Name: Video: High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes
Uploaded: 2015-03-24T16:00:00
Duration: 10 min
Description: 13.2K Views. US Food and Drug Administration. This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Questo lavoro è stato sostenuto da CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency accordo YI-AI-6153-01, FDA / CBER fondi intramurali, e la FDA contromisure mediche Initiative. TCT, MNB, VPM, LMS, e KDK sono stati sostenuti da un appuntamento al Programma Partecipazione di ricerca presso il Centro di Valutazione e Ricerca Biologics amministrato dal Ridge Institute Oak per l&#39;educazione scientifica attraverso un accordo tra gli Stati Uniti Interagency Departmen dell&#39;Energia e degli Stati Uniti Food and Drug Administration.

1. Preparazione delle Diluizioni Seriali standard (Figura 3A) NOTA: Serie Serial diluizione dei plasmidi linearizzati contenenti le sequenze mirate da un insieme Pr / Pb sono utilizzati come standard quantitativi per l&#39;analisi qRT-PCR. Ogni set di diluizione seriale standard per i sottotipi IFN contiene un volume sufficiente per eseguire 90 piastre test. I quattro punti della curva di diluizione standard utilizzato per il saggio sono selezionati per coprire valori Ct da una gamma da 20 a 32 (Tabella 3). <ol><li> Thaw, vortex e centrifugare brevemente la standard (50 pm) e il salmone DNA dello sperma (ssDNA, 10 mg / ml) soluzioni stock. </li><li> Preparare la miscela ssDNA / acqua per 17 insiemi diluizione standard miscelando 51 ml di ssDNA con 20,3 ml di acqua. </li><li> Etichettare un 8-tubo PCR strip per un set diluizione standard. NOTA: La preparazione delle diluizioni seriali standard delle soluzioni madre avrà 2-3 ore. </li><li> Dispensare 190 microlitri della miscela ssDNA / acqua alla ftubo IRST nella striscia e 180 ml di ssDNA mix / acqua ai cinque tubi rimanenti. </li><li> Eseguire una diluizione 1:20 trasferendo 10 ml dal ceppo standard di 50 PM per il tubo con 190 ml di ssDNA / acqua, mescolare; vortex e rapidamente si centrifuga la striscia PCR. </li><li> Eseguire una diluizione 1:10 trasferendo 20 microlitri dal tubo più recente diluito al successivo tubo nella serie; vortex e rapidamente si centrifuga la striscia PCR. </li><li> Ripetere il punto 1.6 fino all&#39;ultimo tubo nella serie di diluizioni ha ricevuto lo standard. </li><li> Ripetere i passaggi 1,3-1,7 per ogni standard. </li></ol> Vedere tabella 3 2. Preparazione di Primer / Probe (Pr / Pb) e No Control Template (NTC) di funzionamento Stock Mixes (Figura 3B) NOTA: ogni 1,7 ml Pr / Pb set stock e 128,6 ml nessun controllo Template (NTC) che lavorano magazzino mix farà 30 piastre saggio lavorare. <ol><li> Preparare il Pr / Pb set mix azionari di lavoro. NONE: Preparazione del set Pr / Pb e NTC lavoro stock mescola dalle soluzioni madre avrà 2-3 ore. <ol><li> Risospendere i primer e le sonde a 100 micron con acqua ultra-pura per la preparazione delle soluzioni madre. </li><li> Etichetta fino a diciassette 2 tubi ml; uno per ogni set Pr / Pb inclusi nel test. </li><li> Thaw, vortex e centrifugare brevemente i primer (100 micron), sonde (100 micron), e ssDNA (10 mg / ml) soluzioni stock. </li><li> Aggiungere 2 ml di ssDNA ad ogni tubo con il 12,5 microlitri pipetta multicanale elettronica. Aggiungere il primer in avanti del caso, indietro primer e sonda per ogni Pr / Pb set di lavoro stock tubo. Vedi Tabella 1 per i set di Pr / Pb di targeting sottotipi IFN umani e Tabella 2 per il macaco rhesus insiemi Pr / Pb. Aggiungere acqua per portare il volume di ogni Pr / Pb set di lavoro stock tubo di 200 ml. NOTA: Il volume di primer, sonde e acqua da aggiungere dipende dalla concentrazione di reazione finale richiesto un Pr / Pbset. </li></ol></li><li> Preparare le miscele azionari NTC di lavoro. <ol><li> Label due strisce PCR 5 tubi per gli stock di lavoro NTC mescola. </li><li> Trasferimento 14.3 ml di ogni Pr / Pb impostati al tubo di lavoro stock adeguato mix NTC. Vedere la Tabella 4 per i set di combinazioni di Pr / Pb per pozzi NTC. Aggiungere acqua a ciascuna delle azioni di lavoro NTC mescola per portare il volume finale a 128,6 ml. </li><li> Vortex, centrifugare brevemente, e posizionare i tubi al buio in ghiaccio oa -20 ° C per la conservazione a lungo termine. </li></ol></li></ol> Vedere tabella 4 <ol start="3"><li> Diluire il Pr / Pb set scorte di lavoro. <ol><li> Dopo la rimozione di una aliquota dei set Pr / Pb necessari per le miscele Stock Working NTC, aggiungere 1,5 ml di acqua per portare il volume finale di ogni Pr / Pb set di lavoro stock tubo di 1,7 ml. </li><li> Vortex, centrifugare brevemente, e posizionare i tubi al buio in ghiaccio oa -20 ° C per la conservazione a lungo termine. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Preparazione delle lastre test 384 e utilizzando la pipetta multicanale automatizzata <ol><li> Preparare un piatto di origine a 96 pozzetti dei set Pr / Pb e miscele NTC per aliquotando a 384 pozzetti piastre test. NOTA: La preparazione del piatto di origine dalle Pr / Pb mix funzionamento azionari avrà meno di 1 ora. Ogni piatto fonte 96-bene è abbastanza per fare sei piastre test 384 pozzetti (Figura 3C). <ol><li> Vortex e centrifugare brevemente il Pr / Pb set scorte di lavoro e NTC mix azionari di lavoro. </li><li> Posizionare una nuova piastra a 96 pozzetti in un blocco a 96 pozzetti di raffreddamento refrigerati e designare i pozzetti per ogni set Pr / Pb o NTC mescolare i pozzetti ricevono (vedi figura 2). </li><li> Aggiungere acqua alla piastra a 96 pozzetti con una pipetta multicanale 250 microlitri elettronica: Versare 66 ml di acqua per ogni Pr / Pb impostato bene (tranne i 4 pozzi per Target 17). Dispensare 82,5 ml di acqua per i 4 target 17 pozzi. Dispensare 27,5 ml di acqua per ogni mix NTC bene. </li&gt; <li> Aggiungere il corretto Pr / Pb set stock lavorando ai pozzetti designate della piastra a 96 pozzetti: Dispensare 54 ml di corretta Pr / Pb set stock lavorando al set designati pozzi Pr / Pb (tranne i 4 pozzi per Target 17). Dispensare 67,5 ml di destinazione 17 Pr / Pb set stock di lavoro per i designati target 17 Pr / Pb set pozzi. Aggiungere 22,5 ml di corretta NTC lavoro stock mix nei pozzetti designati. </li><li> Sigillare la piastra a 96 pozzetti con una guarnizione adesiva piastra e centrifugare per 1 min a 700 xg per garantire i contenuti sono al fondo dei pozzetti. </li><li> Posizionare la piastra a 96 pozzetti nel vortex con un adattatore piastra a 96 pozzetti e mescolare per 1 min a 1.000 giri al minuto. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 5 min a 700 x g. </li><li> Conservare la piastra a 96 pozzetti fonte al buio a 4 ° C se si utilizza lo stesso giorno, altrimenti conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare le piastre test 384-bene aggiungendo il Pr / Pb insiemi utilizzando la pipetta multicanale automatizzata. NOTA: La preparazione di sei piatti test dalla piastra sorgente a 96 pozzetti avrà 3-4 ore. <ol><li> Prima di effettuare piastre, pre-raffreddare il nido raffreddamento a 4 ° C e pre-riscaldare la piastra evaporatore a 125 ° C e il blocco di calore inferiore a 80 ° C con un flusso d&#39;aria che soffia tra 20-25 litri al minuto (LPM). </li><li> Accendere la pipetta multicanale automatizzata e aprire il protocollo per la fabbricazione di piastre test IFN facendo doppio clic sull&#39;icona del software. </li><li> Per impostare la piattaforma, posizionare una scatola completamente pieno puntale in posizione piattaforma 1, la piastra di fonte a 96 pozzetti in posizione 4, e una nuova piastra a 384 pozzetti in posizione 6. Inizia la corsa premendo il tasto play. NOTA: Al termine di un percorso, ogni pozzetto conterrà 5 ml di mix Pr / Pb. NOTA: L&#39;importo finale di ssDNA aggiunto per pozzetto della piastra a 384 pozzetti test è 0.025 mg. </li><li> Agitare gentilmente la piastra di dosaggio 384 pozzetti su una superficie piana per assicurare fluidi sono in fondo dei pozzetti e applicare un adesivoguarnizione della piastra. </li><li> Centrifugare la piastra per 1 min a 700 x g. Rimuovere la guarnizione della piastra adesiva, posizionare la piastra a 384 pozzetti test in asciugatrice piastra e posizionare il collettore 384 pozzetti direttamente sopra i pozzi. </li><li> Quando il contenuto del piatto 384 pozzetti test asciutto, applicare una nuova guarnizione piastra adesiva, avvolgere in un foglio, etichetta, e conservare al buio a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. NOTA: Le piastre possono essere conservati a 4 ° C per almeno 6 mesi. </li><li> Ripetere 3.2.3-3.2.6 fino 6 x 384 pozzetti piastre test sono preparati o il liquido nella piastra sorgente a 96 pozzetti è esaurito. </li><li> Spegnere il nido di raffreddamento, chiudere il software, e spegnere la pipetta multicanale automatizzata. Spegnere l&#39;asciugatrice piatto. </li></ol></li></ol> 4. Caricamento ed esecuzione di un piatto 384 pozzetti Assay <ol><li> Preparare due gene housekeeping (HKG) e miscele, che consistono del set Pr / Pb di HKG, ssDNA, PCR master mix, e acqua, da aggiungere ad una piastra a 384 pozzetti test essiccati ( <strong&gt; Figura 3D). NOTA: La preparazione delle miscele e caricare la piastra test avrà 1-2 ore. L&#39;esecuzione del piatto test richiederà meno di 2 ore. <ol><li> Etichettare una provetta da 1,5 ml per ogni mix HKG. </li><li> Diluire 2 ml di ssDNA (10 mg / ml), con 84,9 ml di acqua. Aggiungere 2 ml di ssDNA diluito, 11.8 ml di acqua, 23 ml di master mix, e 9.2 ml di corretta 20x HKG Pr / Pr impostato ogni provetta, vortice, e centrifugare brevemente. </li><li> Utilizzare deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH) e ubiquitina C (UBC) come HKG per il dosaggio umana (vedi Materiali Tabella). Utilizzare GAPDH e 18S ribosomiale RNA come HKG per il saggio rhesus. NOTA: Il HKG utilizzato per eseguire il test sono flessibili e dovrebbe riflettere i geni appropriati per il tipo di cellule in fase di test GAPDH, UBC, e 18S sono esempi di uso comune HKG;. altro HKG può essere più appropriato. </li></ol></li><li> Preparare il campione e positive controllare ben miscele, che consistono di campione o di cDNA di controllo positivo, master mix e acqua, da aggiungere ad una piastra a 384 pozzetti test essiccato. Preparare il campione e le miscele di controllo positivi in quantità sufficiente a dispensare a 21 pozzetti della piastra (Figura 3D). <ol><li> Prima della sintesi del DNA, seguire le istruzioni del produttore per preparare i campioni di RNA con un passo DNasi digestione. </li><li> Preparare i campioni e controllo positivo in anticipo dalla sintesi cDNA di almeno 500 ng di RNA seguita da trattamento con RNasi H (volume finale di 24 microlitri di ciascun campione) seguendo le istruzioni del produttore. Conservare il cDNA preparata a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Thaw, vortex e centrifugare brevemente il cDNA campione. </li><li> Aggiungere 78,8 ml di master mix e 54,8 ml di acqua per ogni campione 24 ml e tubo controllo positivo. </li><li> Vortex e centrifugare brevemente le provette. </li></ol></li><li> Preparare gli standard e NTC mescola bene, conCONSISTONO di master mix e acqua, da aggiungere a una 384-pozzetti test secchi (Figura 3D). Per gli standard ben mescolare, aggiungere 165 ml di acqua a 275 ml di master mix in una provetta da 1,5 ml. Per la NTC bene mescolare, aggiungere 52,5 ml di acqua per 52,5 ml di master mix in una provetta da 1,5 ml. Vortex e centrifugare brevemente le provette. </li><li> Preparare una piastra test 384 pozzetti secchi per il caricamento delle miscele e campioni. <ol><li> Rimuovere un essiccata piastra a 384 pozzetti dosaggio da 4 ° C e centrifugare per 1 min a 700 x g. </li><li> Posizionare la piastra su un blocco di 384 pozzetti di raffreddamento raffreddato, rimuovere la guarnizione della piastra adesiva e delineare i pozzetti della piastra per designare dove le varie miscele e campioni verranno pipettati (Figura 1). </li></ol></li><li> Caricare la piastra a 384 pozzetti test con mix ben standard standard, NTC ben mescolare, campioni, controllo positivo, e mix HKG (Figura 3E). Vortex e centrifugare brevemente tutte le soluzioni prima di dispensare al piatto. <ol><li> Dispensare 6 ml degli standard ben si mescolano in ogni pozzetto standard con 30 microlitri elettronica pipetta multicanale. Dispensare 1,5 ml di diluizione seriale standard corretto e designato con il 12,5 microlitri pipetta multicanale elettronica. </li><li> Dispensare 7,5 ml di NTC ben si mescolano a ciascun NTC bene con il 30 microlitri elettronica pipetta multicanale. Dispensare 7,5 ml di campioni nei pozzetti designati con 30 microlitri pipetta multicanale elettronica. Dispensare 2,5 ml di HKG Pr / Pb mescola ai pozzetti designati con il 12,5 microlitri pipetta multicanale elettronica. </li><li> Riempire i pozzetti vuoti con 7,5 ml di acqua e di master mix miscela rimasto con il 30 microlitri multicanale elettronica pipetta; 7,5 ml di acqua da sola anche lavorare. </li><li> Sigillare la piastra a 384 pozzetti test con la pellicola adesiva ottica e centrifugare per 1 min a 700 x g. Vortex la piastra a 384 pozzetti sigillati nel vortex per 2 min a 2.600 rpme centrifugare per 5 min a 700 x g. </li><li> Posizionare la piastra di test 384-ben chiuso nella macchina qRT-PCR, aprire il modello per il layout del test e iniziare la corsa. NOTA: I risultati possono essere esportati come un foglio di calcolo o come file di testo per l&#39;analisi. </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni ottimali di reazione termociclatore per il test: i) 50 ° C per 2 min, ii) 95 ° C per 10 min, iii) 95 ° C per 25 s, iv) 59 ° C per 1 min. Ripetere i punti iii e iv per 40 cicli. </li><li> Esportare i dati grezzi dalla piattaforma qRT-PCR in un software foglio di calcolo. Tracciare ogni standard 4 set point come una curva standard per osservare linearità. Eseguire l&#39;analisi calcolando il ΔCq o per numero di copie in base ai quattro punti di curve standard 27. </li></ol></li></ol> Vedi Figura 3 Sotto

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Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).</li></ol>

VPM and RLR are co-inventors of the technology to measure expression of IFN- and IFN- subtypes and derive royalty income from it. The remaining authors declare no conflict of interest.

Tale relazione descrive la progettazione, produzione in lotti, e un approccio verso l&#39;analisi di un test per misurare la trascrizione di una serie di geni molto simili in laboratorio di ricerca. Il test high-throughput qRT-PCR qui riportato misura la IFN-e - sottotipi λ con alta specificità. Questo metodo comporta due aspetti fondamentali, la progettazione di insiemi Pr / Pb che discriminano tra i membri di una famiglia di geni omologhi e lo sviluppo di una piattaforma di produzione per la realizzazione di lastre test 384 e affidabili e coerenti precaricati con i set di Pr / Pb. Le sonde qRT-PCR incorporano un (MB) o chimica (LNA) approccio strutturale verso il rafforzamento della loro specificità 29. Per due dei set di primer nel test rhesus (Tabella 2), il sistema di amplificazione mutazione refrattaria (ARMS) è stato incorporato nelle sequenze dei primer per migliorare ulteriormente la specificità 30. Mentre è generalmente meglio indirizzare giunzioni esone-esone a li esalta con gnce la specificità di una reazione qRT-PCR, questo non era possibile, perché il tipo di IFN geni mancano introni. Pertanto, il DNA genomico sarà amplificato nella reazione PCR, e deve essere degradata mediante trattamento DNasi dopo l&#39;estrazione di RNA. La regione di destinazione per i set di Pr / Pb è stata limitata alle regioni codificanti del peptide maturo per ogni IFN. A causa della alta somiglianza di sequenza tra i sottotipi di IFN-α, in particolare la regione peptide maturo, a volte era necessario compromettere sensibilità per garantire la specificità. Ciò è avvenuto in particolare con IFN-α17, dove il peptide trascrizione matura ha solo quattro basi uniche quando confrontato con gli altri sottotipi IFN-α. Targeting IFN-α17 richiede primer che legano le trascrizioni delle più sottotipi, limitando la specificità alla sonda. Di conseguenza, la reazione PCR amplifica sottotipi diversi IFN-α17, consumando quindi una percentuale sostanziale dei reagenti PCR e lowering l&#39;ampiezza del segnale di fluorescenza della sonda specifica per IFN-α17. Un&#39;ulteriore sfida verso la progettazione di insiemi Pr / Pb sensibili e specifici per i geni molto simili, come l&#39;IFN è la possibilità che le sequenze annotati nel database GenBank potrebbero non essere completa o completa al momento della progettazione. Ancora una volta, questo era una sfida per IFN-α17, in cui le sequenze di recente annotati non si allineano perfettamente con la versione della sequenza del database al momento della progettazione. Pertanto, quando si progetta Pr / Pb imposta per i geni che non sono state intensamente studiate, è consigliabile controllare periodicamente l&#39;ultima sequenza ragionata di un gene bersaglio. Infine, è necessario garantire che gli insiemi Pr / Pb non amplificano pseudogenes che possono essere trascritti ma non tradotte. Dopo aver disegnato i set Pr / Pb, la prossima sfida è l&#39;ottimizzazione delle condizioni di PCR di diciassette diverse Pr / Pb imposta su una piastra a 384 pozzetti. Norme Transcript sono important a testare la specificità di un insieme Pr / Pb e diventare indispensabile per armonizzare le condizioni qRT-PCR delle numerose reazioni PCR diverse. Test di un set Pr / Pb contro le norme di trascrizione stabilisce la sua efficienza e la sensibilità; plasmidi che esprimono pseudogeni molto simili possono essere necessarie per assicurare che il Pr / Pb set misura selettivamente la trascrizione del gene funzionale. Gli standard trascrizione fornisce anche un mezzo di analisi quantitativi (numero di trascritti), in aggiunta all&#39;analisi semi-quantitativa rispetto ad un gene housekeeping (ΔCq). Robotic pipettaggio multicanale da una piastra di fonte a 96 pozzetti in più 384 pozzetti piastre test migliora la precisione e la coerenza dei risultati tra le piastre. DNA di sperma di salmone (ssDNA) viene utilizzato come vettore che stabilizza e conserva i set Pr / Pb di stoccaggio a lungo termine, come fa essiccamento dei reagenti erogate nelle piastre. Essiccazione le piastre diminuisce anche il volume della reazionenecessaria per ottenere risultati riproducibili, che a sua volta conserva preziosi campioni e diminuisce l&#39;uso di reagenti costosi. Attraverso questi passaggi, lotti di piastre sono montate che forniscono precisione e coerenza per più di sei mesi. Dopo la preparazione piatto, le misure di controllo di qualità sono fondamentali per verificare la coerenza di un lotto di piastre. A questo scopo, un ulteriore quattro serie di norme vengono eseguiti su una piastra. La piastra &quot;standard 5x&quot; tiene traccia delle prestazioni e crea un set di dati a cui gli standard di un piatto individuale vengono confrontati. Mentre dieci diluizioni di 10 volte di ciascuno standard vengono utilizzati durante la progettazione dosaggio, considerazioni di spazio richiedono che quattro punti sono usati per la curva standard su ciascuna piastra di dosaggio e per la piastra standard 5x. Inoltre, un controllo positivo dovrebbe essere inclusa su ciascuna piastra per garantire la validità della piastra. In genere, ci vogliono 3-4 ore per preparare sei piastre test da un Pr / Pb sPiastra ource; è fattibile preparare dodici piastre in un solo giorno in un laboratorio di ricerca. Poiché ogni piastra di dosaggio sottotipo IFN umano esamina diciassette insiemi Pr / Pb e può ospitare quindici campioni sperimentali, un giorno di assemblaggio produce un lotto di piastre con la capacità di generare fino a 3.060 punti dati sperimentali. I dati grezzi dalla piattaforma qRT-PCR possono essere elaborati e assemblati utilizzando script di programmazione in un software foglio di calcolo per compilare automaticamente un modello di analisi predefinito. Questo metodo riduce hands-on di inserimento dati, impedendo in tal modo errori di copiatura e consente al ricercatore di concentrarsi sull&#39;analisi dei dati piuttosto che l&#39;assemblaggio dei dati. Come descritto qui, questa alta produttività assay qRT-PCR può essere applicato per misurare l&#39;espressione di sottotipi di interferone in campioni macaco rhesus e umana o potrebbe essere adattato da utilizzare per altre specie o insiemi di geni omologhi. La flessibilità del layout di piastra permette all&#39;utente di cambiare fondo / probe imposta per adattare i geni diinteresse verso un particolare tipo di cellula o sistema modello. Questo test può essere applicato per misurare IFN firme di espressione in modelli di coltura cellulare che studiano agenti patogeni o nei campioni di pazienti nel contesto di modelli di malattia per chiarire i meccanismi di segnalazione coinvolti nella risposta immunitaria.

Tipo I e III interferoni (IFN) sono fondamentali per la risposta immunitaria al virus e altri stimoli patogeni e presente in tutti i vertebrati 1. Le cellule immunitarie e non immune esprimono e secernono, oltre che rispondere a, IFN 2. Sensori immunitarie innate, come i recettori Toll-like (TLR), Sting, e RIG-I, inducono tipo I e di espressione III IFN al rilevamento dei modelli molecolari patogeni associati (PAMP) 3,4. Negli esseri umani, di tipo I IFN includono IFN-β, -ω, -κ, e 12 sottotipi di IFN-α, e si legano al recettore IFNAR1 / IFNAR2 complesso 2,5. Tipo IFN III includono IFN-λ1, -λ2, e -λ3 e legano al complesso recettoriale IL10RB / IL28RA 2. Classicamente, tipo I e III IFN legano ai rispettivi complessi recettoriali che poi reclutano STAT1 / eterodimeri STAT2 e iniziare la trascrizione di interferone stimolato geni (ISG) 6. ISG sono coinvolti in una vasta gamma di funzioni, dalla antivirali e antiattività proliferativa di attivazione della risposta immunitaria adattativa 7. I numerosi meccanismi patogeni si sono evoluti di eludere, sovvertire, e dirottare elementi della via di segnalazione IFN dimostrano l&#39;importanza di IFN nella risposta immunitaria innata 8. Ad esempio, il virus vaccinia esprime un recettore decoy con IFNAR1 omologia che sequestra tipo I IFN 9, mentre un virus della malattia Yaba-come secerne una glicoproteina che inibisce I e III IFN proteine ​​10 tipo. Oltre al loro ruolo nella difesa dell&#39;ospite, IFN sono anche implicati nella sorveglianza cancro e un certo numero di malattie auto-infiammatoria: silenziamento dell&#39;espressione IFN in cellule di carcinoma mammario limita immunosorveglianza 11, sovrapproduzione di IFN-α è un meccanismo per lo sviluppo di sistemica lupus eritematoso 12, e l&#39;attivazione errante di STING porta a infiammazione sistemica causata da una quantità eccessiva di IFN a vasculopatia STING-associato13. Terapeutico, IFN sono usati per trattare la sclerosi multipla 14, infezioni virali croniche come HBV e HCV 15 16,17, e tumori come leucemia a cellule capellute 18 e leucemia mieloide cronica 19. Domande sulla rilevanza di IFN in un particolare processo fisiologico rivelano continuamente il carattere ubiquitario di questa famiglia delle citochine. Tipo I IFN, soprattutto i sottotipi IFN-α, sono spesso considerati come un&#39;unica entità 20-23, piuttosto che come un gruppo di strettamente correlati, ma distinti, le proteine. L&#39;esistenza e la persistenza di molteplici specie IFN inclusi i sottotipi IFN-α, nel corso dell&#39;evoluzione dei vertebrati 24 suggerisce che almeno un sottoinsieme di questi sottotipi hanno funzioni specifiche o esclusive. È possibile che definiscono pattern di espressione IFN saranno decifrare e contribuire caratterizzano le funzioni specifiche di uno o più dei sottotipi 17. La sfida di studiare tegli tipo sottotipi I e III IFN si basa sulla loro identità sequenza condivisa: i dodici sottotipi IFN-α condividono&gt; 50% 25 e sottotipi IFN-λ condividono 81-96% 26 delle loro sequenze di aminoacidi. Nel descritto test qRT-PCR, faro molecolare (MB) e l&#39;acido nucleico bloccato (LNA) sonde fluorescenti discriminano singole differenze coppie di basi tra le sequenze molto simili IFN sottotipo e consentono la caratterizzazione della firma espressione IFN. 384-ben formato piatto del test comprende sia gli standard (trascrizione) e quantitativi (i geni housekeeping (HKG)) semi-quantitative misure, consentendo l&#39;analisi in base al numero di copia e trascrizione ΔCq rispettivamente. Montaggio Batch, facilitato pipettando automatizzati multicanale, e la conservazione a lungo termine, possibile attraverso l&#39;asciugatura del primer / sonda (Pr / Pb) imposta sulle piastre, migliorare la riproducibilità, utilità e la praticità del test. Questo protocollo descrive il processoper la preparazione di piatti a 384 pozzetti test qRT-PCR (Figura 1) con un massimo di diciassette diversi set Pr / Pb di targeting sottotipi IFN umani (Tabella 1). Pr / Pb set di lavoro piastre stock di origine (Figura 2) vengono utilizzati per la preparazione di più 384 pozzetti piastre saggio in un processo che può essere automatizzato usando una pipetta multicanale robotico. Mentre l&#39;attenzione iniziale era sulla creazione di un protocollo per studiare firme espressione IFN umani, questo metodo è stato applicato a macachi rhesus pure. Sebbene i layout piastra sono leggermente diverse e gli insiemi Pr / Pb (Tabella 2) sono distinti, il metodo di preparazione complessivo per creare le piastre umani e rhesus è identico. Con modifiche minime del protocollo, il metodo può essere eseguito per consentire lo sviluppo di saggi per studiare altri gruppi di geni strettamente correlati. Vedi figure 1 e 2 qui sotto Vedi tabelle 1 e 2 Below

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1824">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;"></td>
			<td style="width:668px;"></td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:531px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2mL PCR Tube Strips&#160;</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>E0030 124 286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-139</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-137</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-channel Electronic Pipette, 5-250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td style="width:141px;">14-387-118</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile</td>
			<td>Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA)</td>
			<td>229446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-115</td>
			<td>*Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td>VWR International (Radnor, PA, USA)</td>
			<td>89094-668</td>
			<td>25mL reservoirs with 2 dividers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-Centrifuge</td>
			<td>Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA)</td>
			<td>1090003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eukaryotic 18S rRNA (18S)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs99999901_s1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fixed Speed Mini Vortexer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gas Permeable Adhesive Plate Seal</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB-0580</td>
			<td>Disposable plate seal used during the plate preparation process&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Rh02621745_g1</td>
			<td>Rhesus HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hudson Solo automated multichannel pipettor&#160;</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800200</td>
			<td>Modified with a 384-well cooling nest</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Linearized plasmids (IFN genes)</td>
			<td>Aldevron (Fargo, ND, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 3000, 3580; used for assay standards&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA inhibitors</td>
			<td>Exiqon (Woburn, MA, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Item 500100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LNA Probes</td>
			<td>Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Material number VC00023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>14-387-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4309849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>N8010560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsoft Excel 2010 Spreadsheet</td>
			<td>Microsoft (Redmond, WA, USA)&#160;</td>
			<td>Office 2010</td>
			<td>Visual Basic programming language&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate Vortex Mixer</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>5353 000.014</td>
			<td>2 dimensional plate vortex apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Molecular Beacon Probes</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td>Eppendorf (Westbury, NY, USA)</td>
			<td>Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plate Dryer (manifold)</td>
			<td>Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primer sets</td>
			<td>FBR (Silver Spring, MD, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pUC57 plasmid DNA</td>
			<td>Genescript (Piscataway, NJ, USA)</td>
			<td>SD1176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>AM12400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase-free DNase Set (50)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase H</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA)</td>
			<td>M0297L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNeasy Mini Kit (250)</td>
			<td>Qiagen (Valencia, CA, USA)</td>
			<td>74106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips)</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>800350-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td>
			<td>15632-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SoftLinx Version V</td>
			<td>Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA)</td>
			<td>Custom Order</td>
			<td>Software for programming pipetting steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies (Grand Island, NY, USA)</td>
			<td>4352042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ABgene Adhesive Plate Seals&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB0580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Ubiquitin C (UBC)</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>Hs01871556_s1</td>
			<td>Human HKG Primer/probe set</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Verso cDNA synthesis Kit</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ViiA 7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td>
			<td>4453536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-Ultra Pure</td>
			<td>Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA)</td>
			<td>351-029-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zipvap 384 (plate dryer heating element)</td>
			<td>Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA)</td>
			<td>384-109A</td>
			<td>Plate Dryer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput quantitative real-time rt-pcr assay for determining expression profiles of types i and iii interferon subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

Il saggio qRT-PCR descritto può essere implementato per analizzare pattern di espressione di tipo I e III IFN in una varietà di tipi di cellule e contesti. Ad esempio, di tipo I umano e III IFN firme di espressione sono stati analizzati nelle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da 6 donatori stimolate con ligandi TLR; poli I: C (25 mcg / ml), LPS (10 ng / ml), imiquimod (10 mM), e oligonucleotidi CpG (1 mM) (Figura 4). I dati sono stati analizzati utilizzando un software foglio di calcolo e presentati come grafici radar con i sottotipi IFN-α disposte in senso orario secondo l&#39;albero filogenetico della loro sequenza proteica 27. I grafici radar di espressione IFN umano sono presentati in una scala logaritmica calcolato utilizzando i due diversi metodi di analisi incorporato nel design dosaggio: valore assoluto Cq normalizzato a HKG (ΔCq), e copiare il numero di template per microgrammo (mcg) di RNA totale . I valori del numero di copie sono calcolati dai risultati o<html> curva standard di trascrizione fa. I dati mostrano che le firme di espressione IFN umani indotte da agonisti TLR sono ligando specifico. Vedere la Figura 4 Sotto Come dimostrato per le firme di espressione IFN umani, le firme di espressione di tipo I e III IFN in macachi rhesus erano anche TLR ligando specifico. PBMC da 3 donatori sono state stimolate con poli I: C (50 mcg / ml), LPS (10 mg / ml), e imiquimod (10 ug / ml) per 3 ore (Figura 5). Espressione sottotipo IFN in cellule non stimolate al basale è stata bassa. Un numero limitato di IFN sottotipi sono state espresse in risposta a LPS e poli I: C. In contrasto, l&#39;espressione di IFN in risposta a imiquimod era alta e l&#39;espressione sottotipo era ampia. L&#39;espressione di IFN-β e IFN-λ1 si arricchisce di tutti e tre TLR agonisti 28. Vedere la Figura 5 Sotto sempre &quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig1.jpg" /> Figura 1:. Il layout per un piatto 384 pozzetti test con diciassette insiemi Pr / Pb Obiettivo numero si riferisce a un insieme Pr / Pb. Le curve standard a quattro punti (triangolo grigio scuro) vengono aggiunti alle colonne 1-5. I set HKG Pr / Pb (sfondo bianco) si aggiungono alle colonne 6 e 7. Le colonne, 8-24, sono specifici per una delle diciassette insiemi Pr / Pb. I campioni vengono aggiunti alle righe AP, da colonne 6-24 (frecce nere). I due pozzi (O5, P5) nella parte inferiore della colonna 5 ricevono solo acqua e master mix. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig2.jpg" /> Figura 2:. Il layout per un piatto di origine a 96 pozzetti con diciassette insiemi Pr / Pb numero di destinazione si riferisce ad un Pr / Pbset. Frecce nere rappresentano quando si aggiunge un insieme Pr / Pb a più pozzi. Miscele NTC sono aggiunti ai pozzetti designati (sfondo grigio scuro). I due pozzi (F3, G3) con linee diagonali sono inutilizzati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig3.jpg" /> Figura 3: Schema di interventi specifici nel protocollo del test qRT-PCR schema AE selezionano parti del protocollo.. (A) Fase 1: Preparazione di diluizioni seriali standard. (B) Fase 2: Preparazione di Pr / Pb e NTC mix azionari di lavoro. (C) Fase 3.1: Preparazione di un scorte piastra a 96 pozzetti di lavoro degli insiemi Pr / Pb e miscele NTC. (D) Fase 4,1-3: Preparazione delle miscele per caricare la piastra a 384 pozzetti test. (Estep 4.5: Caricare la piastra a 384 pozzetti test. I diagrammi sono lette dall&#39;alto a sinistra verso l&#39;angolo in basso a destra. Reagenti per l&#39;interferone (IFN) test vengono conservati a -20 ° C e sono elencati nella colonna di sinistra; Linee azioni distinte nel protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig4.jpg" /> Figura 4: La firma espressione IFN umano in cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) differisce in risposta ai ligandi TLR utilizzati per la stimolazione PBMC sono state stimolate con ligandi TLR e RNA è stato raccolto per l&#39;analisi qRT-PCR.. Le medie geometriche delle risposte di picco Poly I: C (25 mg / ml) a 8 ore (quadrati rossi), LPS (10 ng / ml) a 4 ore (triangoli verdi), Imiquimod (10 micron) a 16 ore ( diamanti viola), CpG (1 um) a16 ore (cerchi neri), e controllo non stimolata a 16 ore (cerchi blu) da 6 donatori sono mostrati in scala logaritmica 10 in funzione di espressione del HKG UBC ΔCq (sinistra) o come numero di copie per ogni mg di RNA (a destra) . Sottotipi IFN-α sono ordinate in base alla trama filogenetica della sequenza aminoacidica somiglianza. Questo dato è stato originariamente pubblicato in Immunology and Cell Biology 27. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52650/52650fig5.jpg" /> Figura 5:. Il macaco rhesus IFN firma espressione nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) è diversa in risposta ai ligandi TLR utilizzati per la stimolazione PBMC da tre macachi Rhesus (designati dalla piazza, il diamante, e il triangolo) sono stati isolati dal sangue intero e stimolati con lipopolisaccaride (LPS) (10 mcg / ml), poli I: C (50 mcg / ml) o imiquimod (10 mcg / ml). Le cellule sono state raccolte a 0 ore (OPEn forme) o dopo 3 ore di stimolazione TLR (forme chiuse) per la misura dell&#39;espressione IFN. Livelli di trascritto di tipo I, II, e III IFN sono visualizzate in scala logaritmica 10 in funzione di espressione del HKG GAPDH ΔCq (sinistra) o come numero di copia / mg RNA (a destra). Questo dato è stato originariamente pubblicato nel Journal of Interferon e citochine ricerca 28. <img alt="Tabella 1" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" width="700" /> Tabella 1:. IFN umano Primer / sonda sequenze set e la reazione informazioni <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table1.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.</a> <img alt="Tabella 2" fo:content-="" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" width="700" /> Tabella 2:. Macaco Rhesus IFN Primer / sonda sequenze set e la reazione informazioni <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52650/52650table2.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Concentrazione plasmidi (FM) </td></tr><tr><td></td><td> La </td><td> B </td><td> C </td><td> D </td></tr><tr><td> IFN-α1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α4 </td><td> 2500 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> IFN-α5 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α6 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td>0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α7 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α8 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α10 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α14 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α16 </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-α17 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-α21 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-λ1 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-λ2 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-λ3 </td><td>250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> IFN-β </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td><td> 0,025 </td></tr><tr><td> IFN-ω </td><td> 250 </td><td> 25 </td><td> 2.5 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Standard set diluizione informazioni concentrazione. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> IFN Pr / Pb Sets aggiunti </td><td> Volume dell&#39;acqua aggiunta (ml) </td></tr><tr><td> NTC 1 </td><td> IFN-β, -ω, -λ3 </td><td> 85,7 </td></tr><tr><td> NTC 2 </td><td> IFN-α1, -α5 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 3 </td><td> IFN-α2 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 4 </td><td> IFN-α4 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 5 </td><td> IFN-α7 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td>NTC 6 </td><td> IFN-α6, -α8, -α10 </td><td> 85,7 </td></tr><tr><td> NTC 7 </td><td> IFN-α14, -α16 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 8 </td><td> IFN-α17 </td><td> 114.3 </td></tr><tr><td> NTC 9 </td><td> IFN-α21, -λ1 </td><td> 100.0 </td></tr><tr><td> NTC 10 </td><td> IFN-λ2 </td><td> 114.3 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: NTC magazzino lavora mescola informazioni.

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High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K Views.  US Food and Drug Administration. This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible. 

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

Pairwise crescita Concorso test per la determinazione della Fitness replica del virus dell&#39;immunodeficienza umana

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

Perla base Multiplex Assay per l'analisi dei profili di Cytokine di lacrima

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification of lymphocyte subtypes is important for the study of immunology as well as diagnosis and treatment of various diseases. Currently, standard methods for classifying lymphocyte types rely on labeling specific membrane proteins via antigen-antibody reactions. However, these labeling techniques carry the potential risks of altering cellular functions. The protocol described here overcomes these challenges by exploiting intrinsic optical contrasts measured by 3D quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurement of 3D refractive index (RI) tomograms of lymphocytes provides quantitative information about 3D morphology and phenotypes of individual cells. The biophysical parameters extracted from the measured 3D RI tomograms are then quantitatively analyzed with a machine learning algorithm, enabling label-free identification of lymphocyte types at a single-cell level. We measure the 3D RI tomograms of B, CD4+ T, and CD8+ T lymphocytes and identified their cell types with over 80% accuracy. In this protocol, we describe the detailed steps for lymphocyte isolation, 3D quantitative phase imaging, and machine learning for identifying lymphocyte types.

We describe a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurements of 3D refractive index tomograms of lymphocytes present 3D morphological and biochemical information for individual cells, which is then analyzed with a machine-learning algorithm for identification of cell types.

Identificazione dei sottotipi del linfocita usando la formazione immagine tridimensionale fase quantitativa privo di etichetta e Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un High-throughput Shigella-specifica analisi battericida

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

Pan-lyssavirus in tempo reale RT-PCR per la diagnosi di rabbia

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

Analisi di cocultura ad alta produttività per l'analisi delle interazioni microbiche

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Analisi del trascrittoma ad alto rendimento per indagare le interazioni ospite-patogeno

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...