Siamo grati al Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) per fornire formazione ed il plasmide di espressione batterica PrP cervide. SG è supportato dal programma Canada Research Chair. Riconosciamo che il finanziamento per la ricerca a SG di Genome Canada, Prion Alberta Research Institute, Alberta agricoltura e silvicoltura attraverso Genome Alberta e l'Università di Calgary a sostegno di questo lavoro. Riconosciamo un assegno di ricerca dalla Margaret Gunn Foundation for Animal Research.

1. RT-QuIC utilizzando il materiale fecale <ol><li>preparazione di cervide feci estratti <ol><li>Make omogeneato fecale con l'aggiunta di 1 g di materiale fecale a 10 mL di feci estrarre buffer (20 mM sodio fosfato, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0.05% Tween 20, 1 mM PMSF e 1 x completare inibitori della proteasi, privo di EDTA) per ottenere una concentrazione finale di 10% (p/v). Il buffer di omogeneizzazione possa essere preparato prima dell'utilizzazione e conservato a -20 ° C.</li>
		<li>Omogenizzazione pellet fecali (1 g) e buffer (10 mL) in tubi (ad es., gentleMACS M tubi) utilizzando un dissociatore con un programma preimpostato dal produttore per le proteine per 1 min a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio due o tre volte fino a quando i campioni di feci sono completamente omogeneizzati nel buffer.</li>
		<li>Guarnizione le provette con parafilm e metterli su un agitatore a dondolo piattaforma o rotativo per un 1 ore di incubazione a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare le provette a 18.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Raccogliere i surnatanti che contengono la proteina estrae e aliquota in 1,5 mL provette. Le aliquote possono essere conservate a-80 ° C per ulteriori applicazioni.</li>
	</ol></li> <li>Concentrazione di PrP Sc nelle feci estrae Nota: al fine di concentrare i prioni CWD dei campioni di feci Estratto, migliorando così la sensibilità di rilevazione di RT-QuIC, viene aggiunto un passaggio di precipitazione della proteina per il protocollo.
	<ol><li>Metodo di precipitazione NaPTA</li> <li>Estratto di aggiungere 250 µ l di 10% (p/v) di N-lauryl sarcosinate (sarkosyl) a 1 mL di proteina fecale per ottenere una concentrazione finale di sarkosyl del 2% (v/v).</li>
		<li>Guarnizione dei tubi che contengono i campioni con parafilm e incubare a 37 ° C per 30 min sotto agitazione costante a 1.400 giri/min in un thermomixer.</li>
		<li>Regolare il mix di estratto proteico fecale e sarkosyl con una soluzione contenente 10% (p/v) di acido fosfotungstico sodio e 170 mM di cloruro di magnesio, pH 7.4 per ottenere una concentrazione finale di 0.3% (p/v) sodio acido fosfotungstico nei campioni.</li>
		<li>Incubare i campioni a 37 ° C per 2 h con agitazione costante a 400 giri/min.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 14 ° C per 30 min a 15.800 x g. rimuovere con attenzione i sovranatante.</li>
		<li>Lavare il pellet da loro ematico nel tampone di lavaggio (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, NaCl 100 mM, 0,5% Triton-X100, 10mm EDTA, 0,5% sodio desossicolato (w/v) e 0,1% sarkosyl (w/v)).</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 14 ° C per 15 min a 15.800 x g. rimuovere con attenzione i sovranatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 100 µ l (1/10 del volume originale della proteina fecale estrarre) di tampone di diluizione RT-QuIC. 
		Nota: RT-QuIC tampone di diluizione (fosfato di sodio di 20 mM, pH 6.9, 130 mM NaCl, 0.1% SDS (w/v) e 1 X N2 supplemento) è preparato prima dell'utilizzazione. Un volume totale di 10 mL è filtrato attraverso un filtro da 0,2 µm acrodisc siringa usando una siringa e poi conservato a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
		<li>Conservare i campioni di NaPTA trattato a-20 ° C fino al loro utilizzo nell'analisi di RT-QuIC.</li>
	</ol></li> <li>Analisi di RT-QuIC <ol><li>preparare una soluzione stock (0,032 g di Th-T in 10 mL di doppia distillata H 2 O) di fresco 10 mM Th-T.</li>
		<li>Fare una diluizione di 01:10 della soluzione di riserva in doppia distillata H 2 O per effettuare una concentrazione finale di Th-T di 1 mM il filtro attraverso una siringa di acrodisc 0,2 µm filtrare utilizzando una siringa Th-T.</li>
		<li>Disgelo del mouse ricombinante PrP (rPrP, aa 23-231) substrato (10 µ g/mL per reazione di RT-QuIC) conservato a -80 ° C il ghiaccio.</li>
		<li>Carico 500 µ l di substrato di rPrP in un momento in 100 kDa dimensione esclusione filtro microprovette e centrifugare a 14.000 x g per 5 min a temperatura ambiente (un tubo/filtro può essere utilizzato fino a due volte).</li>
		<li>Trasferire il substrato eluito in una provetta sterile 1,5 mL e tenerlo a 4 ° C fino all'utilizzo.</li>
		<li>Tampone di diluizione scongelare RT-QuIC conservati a -20 ° C.</li>
		Tampone di diluizione <li>make diluizioni del seme (estratto proteico fecale) in RT-QuIC: 
		Campione non diluito: utilizzare l'Estratto di proteine fecale non diluito diluito 2 x 10 -1 diluito 2 x 10 -2 diluito 2 x 10 -3</li> <li>preparare soluzioni di riserva per RT-QuIC miscela di reazione: tampone fosfato salino ( PBS): 5 X NaCl: 2 M stock soluzione di NaCl preparato in doppio distillata H 2 O. 
		100 mM EDTA: soluzione di EDTA preparato in doppia distillata H 2 O.</li>
		<li>Prima dell'utilizzo di tutte le soluzioni (punto 1.3.8), filtrare separatamente per ogni soluzione 0,2 µm acrodisc siringa filtro utilizzando una siringa e tenerli sterile a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare un volume totale di RT-QuIC miscela di reazione in base al numero di campioni (98 µ l di volume di reazione per campione e quattro replica per campione) da utilizzarsi più 10% di questo volume per assicurarsi di avere abbastanza miscela per tutte le reazioni.
		<ol><li>Uso un tubo da 15 mL per preparare la miscela di reazione RT-QuIC (fosfato di sodio di 20 mM, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µ g/mL rPrP substrato e doppia acqua distillata per regolare la concentrazione finale di rPrP nella reazione) utilizzando il sol d'archivio utions.</li>
			<li>Mescolare tutte le soluzioni ben pipettando su e giù per mezzo di una pipetta con una punta di filtro. Evitare quanto più possibile l'uso di vortice.</li>
			<li>Versare il composto in un flacone di pipettaggio monouso 50ml.</li>
			<li>Utilizzare una pipetta multicanale per caricare 98 µ l di miscela di reazione di RT-QuIC in ciascun pozzetto di una piastra 96 pozzetti ottico inferiore.</li>
		</ol></li> <li>Aggiungere a ogni RT-QuIC reazione 2 µ l di non diluito o estratto proteico fecale in serie diluito 10 volte. Ogni campione di prova in quattro repliche. 
		Nota: In ogni esperimento, diluizioni seriali di campioni di feci (che vanno da non diluito a 2 x 10 -3) da CWD-negativo e verificato CWD-positivi gli animali vengono utilizzati come controlli positivi e negativi, rispettivamente.</li>
		<li>Sigillare la piastra con un nastro sigillante prima incubazione in un lettore di piastra a 42 ° C per 25 h con ripetuti cicli di 1 min doppia orbitale agitazione (700 giri/min) e 1 min di riposo durante l'incubazione.</li>
		<li>Impostazioni di misura di fluorescenza Definisci: 
		Eccitazione: 450 nm emissione: 480 nm leggere, basso numero di lampeggi: 20 manuale del guadagno: 1000 (dipende dalla macchina) tempo d'integrazione: 20 µs</li> <li>togliere la piastra dal lettore della piastra all'estremità del h. 25</li>
		<li>Rotazione verso il basso la piastra a 3.000 x g per 3 min evitare possibili contaminazioni tra i pozzetti.</li>
		<li>Rimuovere il sigillo dalla piastra.</li>
		<li>Preparare una nuova piastra a 96 pozzetti aggiungendo 90 µ l di RT-QuIC miscela di reazione contenente substrato fresco e fresco fluorescenza tingere Th-T, come descritto nella sezione 1.3.1 a 1.3.6.</li>
		<li>Trasferire 10 µ l da ciascun pozzetto della piastra prima per il 96 appena preparato ben piatto.</li>
		<li>La nuova piastra di tenuta e continuare l'analisi di RT-QuIC per ulteriori 50 h seguendo la procedura descritta nel passaggio 1.3.13. Questo ulteriore passo di h 50 farà il tempo di reazione totale di h. 75 
		Nota: Tutte le procedure di analisi di RT-QuIC vengono eseguite nell'ambito di biosicurezza.</li>
		<li>Raccogliere i dati.
		<ol><li>Lettura e documento il segnale di fluorescenza Th-T di ciascun pozzetto ogni 15 min.</li>
			<li>Raccogliere i dati dei cicli totale utilizzando software di analisi dei dati e trasferimento in un foglio di calcolo con la media delle reazioni quadruplicate.</li>
			<li>Plot le medie dei dati. L'asse x corrisponde al tempo di reazione di RT-QuIC (h) e l'asse y corrisponde alle unità relativa fluorescenza (RFU). Ogni curva corrisponde ad una diluizione di un campione noto.</li>
			<li>In ogni esperimento, delimitano una soglia di calcolare i valori medi più alti del controllo negativo plus 5 deviazioni standard come descritto nella corrente pubblicato letteratura 41. 
			NOTA: Tutte le repliche che ha attraversato la soglia vengono considerate positive. Se almeno due su quattro repliche varcare la soglia, il campione viene quindi considerato positivo.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Purificazione della proteina prionica ricombinante (rPrP) <ol><li>crescita dello stock batterici ed espressione di rPrP Nota: Escherichia coli (Escherichia coli) ceppo Rosetta (DE3) trasformata con vettore animale-24 codifica il mouse PrP (residui 23-231) è stato utilizzato per preparare il rPrP.
	<ol><li>Scongelare Stock in glicerolo di Rosetta (DE3) trasformato con animali-24 mPrP(23-231) su ghiaccio.</li>
		<li>Striscia LB (Luria Bertani) piastre con una concentrazione finale di kanamicina 50 µ g/ml e incubare per una notte in un incubatore a 37 ° C. Assicurarsi che le piastre sono capovolte per evitare la condensazione di umidità in terreni solidi contenenti i batteri. Preparare due piastre per assicurarsi di avere crescita in almeno una delle due piastre.</li>
		<li>Preparare 1 L di LB e autoclave per renderlo sterile.</li>
		<li>Supplemento 1 L di terreno sterile LB con 1 mL di kanamicina (50 mg/mL) e 1 mL di cloramfenicolo (34 mg/mL).</li>
		<li>Prendere una colonia di ciascuna piastra tramite un ciclo di inoculazione monouso per inoculare 3 mL di terreno LB contenente kanamicina e cloramfenicolo.</li>
		<li>Posto il mini-culture in un incubatore a 37 ° C con agitazione costante a 225 giri/min per 5-6 h.</li>
		<li>Aggiungere il mini-culture al resto dell'originale l 1 del LB media insieme con Express autoinduzione sistema 1 per l'induzione dell'espressione della proteina.</li>
		<li>Luogo la cultura in pallone da 2 L, o superiore, in un incubatore a 37 ° C con agitazione costante a 200 rpm per 20-24 h.</li>
		<li>Dividere la cultura 1L in provette da centrifuga 4 x 250 mL.</li>
		<li>Rotazione verso il basso le provette contenenti la cultura a 3.750 x g per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Scartare il surnatante e raccogliere il pellet batterico in provette da centrifuga 50ml, poi congelarli a-80 ° C fino a ulteriore elaborazione. Il pellet risultante hanno pesato 3 a 4 g per una resa buona proteina.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione del corpo di inclusione <ol><li>scongelare il pellet congelato (3-4 g) a 37 ° C per pochi minuti.</li>
		<li>Congelare il pellet ancora una volta per 10 min a-80 ° C e scongelare nuovamente. Ripetere questo passaggio di congelamento e scongelamento altre due volte.</li>
		<li>Risospendere il pellet batterico in 1 X reagente di lisi (ad es. BugBuster Master Mix) pipettando accuratamente. Uso 5 mL del reattivo per 1 g di pellet batterica. Assicurarsi di omogeneizzare completamente il mix.</li>
		<li>Incubare l'omogenato su un agitatore meccanico per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare l'omogeneizzato a 16.000 x g per 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Scartare i surnatanti versando attentamente off.</li>
		<li>Omogeneizzare le palline nello stesso volume di reagente di lisi come utilizzato nel passaggio precedente: 1x.</li>
		<li>Incubare l'omogeneizzato per 15 minuti su un agitatore meccanico a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere un volume sufficiente di 01:10 (0,1 x) reagente di lisi per ottenere un volume totale di omogenato di 40 mL. Mix di inversione per assicurarsi omogeneizzare bene.</li>
		<li>Centrifugare l'omogeneizzato a 7.900 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante versando attentamente esso.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 40 mL di 0,1 x reagente di lisi.</li>
		<li>Centrifugare l'omogeneizzato a 16.000 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il surnatante attentamente versandolo e memorizzare il pellet contenente i corpi di inclusione a-20 ° C fino a ulteriore elaborazione.</li>
	</ol></li> <li>Purificazione della proteina <ol><li>scongelare i corpi di inclusione a temperatura ambiente.</li>
		<li>Sciogliere i corpi di inclusione scongelati in 14 mL di 8m guanidina-HCl (cloridrato della guanidina 38g in 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 e riempimento la sospensione con H 2 O a 50 mL; non regolate il pH alla soluzione finale) per solubilizzare le proteine.</li>
		<li>Assicurarsi omogeneizzare bene pipettando su e giù.</li>
		<li>Incubare il lisato su un agitatore meccanico a temperatura ambiente per 50 min.</li>
		<li>Preparare 18 g di resina Ni-NTA Perline (18 g per 3-4 g di pellet batterica); risciacquarli con 100 mL di acqua utilizzando vuoto e un filtro superiore 100 mL 0,22 µm bottiglia.
		<ol><li>Mettere il 18 g di perle di resina Ni-NTA nel tubo da 50 mL e aggiungere un volume sufficiente di denaturare buffer (100 mM fosfato di sodio, 10 mM Tris, pH 8.0, 6m guanidina, pH 8) per rendere il volume finale fino a 50 mL.</li>
			<li>Equilibrare le perline nel buffer denaturante per 50 minuti su un agitatore meccanico a temperatura ambiente.</li>
		</ol></li> <li>Centrifugare il corpo di inclusione lisato a 16.000 x g per 5 min rimuovere i residui insolubili.</li>
		<li>Aggiungere il supernatante ai branelli equilibrati e scartare i pellet.</li>
		<li>Mettere il mix su un rocker per 40 min a temperatura ambiente per consentire il legame con le proteine alla resina Ni-NTA. 
		Nota: Perline chelati di nichel sono utilizzati per purificare PrP da sua affinità di nichel. La regione N-terminale di istidina-ricca di PrP rende l'affinità al nickel, che la proteina permette di associare a nichel ioni senza qualsiasi his-tag.</li>
		<li>FPLC lavare con acqua per pulire entrambe le linee (A e B).</li>
		<li>Eseguire buffer denaturante (100mm fosfato di sodio, 10 millimetri Tris, pH 8.0, 6m guanidina, pH 8) tramite entrambe le linee (A e B) per innescare il sistema (la colonna è non ancora associata).</li>
		<li>Caricare la resina sulla colonna. Fare in modo di ridurre al minimo le bolle d'aria.</li>
		<li>Fissare la colonna per il FPLC ed eseguire una sfumatura lineare da 100% denaturare tampone A e 0% di refolding tampone B (fosfato di sodio di 100 mM, 10 mM Tris, pH 8.0) in un primo momento a 0% denaturing buffer e ripiegamento buffer alla fine al 100%. Questo graduale spostamento viene eseguito ad una portata di 0,75 mL/min per 240 min ed è necessaria per il corretto ripiegamento della PrP. 
		Nota: Durante il processo di purificazione cromatografica, il PrP denaturato è prima lentamente riavvolgerlo sulla resina applicando una sfumatura lineare di refolding tampone per sostituire il buffer denaturante. Questo passaggio rimuove anche il caotropici guanidina-HCl.</li>
		<li>Assicurarsi che il buffer di refolding 100% continua a fluire attraverso la colonna per altri 30 min a 0,75 mL/min.</li>
		Linea <li>risciacquo con acqua seguita da tampone di eluizione (100 mM sodio fosfato 10 mM Tris, imidazolo 500 mM, pH 5,8) bypassando la colonna. Questo modo si pulirà il buffer denaturante che è stato sostituito ora dal buffer di eluizione nel sistema AKTA.</li>
		<li>Elute proteina a 2 mL/min eseguendo una sfumatura lineare per 40 min da 100% ripiegamento buffer B e 0% tampone di eluizione A in un primo momento a 0% ripiegamento buffer e buffer di eluizione del 100%. 
		Nota: L'alta concentrazione di imidazolo in tampone di eluizione gareggeranno PrP &#39; associazione di s per il nickel. Il picco di proteina primaria dovrebbe iniziare per eluire circa 1/3 del modo attraverso il gradiente.
		<ol><li>Guarda il cromatogramma per OD 280 nm ad aumentare.</li>
		</ol></li> <li>Raccogliere solo le provette contenenti la proteina al centro del grande picco. 
		Nota: Le frazioni eluite di 2 mL ciascuno vengono raccolti in provette da 15 mL.</li>
		<li>Diluire la proteina contenuta nei tubi immediatamente con circa 1/3 del volume (1 mL) di tampone di dialisi (fosfato di sodio di 10 mM, pH 5,8).</li>
		<li>Posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio.</li>
		<li>La proteina eluita contenuta nei tubi della piscina.</li>
		<li>Povero la proteina nelle cassette di dialisi (peso molecolare cut-off 10 kDa).</li>
		<li>Mettere le cassette nel buffer di pre-refrigerati dialisi (3,6 L) per 2 ore a 4 ° C, quindi trasferire le cassette in un buffer di dialisi fresca (3,6 L) per una notte. Fare sicuri che il buffer di dialisi è sotto costante agitazione.</li>
		<li>Filtro proteina dopo dialisi attraverso un filtro da 0,2 µm acrodisc siringa usando una siringa.</li>
		<li>Misurare la concentrazione di proteine utilizzando un kit di analisi della proteina BCA.</li>
		<li>Concentrato o diluire se necessario regolare la concentrazione di proteina a 0,3 mg/mL. 
		Nota: Confermare purezza da SDS-PAGE e macchiatura blu di Coomassie.</li>
		<li>Rendere le aliquote di 1 mL di proteina in provette per microcentrifuga e immediatamente conservare a-80 ° C fino al successivo utilizzo, come descritto nel protocollo RT-QuIC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

RT-QuIC precedentemente è stata impiegata per rilevare i prioni CWD in urina ed estratti fecali di oralmente infetti cervi bianco - muniti e cervo mulo 38. Il sistema illustrato in questo manoscritto è un metodo adattato del dosaggio RT-QuIC. Passaggi aggiuntivi furono incorporati nell'analisi di RT-QuIC "classica" per migliorare la rilevazione e la sensibilità del dosaggio per i prioni CWD nel materiale fecale degli animali infetti.
La bassa sensibilità di rilevazi...

Malattie da prioni o encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) sono disordini neurodegenerative compreso la malattia di Creutzfeldt – Jakob (CJD) negli esseri umani, l'encefalopatia spongiforme bovina (BSE) nei bovini, scrapie nelle pecore e capre e di sprecare cronica malattia (CWD) nei cervidi 1,2. Le TSE sono caratterizzate da aspetto spongiforme distintivo e perdita di neuroni nel cervello. Secondo l'ipotesi della "proteina solo", i prioni sono costituiti principalmente di PrPSc ('Sc' scrapie) 3, un'isoforma misfolded della proteina prionica cellulare host-codificati, PrPC. PrPSc risultante dalla conversione di PrPC in una conformazione arricchita in schede tecniche ᵦ 4,5,6 , che può agire come un seme di legare e convertire altre molecole di PrPC . Le molecole di PrPSc appena generate sono incorporate in un crescente polimero 7,8 , che si rompe in oligomeri più piccoli, con conseguente più alti numeri di nuclei infettivi. PrPSc è incline all'aggregazione ed è parzialmente resistente alle proteasi 9,10.
CWD colpisce selvatici e di allevamento degli alci (Cervus canadensis), cervo mulo (Odocoileus hemionus), cervi dalla coda bianca (WTD; Odocoileus virginianus), alce (Alces alces) e la renna (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. È considerato la più contagiosa malattia prionica con trasmissione orizzontale favorito da interazioni di cervidi e persistenza ambientale di infettività 14,15. A differenza di altre malattie da prioni dove PrPSc accumulo e infettività sono confinati al cervello, in CWD questi si trovano anche in tessuti periferici e fluidi corporei es. saliva, urina e feci 16,17, 18.
Immunohistochemistry è considerato il gold standard per la diagnosi CWD rilevare la distribuzione di PrPSc e lesioni spongiformi 19,20. ELISA e in casi più rari, macchia occidentale sono utilizzati anche per la diagnostica CWD. Così, la diagnosi delle malattie da prioni attuale si basa principalmente sulla rilevazione di prioni in tessuti post-mortem. La diagnosi ante mortem per CWD è disponibile prendendo le tonsille o le biopsie di tessuto linfoide mucosa-collegato recto-anale (RAMALT); Tuttavia, questa procedura è invasiva e richiede la cattura degli animali. Pertanto, l'uso di esemplari facilmente accessibili, come urina e feci, sarebbe un modo pratico per il rilevamento del prion CWD. Tuttavia, quei harbor escrementi relativamente basse concentrazioni di prioni sotto il limite di rilevamento degli attuali metodi di diagnostici. Di conseguenza, è necessario uno strumento diagnostico più sensibile e più alta di velocità effettiva. Analisi in vitro sistemi di conversione, quali proteina misfolding ciclica amplificazione (PMCA) 21, amiloide semina analisi e conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC) dosaggio 22,23, 24 sono strumenti molto potenti per sfruttare la capacità auto-moltiplicazione di PrPSc di mimare in vitro il processo di conversione da prioni e quindi amplificare la presenza di piccole quantità di PrPSc a livelli rilevabili 25 ,26. Tuttavia, il metodo RT-QuIC, sfrutta il fatto che il prodotto di conversione arricchito nella struttura secondaria β-foglio può legano specificamente Tioflavina T (Th-T). Di conseguenza, PrP ricombinante (rPrP) al momento della conversione seminato cresce in fibrille amiloidi che legano Th-T e pertanto possono essere rilevate in tempo reale misurando la fluorescenza della Th-T espresso in unità di fluorescenza relativa (RFU) nel corso del tempo. Una volta controllati, la RFU può essere utilizzata per valutare la relativa attività di semina e parametri quantitativi quali la fase di ritardo. La fase di ritardo rappresenta il tempo (h) necessario per raggiungere la soglia, durante il quale rPrP conversione nella fase iniziale della reazione è inferiore al limite di rilevazione di fluorescenza Th-T. Alla fine della fase di apparente ritardo, concomitante alla formazione di un nucleo dell'amiloide sufficiente (nucleazione/allungamento), si verifica quando la fluorescenza di Th-T supera il livello di soglia e diventa positiva. La crescita di amiloide fibrille possono essere rilevati in tempo reale e l'iniziale PrPSc o semina attività contenuta nel campione è amplificata dalla segmentazione che genera più semi. Questi semi inducono a sua volta una rapida fase esponenziale di crescita della fibra dell'amiloide.
Perché questo test è in grado di rilevare basso quanto 1 fg di PrPSc 24, l'alta sensibilità si qualifica questa tecnica per realizzare ante mortem o diagnosi non invasiva rilevando PrPSc in vari tessuti periferici, escrementi o altre tipi di campione che harboring i bassi livelli di infettività. RT-QuIC offre sicuramente vantaggi rispetto altri dosaggi per la sua riproducibilità, praticità, rapidità (meno di 50 h) e bassi costi rispetto alle analisi biologiche. Evita la complessità tecniche quali sonicazione utilizzato in PMCA; Inoltre, viene eseguita in una micropiastra nastro sigillato che minimizza il rischio di contaminazione dell'aerosol di ciascun pozzetto. Il formato multi-pozzetto permette l'analisi di fino a 96 campioni nello stesso esperimento. Per contrastare il problema ricorrente di falsi positivi e conversione spontanea di rPrP nelle analisi in vitro conversione l'implementazione di una soglia (cut-off) in RT-QuIC è molto utile. Infatti, sulla base dei risultati del controllo negativo (media RFU di campioni negativi + 5 SD 27), una linea di base è impostato da cui si può fare discriminazione tra positivi e negativi. L'uso di quattro repliche per ogni campione così può contribuire a definire un campione come positivo quando almeno il 50% dei replicati mostrano un segnale positivo, cioè attraversare il cut-off 28. L'omologia tra seme e substrato non è necessaria in RT-QuIC, come ad esempio in uno studio precedente, criceto rPrP è stato trovato per essere un substrato più sensibile rispetto al substrato omologo in umano PrPvCJD seminato e scrapie delle pecore seminato reazioni 29. criceto-pecore chimerico rPrP inoltre è stato suggerito un substrato più adatto rispetto umano rPrP per rilevare umano variante CJD prioni 30. Pertanto, l'utilizzo di substrati rPrP da diverse specie è molto comune in questo test. Questo test è stato applicato con successo a parecchie malattie da prioni, quali sporadiche CJD 31,32,33, gendi malattie da prioni etic 34, BSE 35,36,37, scrapie 23,36e CWD 38,39,40,41, 42. Gli studi che utilizzano elaborati del liquido cerebrospinale, sangue intero, saliva e urina come semi in RT-QuIC erano tutti di successo per rilevare PrPSc 38,39,40,41, 42. per favorire la capacità di rilevazione campioni come nel plasma sanguigno che possono contenere inibitori della formazione dell'amiloide, Orrú et al. (2011) ha sviluppato una strategia per rimuovere potenziali inibitori della formazione dell'amiloide da pettinatura PrPSc immunoprecipitazione (IP) passo e RT-QuIC, denominato "enhanced QuIC" dosaggio (eQuIC). Inoltre, un passo di sostituzione del substrato è stato impiegato dopo ~ 24 h tempo di reazione al fine di migliorare la sensibilità. In definitiva, come basso come 1 ag di PrPSc era rilevabile da eQuIC 30.
Al fine di purificare le feci estratti e rimuovere gli inibitori possibile dosaggio nelle feci, campioni di feci raccolti nelle fasi precliniche e cliniche da elk al momento dell'infezione orale sperimentale sono stati omogeneizzati in tampone contenente detergenti e inibitori della proteasi. Gli estratti di feci ulteriormente sono stati sottoposti a diverse metodologie per concentrarsi PrPSc nei campioni utilizzando la precipitazione della proteina tramite precipitazione di sodio fosfotungstico acido (NaPTA). Il metodo di precipitazione di NaPTA, in primo luogo descritto da Safar et al. 43, è usato per concentrare PrPSc in campioni di prova. L'incubazione di NaPTA con i risultati del campione in precipitazione preferenziale di PrPSc piuttosto che PrPC. Tuttavia, il meccanismo molecolare è ancora poco chiaro. Questo passaggio ha aiutato anche contenenti e impedendo la conversione spontanea del rPrP, che si osserva in alcuni casi. Infine, gli estratti di feci sono stati testati da ottimizzato RT-QuIC usando mouse rPrP (aa 23-231) come substrato e compresa la sostituzione del substrato nel protocollo per migliorare la sensibilità di rilevazione.
Qui i risultati dimostrano che questo metodo migliorato in grado di rilevare concentrazioni molto basse di prioni CWD e aumenta la sensibilità di rilevazione e specificità in campioni di feci rispetto a un protocollo senza sostituzione di precipitazione e substrato di NaPTA. Potenzialmente, questo metodo può essere applicato ad altri tessuti e fluidi corporei e può essere di grande utilità per la sorveglianza di CWD nei cervidi selvatici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc seringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UCF901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10 ml seringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA75846-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS M Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ML9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OD100C34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc sealing tapes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>232702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>7910-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>496626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-100</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9410-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial buffers and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugBuster Master Mix</td>
			<td>Nogagen</td>
			<td>71456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Life Technoligies</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards and commercial kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Express Autoinduction System 1</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71300-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA protein purification systems FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-25.50</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS Data Analysis</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism6</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

La tecnica RT-QuIC è un sensibili in vitro senza cellula del prion amplificazione saggio basato principalmente sul seminato misfolding e aggregazione del substrato di proteina (PrP) prionica ricombinante usando i semi del prion come modello per la conversione. RT-QuIC è una tecnica novella di alto-rendimento che è analoga alla reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR). Rilevamento della crescita della fibrilla dell'amiloide è basato sul colorante Tioflavina T, che reagisce in su specifica interazione con proteine ricche ᵦ-foglio. Pertanto, la formazione dell'amiloide possa essere rilevati in tempo reale. Abbiamo tentato di sviluppare un test di screening non invasivo affidabile per rilevare i sprecare prioni (CWD) la malattia cronica in estratto fecale. Qui, in particolare abbiamo adattato la tecnica RT-QuIC per rivelare PrPSc semina attività nelle feci di CWD infettati cervidi. Inizialmente, l'attività di semina degli estratti fecali che abbiamo preparato era relativamente basso in RT-QuIC, probabilmente a causa di potenziali inibitori di dosaggio del materiale fecale. Per migliorare l'attività semina degli estratti di feci e rimuovere potenziali inibitori di dosaggio, abbiamo omogeneizzato i campioni fecali in un tampone contenente detergenti e inibitori della proteasi. Abbiamo anche presentato i campioni di diverse metodologie per concentrarsi PrPSc sulla base di precipitazione della proteina usando acido fosfotungstico sodio e forza centrifuga. Infine, gli estratti di feci sono stati testati da ottimizzato RT-QuIC che comprendeva la sostituzione del substrato nel protocollo per migliorare la sensibilità di rilevazione. Così, abbiamo stabilito un protocollo per rilevazione sensibile del prione CWD semina attività nelle feci di cervidi pre-clinici e clinici di RT-QuIC, che può essere uno strumento pratico per la diagnosi non invasiva di CWD.

Gli estratti fecali CWD preparati al 10% (p/v) erano in grado di reazione RT-QuIC del seme, tuttavia la sensibilità di rilevazione era basso 27. Utilizzando un buffer specifico per omogeneizzazione fecale era un passaggio fondamentale per evitare la fluorescenza di fondo alto in reazioni RT-QuIC concomitante all'uso del substrato rPrP mouse piuttosto che rPrP di cervi che ha permesso di ottenere più specifici risultati 27. L'aggiunta di Na...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material at JoVE.com

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere una tecnica di amplificazione del prion semplice, veloce ed efficiente, il metodo di conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC).

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

real-time-quaking-induced-conversion-assay-for-detection-cwd-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Views.  University of Calgary. Qui, presentiamo un protocollo per descrivere una tecnica di amplificazione del prion semplice, veloce ed efficiente, il metodo di conversione indotta da tremare in tempo reale (RT-QuIC).

Video: Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

Proteine ​​ciclica Amplificazione misfolding di prioni

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

A seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological malignancies such as childhood acute lymphocytic leukemia. Efforts are currently underway to extend this promising therapy to solid tumors in addition to other hematological cancers. Here, we describe the development and production of potent CAR T cells targeting antigens with unique or preferential expression on solid and liquid tumor cells. The in vitro potency of these CAR T cells is then evaluated in real-time using the highly sensitive impedance-based xCELLigence assay. Specifically, the impact of different costimulatory signaling domains, such as glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (TNFR)-related protein (GITR), on the in vitro potency of CAR T cells is examined. This report includes protocols for: generating CAR T cells for preclinical studies using lentiviral gene transduction, expanding CAR T cells, validating CAR expression, and running and analyzing xCELLigence potency assays.

We describe a quantitative real-time in vitro cytolysis assay system to evaluate the potency of chimeric antigen receptor T cells targeting liquid and solid tumor cells. This protocol can be extended to assess other immune effector cells, as well as combination treatments.

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

Pan-lyssavirus in tempo reale RT-PCR per la diagnosi di rabbia

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician and the patient. A culture is also prone to false negative results from random loss of viability during specimen handling, overgrowth of other fecal flora, and poor growth of several pathogenic Campylobacter species on traditional media. These problems can confound clinical decisions on patient treatment and have limited the field from answering fundamental questions on Campylobacter growth and infections. We describe a procedure that estimates the lower limit of bacterial numbers that can be detected by a culture and a method for quantifying survival of C. jejuni in media used for transport of this fragile organism. Knowing this information, it becomes possible to set clinically relevant detection thresholds for diagnostic tests and address unstudied issues of whether non-symptomatic colonization is prevalent, if co-infection with other enteric pathogens is common, or if bacterial load correlates with symptoms or serious sequelae. The study also included testing of 1,552 prospectively collected patient diarrheal fecal specimens that were initially classified by conventional culture and further tested by a new enzyme immunoassay. Positive and discrepant specimens were then screened by four molecular methods to assign true-positive or true-negative status. The 5 non-culture methods showed complete agreement on all 48 positive and discrepant specimens, while the culture mis-identified 14 (28%). The specimens that were incorrectly identified by culture included 13 false negative and 1 false positive sample. This basic protocol can be used with multiple Campylobacter spp. and will allow the numbers of Campylobacter bacteria that produce symptoms of gastroenteritis in humans to be determined and for prevalence rates to be updated.

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Although stool culture for Campylobacter is imprecise, it is still considered the gold standard for identification. Methods to determine the limit of detection and survival in transport media of C. jejuni in human stool are described and compared with a new immunoassay with better accuracy.

Metodi culturali per determinare il limite di rilevamento e sopravvivenza nei mezzi di trasporto di Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Fecal (micro) RNA Isolation

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs from fecal samples of animal and human subjects. The aim is to isolate total RNA with high purity and quantity for downstream analyses such as RNA sequencing, RT-PCR, and micro-array. The advantages of this optimized protocol in the miRNA isolation are capabilities of isolating highly purified RNA products with additional washing steps described, increased quantity of RNA obtained with an improved method in the resuspension of sample, and important tips of decontamination. One limitation is the inability to process and purify larger sample of more than 200 mg as these sample sizes would cause a difficulty in the clear formation of the interphase. Consequently, the large sample size may contaminate the aqueous phase to be extracted as described in the protocol with organic matters that affect the quality of RNA isolated in the end. However, RNA isolates from a sample of up to 200 mg are sufficient for most of downstream analyses.

Fecal micro RNA Isolation

This protocol isolates high quality total RNA from fecal samples of animal and human subjects. A commercial miRNA isolation kit is used with significant adaption to isolate pure RNA with optimized quantity and quality. The RNA isolates are good for most downstream RNA assays such as sequencing, micro-array, and RT-PCR.

Isolamento fecale (micro) RNA

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

Strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Proteine ciclica Amplificazione misfolding di prioni

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

A seguito in tempo reale l'impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Pan-lyssavirus in tempo reale RT-PCR per la diagnosi di rabbia

Metodi culturali per determinare il limite di rilevamento e sopravvivenza nei mezzi di trasporto di Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Isolamento fecale (micro) RNA

Strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da Pseudomonas aeruginosa

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Proteine ​​ciclica Amplificazione misfolding di prioni

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

A seguito in tempo reale l'impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Pan-lyssavirus in tempo reale RT-PCR per la diagnosi di rabbia

Metodi culturali per determinare il limite di rilevamento e sopravvivenza nei mezzi di trasporto di Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Isolamento fecale (micro) RNA

Strumenti per la valutazione in tempo reale di un modello di infezione da Pseudomonas aeruginosa

Proteine ciclica Amplificazione misfolding di prioni