Il nostro protocollo ci fornisce un modo per studiare i batteri resistenti agli antibiotici in un ambiente nutrizionale e fisico simile a come probabilmente esistono in vivo. Uno dei maggiori vantaggi di questa tecnica è la capacità di catturare immagini ad alta risoluzione e dati fenotipici di batteri in dimensioni di popolazione rilevanti per l'infezione. Si tratta di aggregati di circa 10-1.000 celle.
A dimostrare la procedura sarà Alexa Gannon, un'assistente di ricerca laureata del mio laboratorio. Per iniziare, sterilizzare il mezzo contenente mucina sotto luce ultravioletta per quattro ore. Trasferire la mucina trattata con UV in tubi sterili da 1,7 millilitro in condizioni sterili e conservare i tubi a meno 20 gradi Celsius.
Dopo aver preparato la base tamponata, aggiungere la soluzione stock di mucina nella base tamponata contenente DNA come descritto nel manoscritto di testo. La sera prima dell'esperimento, inoculare cinque millilitri di brodo LB con diverse colonie di Pseudomonas aeruginosa PAO1 pMRP91 da un antibiotico contenente piastra di agar LB e colturare i batteri durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 250 giri al minuto. La mattina successiva, almeno due ore prima di iniziare l'esperimento, accendere il microscopio a scansione laser confocale e aprire il modulo di incubazione nel software di imaging associato.
Diluire 500 microlitri della coltura in cinque millilitri di brodo LB fresco e incubare la sospensione batterica a 37 gradi Celsius e 250 giri al minuto per 60-90 minuti. Quando i batteri sono entrati nella fase logaritrica, pellettizzate le cellule batteriche per centrifugazione e lavate le cellule tre volte con PBS sterilizzato con filtro. Dopo l'ultimo lavaggio, risusegnare il pellet in un millilitro di PBS.
Misurare l'assorbanza della sospensione cellulare batterica a 600 nanometri per determinare il volume di coltura richiesto per una densità ottica di 0,05 in cinque millilitri di fibrosi cistica sintetica espettorato medio due. Inoculare delicatamente il volume calcolato di sospensione cellulare batterica nel mezzo e vortice prima di aggiungere un millilitro di cellule a ciascuna camera di una coltura ottica a quattro camere, quindi incubare i batteri per quattro ore in condizioni statiche a 37 gradi Celsius. Per l'immagine degli aggregati di Pseudomonas aeruginosa al microscopio a scansione laser confocale, alla fine dell'incubazione, designare tre pozzetti della piastra di coltura come replica il trattamento antibiotico e uno non come controllo del non trattamento e posizionare la piastra sullo stadio riscaldato nel microscopio.
Selezionare un obiettivo di immersione in olio 63X e aprire la scheda di localizzazione per identificare gli aggregati batterici nel campo luminoso. Definire un'area per l'imaging all'interno di ciascun pozzo e utilizzare il modulo posizioni per memorizzare la posizione dell'area. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 488 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione su 509 nanometri.
Nel modulo di acquisizione, selezionare l'opzione Z-stack per acquisire le immagini e utilizzare il modulo di media linea per ridurre la fluorescenza di sfondo nel canale GFP all'interno del volume totale delle immagini Z-stack. Imposta l'opzione della serie temporale per catturare 60 fette in ogni pozzo a intervalli di 15 minuti per 18 ore e usa la strategia di messa a fuoco definita per memorizzare un piano focale per ogni posizione che verrà ri-ripreso in ogni punto temporale durante l'esperimento. 4-1/2 ore dopo aver impostato l'esperimento di imaging, immagine di ogni posizione per determinare la biomassa aggregata all'interno di ciascuno dei quattro pozzi prima dell'aggiunta dell'antibiotico.
Dopo sei ore, aggiungere delicatamente l'antibiotico due volte al di sotto della concentrazione inibitoria minima al centro di ciascun pozzo, basta soffiare l'interfaccia del liquido d'aria e fare clic su Avvia esperimento per iniziare l'imaging post-trattamento antibiotico. Per isolare le cellule vive, alla fine del periodo di imaging di 18 ore, etichettare i batteri in ciascun pozzetti con il volume appropriato di ioduro di propidio secondo le raccomandazioni del produttore. Alla fine dell'incubazione, utilizzare un contenitore isolato per trasferire la piastra al citometro a flusso e impostare il citometro per rilevare GFP e ioduro di propidio utilizzando un ugello da 70 micron, quindi eseguire aliquote di un millilitro di ciascun surnatante di coltura alla portata più bassa per ordinare gli aggregati di Pseudomonas aeruginosa negativi allo ioduro di propidio GFP-positivi e non vitali.
Per quantificare la dinamica aggregata, caricare le immagini in un apposito programma software di analisi delle immagini e creare istogrammi dei conteggi prodotti per il controllo non trattato e le colture trattate con antibiotici nel canale GFP per consentire la quantificazione della fluorescenza di fondo. Per garantire che i voxel GFP rilevati siano correlati alla biomassa batterica, definire un voxel GFP-positivo come maggiore o uguale a 1,5 volte il valore di conteggio di fondo GFP. Produrre le superfici ISO per tutti i voxel rimanenti e per rilevare i singoli aggregati, abilitare l'opzione split objects e definire gli aggregati come oggetti.
Utilizzare il modulo di osservazione per calcolare il volume XYZ e la somma dei voxel GFP per ogni singolo oggetto. Esporta questi dati su una piattaforma statistica esterna. Filtrare i dati esportati per dimensione per definire oggetti con volumi maggiori o uguali a cinque micrometri cubi.
Rimuovere eventuali oggetti inferiori a 0,5 micrometri cubi e utilizzare il modulo di osservazione per calcolare la distanza di ciascun oggetto in relazione ad altri oggetti all'interno di ciascuna immagine. In alternativa, la distanza può essere calcolata utilizzando la formula, quindi utilizzare la somma e i calcoli medi per determinare la biomassa totale nel volume aggregato medio. Sebbene più aggregati batterici vitali rimangano dopo quattro ore di applicazione dell'antibiotico, la biomassa totale delle popolazioni aggregate all'interno delle colture trattate con antibiotici è significativamente ridotta rispetto a quella delle colture non trattate.
La microscopia a serie temporali può essere utilizzata per determinare i modelli spaziali tra aggregati sensibili positivi allo ioduro di propidio e aggregati GFP-positivi tolleranti dopo il trattamento antibiotico. Calcolando come gli aggregati di diverse dimensioni contribuiscono alla popolazione complessiva, è possibile identificare i modelli di come gli aggregati rispondono al trattamento antibiotico in relazione alle loro dimensioni, forma e posizione. Dopo il trattamento antibiotico, gli aggregati vitali e non vitali possono essere separati con successo in base alla loro espressione del segnale fluorescente.
Speriamo che questo protocollo ispiri altri ricercatori a studiare il loro organismo di scelta con una risoluzione simile. Il nostro obiettivo è trovare fili biologici comuni in queste comunità complesse indipendentemente dal sito di infezione.
