Der Zweck der Methode ist es, eine immunologische Synapse zu erzeugen, die ein Beispiel für die Zell-zu-Zell-Konjugation ist, die durch eine Antigen-präsentierende Zelle und eine T-Helfer-Lymphozyten gebildet wird. Unser Ziel ist es, die ersten Stadien der Immunsynapsebildung aufzuzeichnen und die Handelsereignisse in der T-Helfer-Lymphozyten aufzuzeichnen. Diese werden schließlich zu einer polarisierten Sekretion an der Immunsynapse führen.
Der hier vorgestellte Ansatz umfasst die Konjugation von Zelle zu Zelle, die Zeitraffererfassung, die Weitfeldfluoreszenzmikroskopie und die anschließende Bildverarbeitung. Dies verbessert das Signal-Rausch-Verhältnis der Bilder, verbessert die zeitliche Auflösung und ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer Fluorchrome in neu entstehenden synaptischen Konjugaten und verringert die Fluoreszenzbleichung. Darüber hinaus ist das Protokoll mit Endpunktzellfixierungsprotokollen kompatibel, die Immunfluoreszenzfärbung und -analyse ermöglichen.
Dieses Protokoll ist auch mit laserscannder Fluoreszenzmikroskopie und anderen modernen Mikroskopietechniken kompatibel. Demonstriert wird das Verfahren von Ana Bello, einer Doktorandin, Alejandro Garrido, einem Techniker, und Solange Moreno, einer Studentin. Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie 150 Mikroliter Fibronectin zu jedem Brunnen einer acht Mikrowell-Kammerrutsche hinzu und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten bis eine Stunde.
Nach der Inkubationszeit das Fibronectin ansaugen und mit 200 Mikroliter PVS zwei Minuten lang mit sanftem Schütteln gut waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal und lassen Sie die zweite Wäsche im Brunnen. Übertragen Sie 10 Milliliter einer konfluenten Präkultur von Raji-Zellen auf eine 15 Milliliter V-Bodenröhre.
Zentrifuge bei 300 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet vorsichtig in einem warmen, vollständigen Medium mit einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter wieder auf. Um die Raji-Zellen zu beschriften, übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen im Kulturmedium auf eine Zwei-Milliliter-Röhre.
Für die acht Mikrowell-Kammerrutsche werden insgesamt 1,6 Milliliter Zellsuspension benötigt. Fügen Sie Zell-Tracker blau zu einer endgültigen Konzentration von 10 Mikromolar hinzu. Den Zelltracker blau gefärbte Zellen wieder aufsetzen und 200 Mikroliter der Zellsuspension in jeden Brunnen der vorbereiteten Fibronectin-beschichteten Kammerschlitten übertragen.
Inkubieren Sie die Kammerrutsche bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid für 30 Minuten bis eine Stunde. Danach schütteln Sie vorsichtig die Kammergleitet auf dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Raji-Zellen haften bleiben. Waschen Sie jeden gut sorgfältig mit warmen, vollständigen Zellkultur Medium, um überschüssige Zelle Tracker blau zu beseitigen.
Stellen Sie sicher, dass die Raji-Zellen an der Unterseite der Platten haften, und sie zeigen Lücken untereinander und sie sind nicht konfluent. 50-60% des Zellzusammenflusses ist angemessen. Zuerst fügen Sie Staphylokokken Enterotoxin E in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu jedem Brunnen hinzu.
Stellen Sie sicher, dass Raji-Zellen mit Superantigen gepulst werden, sonst wird der T-Zell-Rezeptor aus den Jurkat-Zellen die SCE nicht erkennen und Synapse wird nicht gebildet. Inkubieren Sie die Kammerrutsche bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid für mindestens 30 Minuten. Als nächstes erhalten Sie eine zuvor wachsende Kultur von Jurkat-Zellen in einer Konzentration zwischen 1 und 2 Millionen Zellen pro Millimeter.
Beobachten Sie die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop und übertragen Sie die Zellen dann in ein 15 Milliliter V-Bodenrohr. Zentrifuge bei 300 mal G und bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in einem warmen, vollständigen Kulturmedium mit einer Konzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter sanft wieder auf.
Dann halten Sie die Jurkat-Zellen in Kultur bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid, bis sie einsatzbereit sind. Holen Sie sich die Kammerschlitten mit dem Zelltracker blau beschriftet Staphylococcus Enterotoxin E gepulsten Raji-Zellen aus dem Inkubator. Saugen Sie vorsichtig das Kulturmedium von jedem Brunnen nacheinander mit einer Pipette in einer Ecke des Brunnens platziert.
Ersetzen Sie das Medium sofort durch 200 Mikroliter der resuspendierten Jurkat-Zellen im Zellkulturmedium. Wenn ein Zeitraffer durchgeführt wird, gehen Sie schnell zum Mikroskop. Suchen Sie die kammergekammerte Folie auf dem Mikroskop Staging Kellner und wählen Sie einige geeignete Felder.
Bereiten Sie das Mikroskop und die Inkubationskammer vor der Bildgebung vor. Nachdem die Jurkat-Zellen zu jedem Brunnen hinzugefügt wurden, der die Raji-Zellen enthält, lokalisieren Sie schnell die mikrowelled Kammerrutsche auf dem vorgeheizten Mikroskop inszenierten Inkubator und wählen Sie einige XY-Positionen. Wenn nur ein Endpunktexperiment geplant ist, inkubieren Sie die Kammerrutsche bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid für ein bis zwei Stunden.
Prüfen Sie nach der Kulturperiode die Konjugatbildung und fixieren Sie anschließend die Konjugate, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie warmes RPMI ohne FCS hinzu und schütteln Sie sanft. Aspirieren Sie den RMPI und fügen Sie 200 Mikroliter entweder PFA oder vorgekühltes Aceton zu jedem Brunnen hinzu.
Die Kammerrutsche bei Raumtemperatur oder auf Eis 20 Minuten inkubieren. Dann waschen Sie jeden Brunnen zweimal mit PVS und fügen Sie 200 Mikroliter Löschlösung. In dieser Studie, Jurkat-Raji Immunsynapse Konjugate werden erzeugt und die frühen Stadien der immunologischen Synapsenbildung sind richtig abgebildet.
Diese Strategie induziert die immunologische Synapsenbildung bei gleichzeitiger Durchführung der Zeitraffer-Bildgebung. Repräsentative synaptische Jurkat-Raji Konjugate aus dieser Technik erhalten werden hier gezeigt, einschließlich eines Bildes des Übertragungskanals, der Zelle Tracker blauen Kanal, und beide kanäle zusammengeführt. Einige synaptische Konjugate können gesehen werden, einschließlich derer, die aus nur einer Jurkat-Zelle und mehreren Raji-Zellen bestehen, die komplexe Konjugate sind.
Abnehmende Zellkonzentrationen werden die Bildung komplexer zellulärer Konjugate umgehen, bieten aber möglicherweise nicht genügend Zellkonjugate für die anschließende Analyse des polarisierten Verkehrs, was wiederum die Chancen verringert, entstehende synaptische Konjugate zu finden und abzubilden. Eine Dekonvolution der GFP-CD63-Fluoreszenzkanalbilder erfolgt mit einer geeigneten Dekonvolution-Software unter Verwendung der optischen Breitfeldoption und der richtigen optischen Parameter. Dieser dekonvolutierte Kanal wurde anschließend mit dem Zelltracker blau breit Kanal zusammengeführt.
Es gibt eine Verbesserung sowohl des Signal-Rausch-Verhältnisses als auch der Schärfe. Ein repräsentativer Z-Stack eines festen immunologischen Synapsenkonjugats wird hier gezeigt. Immunfluoreszenz wird mit Phalloidin durchgeführt, um das F-Actin, Anti-CD63 zur Visualisierung des MVB und Anti-Gamma-Tubulin zur Visualisierung von MTOC zu visualisieren, während der Zelltracker blau die Raji-Zellen beschriftet.
Die optionale Transfixierung der Jurkat-Zellen ermöglicht die Visualisierung des Verkehrs der sekretorischen Granulate in lebenden Zellen. Wenn beispielsweise GFP-CD63 ausgedrückt wird, kann die Bewegung der GFP-CD63-verzierten Vesikeln aufgezeichnet werden. Das Protokoll ist mit Endpunktfixierungsprotokollen kompatibel, die weitere Immunfluoreszenz-Färbungsprotokolle und -analysen ermöglichen.
Es gibt experimentelle Produktivitätsmodelle, die die Bildgebung in der Immunsynapse vereinfachen können, aber diese Modelle emulieren nicht die komplexe und unregelmäßige Oberfläche auf den Antigen-Präsentatorzellen, die nicht-physiologische Wechselwirkungen an der Immunsynapse erzeugen können. Der hier beschriebene Ansatz eignet sich, um einige biologische Komplexitäten, die an der Immunsynapse auftreten, zu reproduzieren und zu bestätigen. Superantigen ist ein gefährliches Toxin, also achten Sie darauf, Handschuhe zu tragen, und lassen Sie die verwendete Spitze auf der gefährlichen Box.
