Name: pan-lyssavirus real time rt-pcr for rabies diagnosis
Uploaded: 2019-07-10T14:00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Miss Emma Wise e Miss Megan Golding per l'assistenza nel completamento degli esperimenti. Lo sviluppo di questo protocollo è stato sostenuto finanziariamente dal Dipartimento britannico per l'ambiente, l'alimentazione e gli affari rurali (Defra), dal governo scozzese e dal governo gallese con sovvenzioni [SV3500, e SE0431] e da un progetto globale European Virus Archive (EVAg) che ha ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 653316.

Campioni di materiale diagnostico ricevuti all'APHA dopo l'infezione naturale o ottenuti inoculando i topi utilizzando protocolli valutati dal comitato etico e statistico dell'APHA ai sensi delle normative del Consiglio degli Interni del Regno Unito sotto licenza 70/7394.
1. Quantificazione dell'RNA utilizzando uno spettrometro microvolume
<ol><li>Assicurarsi che le impostazioni dello spettrofotometro siano impostate sull'RNA.</li>
	<li>Utilizzare 1-2 l di acqua di grado molecolare per inizializzare la macchina e impostare una linea di base.</li>
	<li>Utilizzare 1-2 l di ogni campione di RNA di prova per valutare la quantità di RNA.</li>
	<li>Salvare le letture e il documento.</li>
	<li>Se necessario, regolare l'RNA a 1 g/L. NOT:</</c0> L'RNA deve essere tenuto sempre sul ghiaccio (o in un blocco freddo). Se l'RNA viene ottenuto utilizzando una colonna, o un metodo basato sul tallone, l'RNA è di solito inferiore a 1 g/ l. In questa situazione utilizzare l'RNA pulito.</li>
</ol>2. Preparazione della serie di diluizione dell'RNA per determinare la sensibilità del punto finale
<ol><li>
Effettuare una diluizione seriale di 10 volte dell'RNA.
	<ol>
<li>Tubi di etichettatura con la serie di diluizione (ad esempio, 10-1, 10-2,ecc.) e i dettagli dell'RNA.</li>
		<li>Aggiungere 45 -L di acqua di grado molecolare ad ogni tubo.</li>
		<li>Aggiungere 5 - L dell'RNA (precedentemente diluito a 1 g/l) e mescolare bene.</li>
		<li>Smaltire la punta della pipetta nel disinfettante appropriato e sostituirla con una punta fresca.</li>
		<li>Prendere 5 l dal 10-1 e aggiungere a 10-2 tubo e mescolare bene.</li>
		<li>Ripetere 2.1.3-2.1.5 con le diluizioni rimanenti. NOT:</</c6> L'RNA deve essere tenuto sempre sul ghiaccio (o in un blocco freddo).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparazione delle reazioni RT-PCR in tempo reale
<ol><li>Utilizzando un foglio di calcolo, pianificare il layout della piastra in base al numero di campioni di prova e campioni di controllo, sia per i saggi lyssavirus che per i saggi di influenza. NOT:</</c0> Se 4 campioni devono essere testati in duplicato con un controllo positivo e negativo, ciò equivale a 10 reazioni per entrambi i saggi.</li>
	<li>In una "stanza pulita" o in un'area separata dal modello di RNA, pulire le superfici con un disinfettante appropriato prima di utilizzare o preparare una workstation PCR (se usato). Per preparare la postazione di lavoro, pulire la superficie dell'armadio con un disinfettare appropriato e posizionare gli elementi necessari nella postazione di lavoro e chiudere le porte. Accendere la luce UV per 10 minuti</li>
	<li>Rimuovere reggenti e primer dal congelatore e disgelo (reagenti elencati nella tabella 1 e primer nella tabella 2). NOT:</</c2> La miscela enzimatica è immagazzinata in glicerolo in modo da non richiedere lo scongelamento e deve essere mantenuta sul ghiaccio (o in un blocco fresco) in ogni momento. Tutti gli altri reagenti possono essere sconfuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Una volta scongelato, mescolare brevemente i reagenti e la centrifuga per raccogliere il liquido. NOT:</</c0> Non vorare la miscela enzimatica, basta centrifugare brevemente.</li>
	<li>Preparare miscele master separate per lyssavirus e z-actin. Per ogni reazione, aggiungere 7,55 ll di acqua di grado molecolare, 10 -L di 2x Miscela di reazione verde SYBR universale, 0,6 l di primer in avanti, 0,6 l di primer inverso, 0,25 l di mix enzimatico iTaq RT.
	<ol>
<li>Utilizzare un foglio di calcolo per calcolare i volumi corretti per evitare errori nel calcolo manuale. Assicurarsi che un numero sufficiente di master-mix sia pronto per compensare l'errore di pipettaggio. Pertanto, se sono necessarie 10 reazioni (vedere NOTA in 3.1), preparare 12 reazioni</li>
		<li>Preparare il master-mix sul ghiaccio (o in un blocco fresco) e rimanere sul ghiaccio fino a quando non viene inserito nella macchina in tempo reale.</li>
	</ol></li>
	<li>Mescolare brevemente le miscele master preparate, centrifugare e erogare 19 gradi in relativi pozzi di tubi a strisce o in un pozzo da 96 appiattina compatibile con la macchina in tempo reale in uso. NOT:</</c0> Ridurre al minimo la produzione di bolle nei pozzi durante la pipettatura.</li>
	<li>In una stanza separata, o in un armadio UV preparato come descritto nella 3.2, aggiungere con attenzione 1 l'RNA precedentemente regolato a 1 g/L (vedi passo 1,5) sotto la superficie del pozzo master-mix appropriato e mescolare delicatamente. Scartare la punta della pipetta in disinfettante direttamente dopo l'uso (sotto la superficie).
	<ol>
<li>Aggiungere i controlli dopo i campioni di test, con il controllo positivo aggiunto successivamente e il controllo nessun modello (NTC – acqua di grado molecolare) aggiunto per ultimo. La quantità di RNA utilizzata può essere modificata a seconda del tipo di campione e l'estrazione dell'RNA utilizzato. La quantità utilizzata deve essere convalidata per garantire che la reazione sia ottimizzata.</li>
	</ol></li>
	<li>Piastra di sigillazione utilizzando coperchi a strisce o sigillanti preparate per garantire che tutti i coperchi siano saldamente chiusi ed etichettati sufficientemente per orientare i campioni. Etichettare il bordo dei tubi piastra/striscia.</li>
	<li>Girare i campioni utilizzando una centrifuga per raccogliere tutto il liquido sul fondo dei pozzi.</li>
	<li>Trasferire la piastra alla macchina PCR in tempo reale, aprire la porta e posizionare nel supporto assicurando la corretta posizione / orientamento dei campioni secondo il layout della piastra. NOT:</</c0> Se vengono utilizzate strisce di tubi, assicurarsi che il supporto sia in posizione.</li>
	<li>Apri il programma di macchine PCR in tempo reale e scegli l'opzione per l'esperimento in tempo reale SYBR con la curva di dissociazione. Programmare la macchina PCR in tempo reale utilizzando le condizioni di ciclo termico specificate nella tabella3, inclusi i punti di raccolta dati.</li>
	<li>Selezionare SYBR come tipo di tintio fluorescente e sconosciuto come tipo di campione e inserire un nome nella casella del nome del campione corretto. NOT:</</c2> Differenziare tra le repliche e anche tra il lissavirus e i pozzi di z-actin.</li>
	<li>Scegliere un percorso di file per salvare i dati sperimentali, assicurarsi che la lampada verrà spenta alla fine della corsa, quindi avviare la corsa. NOT:</</c0> Poiché il primo passo è una fase RT, non vengono raccolti dati durante questo periodo, quindi, se la lampada richiede un periodo di riscaldamento questo può verificarsi durante la fase RT. La macchina e il software in tempo reale visualizzeranno le curve di amplificazione in tempo reale, mentre la curva di fusione verrà generata alla fine del ciclo.</li>
</ol>4. Analisi dei dati
<ol><li>
Una volta completata l'esecuzione, eseguire l'analisi dei dati come indicato di seguito.
	<ol>
<li>Analizzare innanzitutto i risultati del grafico di amplificazione dei campioni di prova insieme ai campioni di controllo. I campioni positivi visualizzano rampe esponenziali, di solito seguite da plateau e da un valore C t. I campioni negativi visualizzano i grafici di amplificazione piatta senza valori Ct (Figura1A). Il valore Ct viene calcolato automaticamente dal software, anche se questo dovrebbe essere controllato e modificato manualmente se necessario.</li>
		<li>In secondo luogo, analizzare i risultati della curva di dissociazione dei campioni di prova insieme ai campioni di controllo. Un campione positivo avrà una temperatura di fusione (Tm) 77 – 80 gradi centigradi, e si sovrappone alla figura di controllo positivo 1B).</li>
		<li>Ottenere il risultato diagnostico complessivo assicurandosi che i controlli siano validi. Utilizzare la tabella 4 per interpretare i risultati in relazione al controllo interno dell'actina . Se i campioni di controllo positivi sono negativi e/o i campioni negativi sono positivi, la corsa deve essere ignorata.</li>
		<li>Registrare i valori Ct e Tm ottenuti per l'RNA di controllo in una "scheda di controllo" per consentire l'analisi delle tendenze e aiutare a identificare le derive nella sensibilità del saggio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OIE.">OIE.</a> OIE Terrestrial Manual 2018. , 8-14 (2018).</li><li>Panning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+rabies+virus+reverse+transcription-PCR+and+virus+isolation+using+samples+from+a+patient+infected+with+rabies+virus.">Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).</li><li>Wakeley, P. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il pan-lyssavirus in tempo reale RT-PCR assay descritto è un tubo chiuso, un test in un passaggio che rileva lyssavirus su tutti e tre i filogruppi. Il saggio è stato convalidato per la diagnosi di rabbia animale e umana, tra cui tessuto cerebrale post-mortem (albo cerebrale ottimale), e campioni ante-mortem come biopsia cutanea, saliva raccolta in serie o liquido spinale cerebrale (CSF). I primer utilizzati in questo saggio sono stati inizialmente progettati e utilizzati per un saggio basato su sonda per distinguere tra RABV, EBLV-1 e EBLV-23, che è stato utilizzato in molti laboratori di rabbia OIE ed esegue in modo coerente negli schemi di competenza EURL. Successivamente la natura "pan-lyssavirus" di questi primer è stata confermata utilizzando un assaggio in tempo reale in due passaggi15. Il test qui descritto ha utilizzato le primer per ottimizzare ulteriormente la RT-PCR in un saggio SYBR in un solo passaggio che consente un sistema rapido a tubi chiusi. Inoltre, la formazione nei paesi endemici della rabbia che utilizzano questo saggio ha confermato l'idoneità all'implementazione in qualsiasi laboratorio con PPE di base e sistemi di qualità per ridurre la contaminazione incrociata e i campioni di traccia, le strutture per immagazzinare i reagenti e un tempo reale macchina con rilevamento SYBR. Il test è estremamente robusto e ha una correlazione del 100% con il FAT, con una migliore sensibilità per i campioni decomposti3. Uno dei principali vantaggi di un saggio basato su tintura di intercalazione del DNA rispetto a un saggio basato su sonda è il costo relativo. Un ulteriore vantaggio è che il saggio utilizza solo due primer, quindi c'è meno rischio di rilevamento non riuscito a causa della divergenza di sequenza, che è stata una debolezza nei saggi basati su sonde pubblicati in precedenza. Infatti, i rappresentanti di tutte le specie di lyssavirus (a parte TWBLV e KBLV) vengono rilevati utilizzando questo saggio, e l'analisi di sequenza di TWBLV e KBLV attraverso i siti primer non rivela alcuna divergenza significativa fortemente suggerendo che saranno rilevati anche utilizzando questo metodo. La gamma di limiti di rilevamento osservati tra i virus analizzati, può essere considerata dovuta a due fattori principali. Il primo è che l'RNA è stato isolato dal materiale cerebrale clinico, quindi la quantità di copie del genoma in ogni campione non diluito non è direttamente comparabile. L'RNA è stato "normalizzato" regolando l'RNA totale a 1 g/L; tuttavia, la proporzione di RNA genomico virale all'interno di tale campione varierà. Il secondo è la diversità delle sequenze di lyssavirus, nonostante i siti primer si trovano in regioni conservate, rimangono posizioni di variazione. Pertanto, non è sorprendente che la maggior parte dei lissavirus con minore sensibilità per il saggio sono virus filogruppo II e III. L'analisi della curva di dissociazione rappresenta un parametro essenziale, riducendo al minimo un risultato falso positivo che potrebbe altrimenti verificarsi a causa della formazione di dimeri primer o amplificazione di una regione non specifica nel genoma ospite. In realtà, si tratta di un evento raro e l'analisi della curva di dissociazione è equivalente all'esecuzione di un gel agarose per visualizzare gli amplificatori RT-PCR convenzionali di dimensioni corrette. L'intervallo di valori accettabili di Tm è stato fornito (77-80 gradi centigradi), sulla base dei dati raccolti nel nostro laboratorio. Si raccomanda vivamente che i singoli laboratori fascicolino i dati interni per garantire che l'intervallo sia trasferibile e modificare di conseguenza. L'interpretazione dei risultati dei grafici di amplificazione e di dissociazione, insieme ai controlli positivi e negativi e ai risultati dell'atto zin, consente risultati diagnostici robusti e riproducibili.
Al di fuori dell'ambito di questo protocollo è il metodo di estrazione dell'RNA utilizzato per ottenere RNA di alta qualità. Tutto l'RNA analizzato in questo protocollo è stato preparato utilizzando TRIzol; tuttavia, ci sono molti protocolli adatti per l'estrazione dell'RNA di estrazione di estrazioni di guanidio, tra cui kit di estrazione a colonna e perline. La movimentazione di campioni positivi (o sospetti positivi) del lyssavirus deve essere all'interno di strutture di biocontenimento autorizzate approvate all'interno del paese. Tuttavia, l'RNA totale estratto non è infettivo, quindi gestito all'interno di laboratori a basso contenimento. A seconda del metodo di estrazione utilizzato, sarebbe necessario valutare il requisito di quantificare e diluire l'RNA. Per le estrazioni a base di fenolo, compreso il TRIzol, questo passaggio è necessario e impedisce che l'inibizione del saggio contamini gDNA; tuttavia, le estrazioni a base di colonne e perline (in particolare quelle con una fase di deplezione del DNA) non richiedono diluizione prima del test.
In tutto il protocollo, è essenziale che la cura e la diligenza siano utilizzate per prevenire la contaminazione incrociata e l'aggiunta accurata del campione ai pozzi corretti. Un foglio di calcolo con i calcoli del reagente e il layout della piastra è disponibile per il download come file supplementare. Buone pratiche di laboratorio, tra cui superfici di lavoro pulite, cambiamenti regolari di guanti, l'uso di punte di barriera e diverse stanze / armadi UV per separare ogni fase ridurrà al minimo la possibilità di contaminazione. Per garantire che il test funzioni con i parametri previsti, è necessario includere controlli positivi e negativi e tutti i campioni di test eseguiti in duplicati (o triplice).
L'inclusione dei controlli è una caratteristica essenziale di qualsiasi PCR, in particolare per la diagnostica. L'RNA di controllo positivo è stato preparato dal cervello infetto DA CVS (sfida virus standard) in lotti e convalidato e calibrato per garantire la coerenza tra i lotti. L'RNA di controllo è stato quantificato e diluito a 1 g/L. RNA per il quale è stato ottenuto un risultato positivo in una diluizione seriale fino ad almeno 10-4 (pari a 100 pg/L) è stato considerato adatto allo scopo. L'RNA di controllo positivo è stato immagazzinato a -80 gradi centigradi in 10-1 aliquote. Quando necessario, un'aliquota è stata diluita 1:100 per fornire una riserva di lavoro a 1 ng/L e conservata a -80 gradi centigradi in 5 aliquote monouso. L'RNA di controllo positivo diluito è stato utilizzato per rappresentare campioni positivi di basso livello e per garantire che sia stata rilevata qualsiasi riduzione della sensibilità del saggio. Per ogni controllo è stata mantenuta una "scheda di controllo" per monitorare i valoriC t e identificare le tendenze (tabella5). La tabella 5 ha dimostrato una buona comparabilità interrun per i valori Ct e Tm positivi di CONTROLLO CVS in più giorni e operatori, garantendo che la analisi sia robusta e riproducibile. I risultati che si discostano da queste misurazioni devono essere studiati e i campioni di prova ripetuti se necessario. L'acqua di grado molecolare è stata inclusa in ogni corsa come NTC per confermare che i reagenti erano privi di contaminazione con RNA lyssavirus e confermano un campione negativo. Inoltre, per garantire l'efficacia dell'estrazione dell'RNA, l'actino è stato testato insieme ai campioni di prova in un tubo separato. L'RNA di controllo positivo lyssavirus è stato utilizzato anche per il controllo positivo di z-actin. Possono essere utilizzati altri geni endogeni o sistemi di controllo interno eterologi. L'uso di questi controlli ha garantito che tutti i passaggi siano stati analizzati nelle stesse condizioni dei campioni di test. Occasionalmente, se il campione è stato altamente degradato o non contiene sufficiente RNA ospite (come saliva o CSF), la PCR genica endogena può fallire. In questo caso, dove il risultato RT-PCR in tempo reale del lyssavirus è stato positivo, la conferma di un'estrazione indipendente dell'RNA - per escludere la contaminazione dell'RNA durante l'estrazione dell'RNA sul test originale o mediante un test secondario (sia molecolare, come il convenzionale RT-PCR) o FAT. L'uso della tabella 4 durante l'analisi di un campione diagnostico ha garantito la corretta interpretazione.
Indipendentemente dal saggio molecolare utilizzato per confermare l'infezione da rabbia, è necessario intraprendere anche indagini di follow-up che utilizzano il sequenziamento di Sanger per determinare le specie di lissavirus e le tecniche classiche in virologia come il FAT o l'isolamento del virus caratterizzazione antivirus e sostenere la notifica di casi positivi all'OIE e all'OMS.

La diagnosi di rabbia con metodologie molecolari è stata accettatadall'OIE nel 2018 1, riconoscendo i vantaggi di queste tecniche nel confermare i casi di rabbia, in particolare in situazioni in cui i campioni sono sub-ottimali, o per la diagnosi ante-mortem, in quanto non vi è alcun requisito per virus dal vivo o campioni freschi. I saggi PCR per i lissavirus richiedono una trascrizione inversa (RT) prima che la PCR possa iniziare quando il genoma è l'RNA. I saggi RT-PCR che rilevano la regione prossimale 3' del genoma sono considerati i più sensibili, poiché i gradienti trascrizionali si verificano durante la replicazione del lyssavirus. I saggi RT-PCR comunemente usati possono essere suddivisi in due categorie: fine punto (o basato su gel) e in tempo reale. Entrambi gli approcci sono sensibili e specifici; tuttavia, il test in tempo reale presenta alcuni vantaggi aggiuntivi, come ottenere risultati in "tempo reale" ed essere eseguito in un sistema di tubi completamente chiuso, riducendo così il potenziale di contaminazione dell'operatore. Ci sono due approcci principali per rilevare gli amplificatori specifici del lyssavirus ottenuti utilizzando saggi in tempo reale. Il primo utilizza sonde di idrolisi (come le sonde TaqMan) che contengono un fluoroforo e un quencher. Quando la sonda si lega alla regione di destinazione durante l'amplificazione, l'attività di esonucalea della polimerasi determina la dissociazione del fluoroforo e del quencher, consentendo di misurare la fluorescenza risultante. Il secondo utilizza un colorante intercalante del DNA (fluorocromo come SYBR Green) che si lega al DNA a doppio filamento durante l'amplificazione. I fluorocromi legati emettono fluorescenza che viene rilevata ad ogni ciclo, consentendo il rilevamento e la quantificazione in tempo reale del prodotto. A causa della natura non specifica del legame con qualsiasi dsDNA, viene effettuata un'analisi della curva di dissociazione per confermare la specificità della reazione. Gli RT-PCR in tempo reale sono rapidi a causa delle piccole dimensioni dell'amplificatore, in genere meno di 200 bp di lunghezza; tuttavia, identificare le regioni idonee per progettare primer e sonde in regioni conservate può rivelarsi impegnativo, quindi rimuovere il requisito di una sonda è un netto vantaggio.
Un certo numero di RT-PCR in tempo reale sono stati progettati per rilevare specificamente singoli ceppi o lignaggi di RABV2 e anche per rilevare lyssavirus in tutto il genere3,4,5,6, 7,8,9. Tutti i saggi avranno un limite di rilevamento a seconda di quanto conservato il primer (e se necessario, la sonda) sequenze sono attraverso il genere. In effetti, ceppi di virus emergenti o nuovi possono rendere inefficaci i saggi basati su sonde altamente specifici. La scelta del rilevamento in tempo reale (colorante vs sonda) dipenderà dall'applicazione desiderata. Per un laboratorio che conduce la sorveglianza su materiale cerebrale di provenienza locale e si aspetta un numero elevato di campioni negativi, l'uso del tintura intercalato più economico è una scelta sensata. L'approccio SYBR Green sarebbe anche ottimale quando si conduce la sorveglianza a scansione in cui la presenza di nuovi o divergenti lissavirus sarebbe rimasta inosservata da analisi basate su sonde più ristrette.
Tutti i membri del genere Lyssavirus causano la malattia rabbia, che è fatale una volta che compaiono i sintomi. La stragrande maggioranza dei casi di rabbia umana e animale è dovuta al virus della rabbia (RABV), il serbatoio dominante per il quale è il cane domestico10. I pipistrelli sono importanti serbatoi di accoglienza per i lissavirus e tutte le specie di lyssavirus tranne due caratterizzate sono state identificate direttamente nei pipistrelli - Ikoma lyssavirus (IKOV) e Mokola virus (MOKV) - e di questi due, IKOV è stato ipotizzato di avere un serbatoio di ospite pipistrico 11.Oltre alle 16 specie di lissavirus riconosciute12, ci sono due lyssavirus che sono stati recentemente descritti: Taiwan bat lyssavirus (TWBLV)13 e Kotalahti bat lyssavirus (KBLV)14. I lissavirus possono essere geneticamente divisi in tre filogruppi, con la maggior parte dei lissavirus, tra cui RABV, appartenenti al filogruppo I. Tuttavia, i lissavirus più divergenti appartengono al filogruppo III ed è improbabile che vengano rilevati da RT-PCR progettati per colpire le sequenze di virus RABV o phylogroup I.
L'esempio qui descritto utilizza la coppia di primer in tempo reale JW12-N165, descritta per la prima volta nel 20053. I primer sono stati progettati per essere pan-lyssavirus anche se l'applicazione originale era come un saggio TaqMan con sonde per differenziare le specie di lyssavirus. La successiva conferma che la coppia primer era pan-lyssavirus in specificità è stata raggiunta utilizzando un 2-step SYBR analisi in tempo reale su tutte le specie di lyssavirus disponibili tra cui WCBV15. La coppia di primer è descritta qui in un saggio RT-PCR in tempo reale che utilizza un fluorocro intercalante, convalidato utilizzando rappresentanti di tutte le 16 specie lissavirus riconosciute. Questo saggio in tempo reale in un solo passaggio è un'analisi rapida, sensibile, specifica del lissavirus e dimostra che la robustezza del primer impostato per identificare anche le specie di lissavirus altamente divergenti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Art Barrier pipette tips (various sizes)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Allegra 21R</td>
			<td>Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (mico)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5150</td>
			<td>Equivalent kits can be used if validated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MX3000P or MX3005P real-tme PCR system</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eqivalent machines can be used if validated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp reaction plate base</td>
			<td>Any suitable</td>
			<td></td>
			<td>Used to hold tube strip and plates securely.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically clear flat clear strips (8)</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfect fit frame (if using tube strips)</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Specific to machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers: for primer details see Table 2.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered at 0.05 &#181;mole scale HPLC purified.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Fast 96 well plares, non skirted</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes</td>
			<td>ABgene</td>
			<td>AB-0452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex machine / Whirlimixer</td>
			<td>Fisons Scientific equipment</td>
			<td>SGP-202-010J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unless stated, alternative equipment can be used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pan-lyssavirus real time rt-pcr for rabies diagnosis

I test molecolari sono rapidi, sensibili e specifici e sono diventati centrali nella diagnosi della rabbia. I test basati sulla PCR sono stati utilizzati per decenni per confermare la diagnosi della rabbia, ma solo di recente sono stati accettati dall'OIE (Organizzazione mondiale per la salute animale) come metodo primario per rilevare l'infezione da rabbia. I test RT-PCR in tempo reale forniscono dati in tempo reale e sono sistemi a tubi chiusi, riducendo al minimo il rischio di contaminazione durante l'installazione. I saggi RT-PCR in fluorocrocromo fluorocromo del DNA non richiedono sonde costose, riducendo al minimo il costo per campione, e quando i primer sono progettati in regioni conservate, analisi specifiche tra i generi di virus piuttosto che specifiche per un solo virus specie sono possibili. Qui descriviamo un saggio RT-PCR in tempo reale di pan-lyssavirus che rileva i lyssavirus attraverso il genere Lyssavirus, compresi i virus più divergenti IKOV, WCBV e LLEBV. In combinazione con l'analisi della curva di dissociazione, questo saggio è sensibile e specifico, con il vantaggio di rilevare tutte le specie di lyssavirus. Il test è stato adottato in molti laboratori diagnostici con ambienti di qualità garantiti, consentendo una diagnosi robusta, rapida e sensibile di casi di rabbia animale e umana.

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Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Pan-lyssavirus in tempo reale RT-PCR per la diagnosi di rabbia

Questo RT-PCR in tempo reale utilizzando dsDNA tintura intercalating è adatto per diagnosticare le infezioni da lyssavirus. Il metodo inizia con l'RNA estratto dalla rabbia sospetti campioni ante mortem o post-mortem, dettagliando la preparazione del mix master, l'aggiunta di RNA, l'impostazione della macchina in tempo reale e la corretta interpretazione dei risultati.

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Questo RT-PCR in tempo reale è adatto a diagnosticare rapidamente la rabbia in campioni ante mortem e post mortem. I primer Pan-Lyssavirus sono stati ottimizzati per identificare tutti i membri del genere Lyssavirus. Questo è un saggio rapido, sensibile e a tubo chiuso che rileva virus provenienti da tutto il genere Lyssavirus, comprese specie altamente divergenti dagli esemplari clinici.L'OIE ha recentemente accettato test molecolari per segnalare l'infezione da rabbia. Ciò è particolarmente importante per i campioni decomposti che non possono sempre essere diagnosticati con metodi di coltura del virus o di rilevamento degli antigeni. A causa della sensibilità di questo saggio, una buona pratica di laboratorio, compresa la separazione delle diverse fasi, è fondamentale per ridurre al minimo il rischio di contaminazione.A dimostrare la procedura sarà Daisy Jennings, una diagnostica del mio laboratorio. Inizia quantificando l'RNA con uno spettrofotometro a micro volume. Assicurarsi che la macchina sia impostata sull'RNA e utilizzare da uno a due microlitri di acqua di grado molecolare per normalizzare la macchina e stabilire una linea di base.Misurare la concentrazione di RNA e regolarla su un microgrammo per microlitro. Pianificare il layout della piastra PCR con un foglio di calcolo tenendo conto sia degli esempi di test che di controllo. Preparare una workstation PCR disinfettando le superfici e, se si utilizza un armadio UV, accendere la luce UV 10 minuti prima dell'avvio.Rimuovere reagenti e primer dal congelatore per scongelare ma mantenere il mix enzimatico sul ghiaccio in ogni momento. Mescolare brevemente i reagenti e la centrifuga per raccogliere il liquido. Prepara i mix master PCR per Lyssavirus e Beta-Actin secondo le indicazioni del manoscritto.Lasciare che il maestro si mescoli sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'uso. Mescolare e centrifugare le miscele master preparate e distribuire 19 microlitri nei pozzi pertinenti della piastra o del nastro tubo compatibili con la macchina PCR. In una stanza separata o in un armadio UV, aggiungere con cura un microliter dell'RNA preparato.Se si utilizza un armadio UV, accendere la luce UV 10 minuti prima dell'avvio. Dopo gli esempi di test, aggiungere il controllo positivo e il controllo no template. Quando si aggiunge l'RNA alle miscele master, assicurarsi che sia aggiunto al pozzo corretto.Utilizzare un piano piastra per aiutare questo passaggio. Sigillare la piastra controllando che i coperchi siano piatti attraverso la piastra e girarla verso il basso per raccogliere tutto il liquido nella parte inferiore dei pozzi. Assicurarsi che ogni pozzo abbia lo stesso volume di liquido e che non siano visibili bolle.Quindi trasferire i campioni sulla macchina PCR. Aprire il programma scegliendo SYBR Green con dissociazione. Selezionare i pozzi da analizzare scegliendo sconosciuto come tipo di campione e SYBR come colorante fluorescente.Etichettare i pozzi sul layout della piastra con le informazioni del campione, incluso se il saggio è per Lyssavirus L o Beta-Actin. Fare clic sulla configurazione del profilo termico e modificare le condizioni di ciclo termico come specificato nel manoscritto. Fare clic sul pulsante Start, quindi scegliere un percorso per salvare il file e selezionare la casella per spegnere la lampada alla fine dell'esecuzione.Quando viene visualizzata l'opzione per avviare prima che venga visualizzato il riscaldamento della lampada, fare clic su Esegui ora, ma assicurarsi che la lampada abbia meno di 15 minuti per riscaldarsi. Al termine dell'esecuzione della PCR, procedere con l'analisi dei dati. In primo luogo, analizzare i grafici di amplificazione del lissavirus.I campioni positivi visualizzano rampe esponenziali mentre i campioni negativi hanno grafici di amplificazione piatti senza valori CT. Quindi, analizzare i risultati della curva di dissociazione del lissavirus dei campioni di prova insieme ai campioni di controllo. Un campione positivo al lissavirus avrà una temperatura di fusione compresa tra 77 e 80 gradi Celsius e si sovrapporrà al controllo positivo.Quindi, analizza i grafici di amplificazione beta-actina e le curve di dissociazione confrontandoli con i controlli per interpretare il risultato complessivo. Visualizzare il report di testo e utilizzare i dettagli per registrare i valori CT e TM ottenuti per l'RNA di controllo in una scheda di controllo per verificare che l'esecuzione sia stata eseguita correttamente e che i risultati del campione di test possano essere segnalati. Questo protocollo è usato per dimostrare la sensibilità del Pan-Lyssavirus RT-PCR su una serie di diluizione dell'RNA di un virus standard di controllo.La curva di amplificazione indica che è possibile rilevare solo 10 picogrammi di Lyssavirus e le curve di dissociazione verificano la temperatura di fusione del prodotto. La temperatura di fusione viene utilizzata per confermare che l'amplicon è specifico del Lyssavirus. I risultati qui dimostrano un intervallo di temperatura di fusione in tutto il genere Lyssavirus da 77,34 a 79,67 gradi Celsius.I valori di temperatura di fusione inferiori a 76,8 o superiori a 80,2 sono considerati non specifici. La sensibilità di questo saggio RT-PCR è determinata anche rilevando l'RNA da tre campioni cerebrali positivi al Lyssavirus. Solo 0,1 picogrammi per microlitro di RNA bersaglio possono essere rilevati per due dei tre campioni.In particolare, i rappresentanti di tutte le specie riconosciute di lissavirus vengono rilevati utilizzando questo saggio. Se si analizzano estratti di RNA da campioni clinici come saliva o CSF, i risultati di Beta-Actin possono essere negativi a causa della mancanza di acidi nucleici ospiti. L'aggiunta di un controllo esogeno può risolvere il problema.Il sequenziamento di campioni positivi al Lyssavirus è raccomandato per fornire ulteriori informazioni riguardanti l'origine geografica e ospite di un'infezione da rabbia. La manipolazione di campioni positivi o sospetti di Lyssavirus deve essere secondo le linee guida locali per la salute e la sicurezza. L'RNA estratto non è infettivo, quindi può essere maneggiato all'interno di laboratori a basso contenimento.

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