In diesem Bericht werden wir sowohl bildgebende als auch biochemische Techniken zur Untersuchung der Organellenpositionierung und -zusammensetzung sowie zytoskelett-Umlagerungen diskutieren, die während der Bildung einer immunologischen Synapse beobachtet wurden. Erste Stadien des aktiven Umbaus ermöglichen es B-Zellen, ihre Zelloberfläche zu vergrößern und die Menge an Antigen-BCR-Komplexen zu maximieren, die an der Synapse gesammelt werden. Auf der anderen Seite kann die lokale Rekrutierung von Lysosomen, zusammen mit dem Zentroman an der synaptischen Membran, an die Lysosomensekretion gekoppelt werden, die bekanntermaßen die Extraktion von immobilisierten Antigenen erleichtert.
Aufgenommenes Antigen wird in Endolysosom-Fächern zu Peptiden weiterverarbeitet, die zur Präsentation an T-Helferzellen auf MHC-Klasse-II-Moleküle geladen werden. Daher ist das Studium der Organellendynamik, die mit der Immunsynapse verbunden ist, entscheidend, um zu verstehen, wie B-Zellen vollständig aktiviert sind. Immunfluoreszenz von B-Zellen, die mit immobilisierten Antigenen aktiviert werden, ermöglicht es uns, verschiedenen Zellkomponenten zu folgen und wie sie an die Immunsynapse rekrutiert werden können.
B-Zellen können durch immobilisierte Antigene an einer Perlenoberfläche oder einer Abdeckrutschfläche aktiviert werden. Antigenbeschichtete Perlen werden durch Inkubation spezifischer Liganden mit Aminoperlen hergestellt, die zuvor mit Glutaraldehyd behandelt wurden, um Aminogruppen zu aktivieren. Resuspend aktivierte Perlen in 100 Mikroliter PBS und Wirbel.
In der Zwischenzeit bereiten Sie die Antigenlösung vor, indem Sie 100 Mikrogramm pro ml BCR-Ligand in 150 Mikroliter PBS hinzufügen. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter aktivierte Perlen in die Antigenlösung und inkubieren über Nacht bei vier Grad Celsius. Denken Sie daran, verwenden Sie auch einen nicht verwandten Liganden als negativer Kontrolle.
Waschen Sie nach der Inkubation Perlen mit PBS. Aspirieren Sie den Überstand und ersetzen Sie durch PBS. Wiederholen Sie dies dreimal.
Als nächstes blockieren Sie die drei Aminogruppen durch resuspendierte Perlen in 500 Mikroliter einer Lösung von BSA. Schließlich, resuspend Perlen in 70 Mikroliter PBS. Um die endgültige Konzentration zu berechnen, können Sie ein Hämozytometer verwenden, um die Perlen zu zählen.
Für die B-Zellaktivierung verwenden Sie ein 50 ml-Rohr und setzen Sie Zellen auf eine Konzentration von 1,5 Millionen pro ml in CLICK, ergänzt mit 5%fetalem Rinderserum, wieder auf. Als nächstes fügen Sie 150 000 B-Zellen, was einem 100 Mikroliter des Zellperlengemisches entspricht, zu einem poly-L-Lysin-beschichteten Deckslip-Anzeigeninbrüt bei 37 Grad für die verschiedenen Zeitpunkte hinzu. Ein zweiter Ansatz zur Aktivierung von B-Zellen besteht darin, sie auf antigenbeschichtete Abdeckungen auszusäen.
Dazu verbessert die Beschichtung sypergieren mit Anti-BCR und B220 die Zellhaftung. Bereiten Sie die Antigenlösung vor, indem Sie Anti-BRC und B220 in PBS zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro ml bzw. 0,5 Mikrogramm pro ml hinzufügen. Als nächstes stellen Sie den Deckel über einen Deckel von 24 Well-Platte mit Parafilmfolie bedeckt und fügen Sie 40 Mikroliter Antigenlösung.
Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie dann bei 4 Grad über Nacht. Um die Aktivierung in Coverslip zu starten, waschen Sie sie zuerst mit PBS und lassen Sie sie für ein paar Minuten trocknen. Als Nächstes fügen Sie 150.000 B-Zellen hinzu und brüten bei 37 Grad für die verschiedenen Zeitpunkte.
In beiden Fällen empfehlen wir bei der Aktivierung entweder mit Perlen oder antigenbeschichteten Dias, mit dem längsten Zeitpunkt zu beginnen und dann zu den kürzeren zu gehen. Sobald Sie den trockenen Deckelschlupf auf dem Mikroskopschlitten montiert haben, können Sie je nach Auflösungsanforderungen eine Epifluoreszenz oder ein konfokales Mikroskop verwenden, um Ihre Proben anzuzeigen. Fokussieren Sie die Probe mit dem übertragenen Licht.
Sie sollten nach Feldern suchen, in denen Zellen und Perlen mit einem Verhältnis interagieren. Für B-Zellen, die auf antigenbedeckten Abdeckungen aktiviert sind, verwenden Sie das 100-fache Objektiv für eine bessere Auflösung. Für Parameter sollten Sie einen Z-Stack verwenden, der die gesamte Zelle abdeckt.
Sie können actin beschriften, um die unteren und oberen Grenzen der Zelle abzugrenzen. Für B-Zellen, die mit antigenbeschichteten Perlen aktiviert werden und sie für Organellen beschriften, die auf einen Punkt beschränkt sind, begrenzen Sie zunächst zwei Bereiche: den Zellbereich und den Perlenbereich. Als Nächstes identifizieren Sie die Position oder die Organelle durch einen Punkt und erhalten ihre Lokalisierungskoordinaten.
Zeichnen Sie zwei Vektoren: einen zwischen dem Zellzentrum und der Organelle und einen anderen zwischen dem Zellzentrum und dem Perlenzentrum. Messen Sie die Länge beider Vektoren, und messen Sie den Winkel zwischen den beiden Vektoren, die jetzt als Alpha bezeichnet werden. Erstellen Sie eine Projektion mit dem Vektor zwischen dem Zentromund und dem Zellzentrum mit dem Guassian von Alpha und berechnen Sie dann den Polaritätsindex der Organelle, indem Sie den projizierten Vektor a durch b dividieren.
So weist ein Polaritätsindex zwischen Null und eins auf einen polarisierten Phänotyp hin. Werte zwischen Null und Minus 1 weisen auf einen nicht polarisierten Phänotyp hin. Um den Polaritätsindex für dispersere Organellen, wie Lysosomen, zu bestimmen, können Sie denselben zuvor erwähnten Algorithmus verwenden, indem Sie die Organellenlokalisierungskoordinaten für die Koordinaten des Massenzentrums der Etiketten, in diesem Fall Lysosomen, ändern.
Ähnlich wie bei der zuvor beschriebenen Analyse weist ein Polaritätsindex zwischen Null und eins auf einen polarisierten Phänotyp hin, während Werte zwischen Null und Minus einen nicht polarisierten Phänotyp anzeigten. Um die Menge jeder Organelle zu quantifizieren, die eng an die neue Synapse rekrutiert wird, können Sie den Prozentsatz der Organellefluoreszenz an der Perle berechnen. Dazu müssen Sie die Perle und den Zellbereich abgrenzen, die jeweilige Fluoreszenzintensität messen und dann die Perlenfluoreszenz durch die Summe der Perle und der Zellfluoreszenz dividieren.
Sie erhalten die Menge jeder Organelle, die mit der neuen Synapse in Kontakt ist. Alternativ können Sie ein Rechteck gegenüber der Perle zeichnen. Verwenden Sie ein Gewicht, das einem Viertel der Zelllänge entspricht, messen Sie dann die Fluoreszenzintensität innerhalb des Rechtecks und dividieren Sie es durch die Gesamtfluoreszenz.
Dieser Algorithmus wird immer den Prozentsatz der Organelle erhalten, der eng an der neuen Synapse ist, aber nicht unbedingt in direktem Kontakt mit der Schnittstelle. Quantifizierung der zentromomassoziierten Komponenten in ruhenden und aktivierten B-Zellen. Kurz gesagt, bestimmen wir drei Parameter.
Die Zell- und Perlenfläche sowie die zentrosomalen Lokalisationskoordinaten. Als Nächstes definieren wir einen Kreis um das Zentromit und führen eine radiale Profilanalyse aus der Mitte des zuvor definierten Zentrosos durch. Sobald Sie das Diagramm haben, bestimmen Sie den Radius, in dem 70 % der maximalen Fluoreszenz beibehalten werden.
Verwenden Sie diesen Radius, um einen Kreis um das Zentromat zu zeichnen. Schließlich erhalten Sie die Fluoreszenzdichte der Komponente von Interesse im Zentromatbereich und im Zellbereich und teilen beide Werte, um das Fluoreszenzdichteverhältnis zu erhalten. Um die Verteilung von Organellen an der Immunsynapse-Schnittstelle zu messen, identifizieren Sie zunächst den Bereich der B-Zellen, die mit dem antigenbeschichteten Deckelschlupf in Berührung kommen.
Sie können actin beschriften, um diesen Bereich zu definieren. Messen Sie als Nächstes den Bereich, der mit der Folie in Berührung kommt, die Höhe und die Breite der Zelle. Der Bereich, der dem antigenbeschichteten Abdeckschlupf zugewandt ist, ist eine Messung der B-Zellausbreitung bei der Aktivierung der B-Zelle.
Verwenden Sie die Höhen- und Breitenwerte, um einen zentralen Bereich in der Zelle zu begrenzen, der von den Begrenzungen durch ein Viertel der Höhen- und Breitenwerte getrennt ist. In der Regel entsprechen diese etwa einem Drittel der gesamten Zellfläche. Schließlich berechnen Sie die Organellenrekrutierung im Zentrum der neuen Synapse, indem Sie die Fluoreszenzdichte im zentralen Bereich durch die Fluoreszenzdichte der gesamten Zelle dividieren.
Positive Werte dieses Index deuten auf eine Organelle-Anreicherung im Zentrum der neuen Synapse hin. Im Gegenteil, negative Werte weisen auf eine periphere Verteilung hin. Um die Verteilung der Organellen über die Z-Ebenen von B-Zellen zu messen, die auf antigenbeschichteten Abdeckungen aktiviert sind, begrenzen Sie zunächst die synaptische Schnittstelle und die obere Grenze der Zelle.
Zeichnen Sie als Nächstes eine Linie über den Zellenmittelpunkt, und schneiden Sie das Bild neu, um ein XZ-Bild zu erhalten. Messen Sie den Kopf der Zelle und teilen Sie das Bild in 10 Brüche des gleichen Bereichs, von der Immunsynapse bis zur oberen Grenze der Zelle. Messen Sie die Fluoreszenz in jeder Z-Fraktion und berechnen Sie den Fluoreszenzprozentsatz, indem Sie die Fluoreszenz bei jeder Z-Fraktion durch die Gesamtfluoreszenz der Zelle dividieren.
Schließlich wird der Prozentsatz der Fluoreszenzintensität pro Z-Fraktion nachzeichnen. Fraktion eins und zwei stellen die synaptische Schnittstelle dar. Hier ist der Workflow oder die zentromsome Isolationsverfahren.
Verwenden Sie 20 Millionen B-Zellen pro Zustand. Vorbehandlung von Zellen mit Cytochalasin D und Nocodazol gemäß dem erforderlichen Protokoll, um die Zentromitablösung zu erleichtern. Beobachten Sie als Nächstes die Zellen, indem Sie sie in 5 ml TBS-Puffer wieder aufsetzen.
Wiederholen Sie dies mit 1 ml 0,1x TBS-Puffer, ergänzt mit 8%Saccharose. Setzen Sie das Zellpellet mit 150 MikroliterLysepuffer wieder auf. Zentrifugieren Sie bei 10.000 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius, um zytosol und organelles vom Kern zu trennen.
Den Zellüberstand vorsichtig wiederherstellen und auf ein 1,5 ml-Rohr legen. Füllen Sie es mit 300 Mikroliter Gradientenpuffer ergänzt mit 60%Saccharose. Zentrifugenproben bei 10.000 g für 30 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Dieser Zentrifugationsschritt ist wichtig, um die Zentrosomen zu konzentrieren. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand, bis Sie die Schnittstelle erreichen. Wirbeln Sie die in der Röhre verbleibende Probe.
Bereiten Sie diskontinuierliche SaccharoseGradienten in einem Ultrazentrifugenrohr vor, indem Sie 0,45 ml 70%Saccharose mit 0,27 ml 50%Saccharose und dann 0,27 ml 40%Saccharose im Gradientenpuffer überlagern. Legen Sie die zentromangereicherten Proben auf den diskontinuierlichen Gradienten und kalibrieren Sie das Gewicht jeder Probe in den jeweiligen Adaptern. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 40 000 g für 1 Stunde bei 4 Grad Celsius, mit minimaler Beschleunigung und ohne Bruch, um eine Störung des Farbverlaufs zu vermeiden.
Nach der Zentrifugation, sorgfältig sammeln 12 Fraktionen mit gleichem Volumen. Setzen Sie das Sample mit Ladepuffer wieder auf und führen Sie eine SDS-PAGE aus. Um die Organellenverteilung in B-Zellen während der Bildung einer Immunsynapse zu untersuchen, verwendeten wir 2A1.6-B-Zellen, die mit antigenbeschichteten Perlen für verschiedene Zeitpunkte aktiviert wurden.
Als Kontrolle wurden B-Zellen mit Perlen aktiviert, die einen nicht verwandten BCR-Ligand enthielten. Wir erkennen dann mit Immunfluoreszenzfärbung verschiedene Organellen, die ihre Lokalisation bei Aktivierung mit immobilisierten Antigenen ändern. Wir zeigen hier das Zentrom, beschriftet mit Alpha-Tubulin und Golgi-Apparat mit Rab6a beschriftet.
In der Grafik zeigen wir den Polaritätsindex für Zentromat und Golgi-Apparat Polarität verus jeden Zeitpunkt der Aktivierung, in dem jeder Punkt eine Zelle darstellt. Während der Aktivierung können wir beobachten, dass die Polaritätsindizes für diese Organellen Werte näher an 1 erreichen, was auf eine Zunahme ihrer Rekrutierung zum IS hindeutet. Organellen, die eine dispersere Verteilung aufweisen, wie Lysosomen, können auch mit einem Polaritätsindex quantifiziert werden. Wir können beobachten, dass der Polaritätsindex des Lysososos bei der Aktivierung positivere Werte erreichen wird, was sich aus der Rekrutierung zum IS ergibt. Wir zeigen einen komplementären Ansatz, um die Rekrutierung eines Lysosos in Richtung der Immunsynapse zu quantifizieren.
Mit dem gleichen Protokoll der Aktivierung mit antigenbeschichteten Perlen wurde die Lysosome-Rekrutierung beim IS berechnet, indem das Fluoreszenzlabel von Lyosomen quantifiziert wurde, die in dem Bereich rekrutiert wurden, der um die Perle oder innerhalb des synaptischen Bereichs definiert wurde. Wir können diese offene Aktivierung beobachten. Es gibt eine Zunahme von Lysosomen gekoppelt an die Stelle der Synapse.
Hier stellen wir die Quantifizierung von Aktin am Zentromin in B-Zellen vor, die mit spezifischen und unspezifischen antigenbeschichteten Perlen aktiviert werden. Der Pool von Actin ist mit einem Pfeil angezeigt. Die Quantifizierung von zentromassoziierten Komponenten, wie in diesem Fall Actin, kann durch Punktdiagramm dargestellt werden, in dem jeder Punkt eine Zelle darstellt.
Nach der Aktivierung nimmt die B-Zelle die Actinmenge um das Zentromom ab. Dieser Schritt ist wichtig, um das Zentromaus aus der perinuklearen Region zu lösen, um seine Polarisation zur neuen Synapse zu ermöglichen. Für B-Zellen, die auf antigenbeschichteter Oberfläche aktiviert sind, können Sie die Aktin-Remodellierung sowie die Rekrutierung von Organellen an die synaptische Membran untersuchen.
Hier zeigen wir die Analyse von Organellen, wie dem Golgi-Apparat und endoplasmatischem Retikulum, die jeweils eine zentrale bzw. periphere Verteilung aufweisen. Zusätzlich können wir die Streufläche von B-Zellen nach verschiedenen Zeitpunkten der Aktivierung berechnen. Zu diesem Zweck kennzeichnen wir actin, um die Zellgrenze in der XY-Ebene definieren zu können.
Im Diagramm können Sie die Zunahme des Zellbereichs nach 30 und 60 Minuten Aktivierung beobachten. Die Verteilung einer Organelle kann auch in der XZ-Ebene in jeweils der synaptischen Schnittstelle berechnet werden. Das Diagramm stellt die Verteilung von Actin in der Z-Ebene dar, wobei die ersten beiden Ebenen der synaptischen Schnittstelle entsprechen.
Wir können beobachten, dass Actin in diesem Bereich nach aktivierung bereichert wird. Neben der bildgebenden Analyse kann der biochemische Ansatz auch verwendet werden, um Veränderungen in der Zentromsomenzusammensetzung bei der Aktivierung von B-Zellen zu untersuchen. Wir zeigen hier einen repräsentativen westlichen Fleck zentromhaltiger Fraktion, die durch das beige Rechteck hervorgehoben wird.
Centrosome-Fraktionen wurden auf einem diskontinuierlichen Saccharosegradienten isoliert und durch Gamma-Tubulin-Nivellierung nachgewiesen. Der westliche Fleck unten zeigt Actin und Arp2 in Zentromomfraktionen aus ruhenden B-Zellen, die bei aktivierung erschöpft werden. B-Lymphozyten durchlaufen dynamische Veränderungen an der Membranschnittstelle, um eine funktionelle Immunsynapse zu bilden.
Dieser Prozess kann durch bildgebende und biochemische Techniken untersucht werden, die hier in diesem Video beschrieben werden. Wir glauben, dass diese Analyse Wertvolle Informationen über die molekularen Mechanismen liefern kann, die beteiligt sind, wie B-Zellen effizient aktiviert werden können.
