الثقافات "الكبد على رقاقة" خلايا الكبد الأولية وخلايا كوبفر للعدوى بفيروس التهاب الكبد B

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في التهابات الكبد وحقول أمراض الكبد. مثل مساهمة مجموعات الخلايا المقيمة في الكبد ، في التسبب الفيروسي ، حركية العدوى الطولية ، آليات تكرار الفيروسية ، الغزو المناعي ، في نظام نموذجي فسيولوجي ودراسات اختبار المخدرات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على تلخيص بيئة صغيرة الكبد.

التي يمكن الحفاظ عليها لفترات طويلة من الزمن، وهي عرضة بشكل طبيعي للإصابة بالتهاب الكبد B على المستويات الفسيولوجية ذات الصلة. وقد كان هذا في السابق عائقا أساسيا في مجال التهاب الكبد B. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو العلاج أو التشخيص من عدوى HBV لأنه يمكن إجراء دراسات اختبار المخدرات في منصة فسيولوجية لفترات طويلة.

وهذا يسمح بتقييم العلاجات الدوائية المتتابعة جنبا إلى جنب مع تحليل فعالية استراتيجيات العلاج الحالية والجديدة. هذه الطريقة يمكن أن توفر فهم في التهاب الكبد B, ويمكن أيضا أن تطبق على دراسات أخرى من الأمراض, بما في ذلك التهابات الكبد الأخرى, أمراض الكبد, أو دراسات استقلاب المخدرات. عموما, سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال, لأنه يتطلب الاهتمام بتفاصيل معينة للسماح للمحافظة الناجحة على أنسجة الكبد لفترات طويلة من الزمن.

وأيضا التعرف على الأدوات والمعدات المتخصصة. العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية. بما في ذلك تجميع لوحات، وكذلك ذوبان وبذر الخلايا.

منذ الخطوات التي تنطوي عليها ثقافة طويلة الأجل من الخلايا المستمدة من الكبد هي صعبة عند استخدام نظام ثقافة جديدة. أولا، بدوره على كل من ضاغط ومضخة فراغ المرتبطة منصة رقاقة الكبد. انتقل إلى مجلس الوزراء أنبوب زجاجي لتجميع وتكساء لوحات.

وضع غشاء معقمة على قاعدة لوحة لبدء تجميع aseptically لوحات microfluidic. التأكد من أن الغشاء المعقم يعتمد بسلاسة على دبابيس اثنين من اللوح الأساسي. ثم إضافة لوحة أعلى تحتوي على جيد.

إضافة غطاء لوحة العقيمة. واستخدم عزم دوران آلي دقيق، تم تعيينه إلى 33 رطلًا. باستخدام تسلسل تشديد دوامة لتشد من مسامير في قاعدة لوحة.

باستخدام عزم الدوران اليدوي, تأكد من أن يتم تشديد جميع مسامير إلى 35 جنيه. المقبل، قبل الدافئة البذر الكبد المتوسطة إلى 37 درجة مئوية قبل فتيلة. ضع الطبق المجمع بالكامل في رصيف الغسيل.

وتأكد من أن اللوحة تفاجئ تماماً إضافة 400 ميكرولترات من الكبد البذر المتوسطة إلى الجانب الخزان من كل بئر لرئيس لوحة. بعد ذلك، بدء تدفق في الاتجاه التصاعدي لمدة 3.5 دقيقة في ميكرولتر واحد في الثانية الواحدة.

المؤشرات الحمراء على جانب لوحة تشير إلى ما إذا كان دوران microfluidic يعمل بشكل صحيح. مرة واحدة يتم ضخ المتوسطة إلى الجانب نمو الخلية من لوحة، إضافة 1.2 ملليلتر إضافية من وسيط البذر الكبدي. قم بنقل اللوحة بعناية إلى محطة الإرساء داخل حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بدء تدفق في الاتجاه التصاعدي بمعدل تدفق من ميكرولتر واحد في الثانية لمدة 16 ساعة. بعد ذلك، قم بنقل الطبق إلى رصيف الغسيل. الماص بلطف صعودا وهبوطا للقضاء على أي فقاعات.

باستخدام ملقط العقيمة، إضافة ورقة مرشح جولة العقيمة إلى كل بئر. ثم إضافة سقالة مرفق خلية وخاتم الاحتفاظ إلى كل بئر. استخدام المكبس العقيمة لدفع كل بئر وقفل الحلقات والاحتفاظ السقالات في مكانها.

بعد ذلك، تُفطّن كلّ الوسط. وإضافة بلطف 400 ميكرولترات من البذر الكبدي تدفئة مسبقة المتوسطة على السقالة. بدء تدفق في اتجاه نزولي في ميكرولتر واحد في الثانية لمدة 3 1/2 دقيقة.

التعرق كل المتوسطة ضخها من جانب الخزان من لوحة. إضافة 1.4 ملليلتر من الكبد البذر المتوسطة لكل بئر. ثم العودة لوحة إلى قفص الاتهام لتحقيق حجم إجمالي في بئر تصل إلى 1.6 ملليلتر.

أولاً، قبل تسخين الكبد يذوب المتوسطة وبذات الكبدية المتوسطة إلى 37 درجة مئوية. بعد ذلك، ذاب قارورة واحدة من الكبدات البشرية الأولية وفقا لتعليمات المورد. في خزانة أنبوب زجاجي، resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من الكبد البذر المتوسطة.

ثم ضع الخلايا التي تم تعليقها على الجليد. باستخدام trypan الأزرق، عد الخلايا لضمان أن صلاحية الخلايا فوق 90٪ نقل لوحة تجميعها بالكامل إلى قفص الاتهام الغسيل. و تُشعّر بكلّ التوسّط من الآبار

استرداد الخلايا من الجليد، وإضافة 600،000 خلايا الكبد إلى كل بئر في حجم 500 ميكرولتر من كبد البذور المتوسطة. بدء التدفق في الاتجاه التنازلي بمعدل تدفق من ميكرولتر واحد في الثانية الواحدة. إضافة 900 ميكرولترات من الكبد البذر المتوسطة إلى كل بئر ليصل الحجم الكلي في كل إلى 1.6 ملليلتر.

نقل لوحة إلى محطة الإرساء داخل حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية ومع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بدء تدفق في الاتجاه التنازلي بمعدل تدفق ميكرولتر واحد في الثانية لمدة ثماني ساعات. بعد ذلك، عكس التدفق إلى الاتجاه التصاعدي بمعدل تدفق من ميكرولتر واحد في الثانية لمدة ثماني ساعات.

ثم نقل لوحة إلى قفص الاتهام الغسيل، ويتبخر كل المتوسطة من الآبار. إضافة 400 ميكرولترات من الكبد توسط صيانة لكل بئر. وتبدأ تدفق في الاتجاه التنازلي بمعدل تدفق ميكرولتر واحد في الثانية لمدة 3 1/2 دقيقة.

بعد ذلك، يُستَدَر من جميع الواسطة من الخزان، وأضف 1.4 ملليلتر من وسيط صيانة الكبد. نقل لوحة في محطة الإرساء داخل حاضنة مرطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بدء تدفق في الاتجاه التصاعدي بمعدل تدفق من ميكرولتر واحد في الثانية لمدة 48 ساعة.

بعد 48 ساعة، اغسل الطبق عن طريق نقله إلى رصيف الغسيل. التعرق كل وسيلة من الآبار. وإضافة 400 ميكرولترات من وسط الصيانة.

وتبدأ تدفق في الاتجاه التنازلي في ميكرولتر واحد في الثانية لمدة 3.5 دقيقة. ثم تُظهر جميع الواسطة التي تظهر في جانب الخزان من الآبار. إضافة 1.4 ملليلتر من وسيط صيانة الكبد.

ثم نقل لوحة العودة إلى محطة الإرساء في حاضنة مرطب. بدء تدفق في الاتجاه التصاعدي بمعدل تدفق من ميكرولتر واحد في الثانية لمدة 48 ساعة. استبدال المتوسطة باستخدام هذه العملية غسل واستبدال كل 48 ساعة.

خلايا الكبد البشرية الأولية عادة ما تكون مستقرة فقط لفترة محدودة من الوقت عند استخدام أنظمة الثقافة التقليدية. ومع ذلك، باستخدام البروتوكول الموضح هنا، يمكن الاحتفاظ بها وظيفياً لفترات زمنية ممتدة. ويفرز الزلال البشري بواسطة خلايا الكبد الوظيفية، ويعتبر أن يكون أفضل علامة لتقييم وظائف الكبد.

وينظر إلى الزلال أن تكون ثابت وأعرب عنها بشدة من قبل الثقافات 3D حتى اليوم على الأقل 40 بعد البذر. بالنسبة للثقافات المشتركة، يتم تقييم وظائف الخلايا Kupffer و قابليتها للتطبيق من خلال قياس إفراز السيتوكينات المحددة. وكما رأينا هنا، تشير المستويات المقاسة من IL-6 و TNF ألفا إلى أن الخلايا كانت مصانة وظيفيا وقابلة للحياة.

بالإضافة إلى الاحتفاظ بهم الأيض الخلوية الفسيولوجية، أصبحت هذه الثقافات عرضة بشكل استثنائي لعدوى HBV. الحمض النووي HBV وغيرها من العلامات الفيروسية يمكن الكشف عنها بسهولة من اليوم الثاني بعد العدوى. في حين أن الثقافات التقليدية تتطلب التلقيح مع ما لا يقل عن 500 مكافئ جينوم HBV تكملها DMSO و PEG ، فإن هذه الثقافات ثلاثية الأبعاد مصابة بأقل من 05 مكافئ جينوم غير مُخزوم.

بالإضافة إلى علامات سرية من العدوى الفيروسية، يتم استرداد السقالات المحتوية على الكبد من هذه الثقافات. يكشف المجهر المناعي أن هذه السقالات تحتوي على مستضدات فيروسية. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تكون لطيفًا عند التعامل مع خلايا الكبد قبل البذر لتجنب موت الخلايا.

بالإضافة إلى ذلك، من الضروري التأكد من أن اللوحات يتم تجميعها بشكل صحيح وجميع قنوات التدفق تسمح بالتدوير الصحيح لوسائل الإعلام قبل بذر خلايا الكبد. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الفلوروسين المناعية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. بما في ذلك موقع وتواتر الخلايا المصابة داخل الأنسجة.

يمكن أيضًا تقييم الحالة الفسيولوجية لل الكبد عن طريق التلطيخ للهياكل اللوائية أو الكبدية بما في ذلك بروتين التقاطع الضيق ZO-1. بعد هذا التطور، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الفيروسات لاستكشاف عدوى التهاب الكبد B والاستجابات المناعية في نظام نموذج 3D الفسيولوجية. لا تنس أن العمل مع فيروس التهاب الكبد B يمكن أن يكون خطرا، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل التطعيم السابق، واستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة، والعمل بموجب المبادئ التوجيهية للسلامة البيولوجية المناسبة دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.