando fenótipos de olhos ásperos em modelos de Drosophila de esclerose lateral amiotrófica com demência frontotemporal

The Drosophila eye system is a useful tool for studying various biological processes, particularly human neurodegenerative diseases. However, manual quantification of rough eye phenotypes can be biased and unreliable. Here we describe a method by which ilastik and Flynotyper are used to quantify eye phenotype in an unbiased way.

Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

Biologia do Desenvolvimento

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

Drosophila Imunohistoquímica Abdomen Pupal

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biologia

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

Métodos Eletrofisiológicos para Medir Níveis de Fotopigment em Fotorreceptores de Drosophila

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary changes. In particular, the adult stage is a rich source of morphological traits for interspecific comparison, including wing pigmentation comparison. To study developmental differences among species, detailed observation and appropriate staging are required for precise comparison. Here we describe protocols for staging of pupal periods and quantification of wing pigmentation in a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera. First, we describe the method for detailed morphological observation and definition of pupal stages based on morphologies. This method includes a technique for removing the puparium, which is the outer chitinous case of the pupa, to enable detailed observation of pupal morphologies. Second, we describe the method for measuring the duration of defined pupal stages. Finally, we describe the method for quantification of wing pigmentation based on image analysis using digital images and ImageJ software. With these methods, we can establish a solid basis for comparing developmental processes of adult traits during pupal stages.

Methods for Staging Pupal Periods and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera

Protocols for staging pupal periods and measurement of wing pigmentation of Drosophila guttifera are described. Staging and quantification of pigmentation provide a solid basis for studying developmental mechanisms of adult traits and enable interspecific comparison of trait development.

Métodos de estadiamento Pupal períodos e medição de asa pigmentação da Drosophila guttifera

Diversified species of Drosophila (fruit fly) provide opportunities to study mechanisms of development and genetic changes responsible for evolutionary ...

Quantificando pigmentação abdominal em

Resumo

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Um método de triagem para identificação de drogas promotoras de heterocromatina usando drosophila

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado

Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper

Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper

Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper

Drosophila Imunohistoquímica Abdomen Pupal

Comparação quantitativa de Cis-Regulamentação elemento (CRE) Atividades em transgênicos Drosophila melanogaster

Métodos Eletrofisiológicos para Medir Níveis de Fotopigment em Fotorreceptores de Drosophila

PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado

Métodos de estadiamento Pupal períodos e medição de asa pigmentação da Drosophila guttifera