この方法の目的は、抗原提示細胞とTヘルパーリンパ球によって形成される細胞間結合の一例である免疫学的シナプスを生成することである。私たちの目的は、免疫シナプス形成の最初の段階を記録し、Tヘルパーリンパ球で起こる人身売買イベントを記録することです。これらは最終的に免疫シナプスで偏光分泌につながります。
ここで提示されるアプローチは、細胞間結合、タイムラプス獲得、広視野蛍光顕微鏡、およびそれ以降の画像処理を含む。これにより、画像の信号対雑音比が向上し、時間分解能が向上し、新たなシナプスコンジュゲート内の複数の蛍光クロムを同時に取得し、蛍光漂白を減少させます。さらに、このプロトコルは、免疫蛍光染色および分析を可能にするエンドポイント細胞固定プロトコルと互換性があります。
このプロトコルは、レーザー走査蛍光顕微鏡およびその他の最先端の顕微鏡技術にも対応しています。この手順のデモンストレーションは、大学院生のアナ・ベロ、技術者のアレハンドロ・ガリド、大学院生のソランジュ・モレノです。この手順を開始するには、8マイクロウェルチャンバースライドの各ウェルに150マイクロリットルのフィブロネクチンを加え、30分から1時間摂氏37度でインキュベートします。
インキュベーション期間の後、フィブロネクチンを吸引し、200マイクロリットルのPVSを2分間穏やかに振って洗浄します。この洗浄をもう一度繰り返し、2回目の洗浄を井戸に残します。ラジ細胞のコンフルエント前培養の10ミリリットルを15ミリリットルVボトムチューブに移す。
遠心分離機はGの300倍、室温で5分間。上清を捨て、1ミリリットル当たり100万細胞の濃度で温かく完全な培地で細胞ペレットを穏やかに再懸濁する。ラジ細胞にラベルを付けるには、培養培地中の必要数の細胞を2ミリリットルチューブに移す。
8マイクロウェルチャンバースライドの場合、合計1.6ミリリットルの細胞懸濁液が必要です。10マイクロモルの最終濃度に細胞トラッカーブルーを追加します。細胞トラッカー青染色細胞を再懸濁し、200マイクロリットルの細胞懸濁液を、調製したフィブロネクチンコーティングチャンバースライドの各ウェルに移す。
チャンバースライドを摂氏37度で5%の二酸化炭素で30分から1時間インキュベートします。この後、ラジ細胞が接着されていることを確認するために、顕微鏡のチャンバースライドを静かに振ります。余分な細胞トラッカーブルーを排除するために、暖かく、完全な細胞培養培地で慎重に各をよく洗います。
ラジ細胞がプレートの底に接着され、互いにギャップが表示され、コンフルエントではないことを確認します。50〜60%の細胞合流が適切である。まず、ブドウ球菌エンテロトキシンEを各ウェルに1ミリリットル当たり1マイクログラムの濃度で加えます。
ラジ細胞が超抗原でパルスされていることを確認し、そうでなければJurkat細胞からのT細胞受容体はSCEを認識せず、シナプスは形成されません。チャンバースライドを摂氏37度で5%の二酸化炭素で少なくとも30分間インキュベートします。次に、1ミリメートルあたり100万から200万個の細胞の濃度で以前に成長したJurkat細胞の培養を得る。
位相コントラスト顕微鏡で細胞を観察し、細胞を15ミリリットルV-底チューブに移します。遠心分離機はGの300倍、室温で5分間。上清を捨て、1ミリリットル当たり100万個の濃度で温かく完全な培養培地で細胞を穏やかに再懸濁する。
その後、ユルカット細胞を摂氏37度で培養し、5%の二酸化炭素を使用する準備ができるまで維持します。細胞トラッカーブルーラベル黄色ブドウ球菌エンテロトキシンEパルス付きラジ細胞をインキュベーターから含むチャンバースライドを取り出します。培養液を各ウェルから1つずつ慎重に吸引し、ピペットをウェルの隅に置いた。
直ちに培地を細胞培養培地中の再懸濁したユルカット細胞の200マイクロリットルに置き換える。タイムラプスが行われている場合は、すぐに顕微鏡に進みます。顕微鏡のステージングウェイターのチャンバースライドを見つけ、いくつかの適切なフィールドを選択します。
顕微鏡とインキュベーションチャンバーを画像化前に準備します。Jurkat細胞がラジ細胞を含む各ウェルに加えられた後、予熱された顕微鏡のステージインキュベーター上のマイクロウェルチャンバースライドを素早く見つけ、いくつかのXY位置を選択する。エンドポイント実験のみを計画している場合は、チャンバースライドを摂氏37度で5%の二酸化炭素で1〜2時間インキュベートします。
培養期間の後、共役形成をチェックし、その後、テキストプロトコルで概説されているようにコンジュゲートを固定する。細胞を固定するには、FCSなしで暖かいRPMIを追加し、穏やかに振ります。RMPIを吸引し、PFAまたはプレチルアセトンの200マイクロリットルを各ウェルに加えます。
室温または氷上で20分間チャンバースライドをインキュベートします。その後、PVSで各井戸を2回洗い、200マイクロリットルの焼入れ溶液を加えます。本研究では、ジュルカト・ラジ免疫シナプスコンジュゲートが生成され、免疫シナプス形成の初期段階が適切に画像化されている。
この戦略は、時間経過イメージングを同時に行いながら、免疫シナプス形成を誘導する。この技術から得られた代表的なシナプス・ラジコンジュゲートは、透過チャネルの画像、セルトラッカーブルーチャンネル、およびこれらのチャネルの両方が結合した画像を含む、ここに示されている。一部のシナプスコンジュゲートは、1つのJurkat細胞と複雑な共役であるいくつかのRaji細胞で構成されているものも含めて見ることができます。
細胞濃度を下げると、複雑な細胞コンジュゲートの形成は回避されますが、その後の偏光トラフィックの分析には十分な細胞コンジュゲートが提供されず、新たなシナプスコンジュゲートを見つけて画像化する機会が減少します。広視野光学オプションと適切な光学パラメータを使用して、適切なデコンボリューションソフトウェアを用いて、GFP-CD63蛍光チャネル画像のデコンボリューションを行います。このデコンボリューションされたチャンネルは、その後、セルトラッカーブルーブロードチャンネルにマージされました。
信号対雑音比とシャープネスの両方の改善があります。固定免疫シナプスコンジュゲートの代表的なZスタックをここに示す。免疫蛍光は、F-アクチンを視覚化するためにファロイジン、MVBを視覚化する抗CD63、および抗ガンマ尿管を使用してMTOCを視覚化し、細胞トラッカーはラジ細胞に青色の標識を施しながら行われる。
ユルカット細胞の任意のトランスフィックスは、生細胞における分泌顆粒のトラフィックの可視化を可能にする。例えば、GFP-CD63が発現すると、GFP-CD63装飾小胞の動きを記録することができます。このプロトコルは、さらなる免疫蛍光染色プロトコルおよび分析を可能にするエンドポイント固定プロトコルと互換性があります。
生産的な実験モデルは、免疫シナプスのイメージングを単純化する可能性がありますが、これらのモデルは、免疫シナプスで非生理学的相互作用を生み出す可能性のある抗原プレゼンター細胞の複雑で不規則な表面をエミュレートしません。ここで説明するアプローチは、免疫シナプスで起こるいくつかの生物学的複雑さを再現し、確認するのに適している。スーパー抗原は危険な毒素ですので、手袋を着用し、使用済みチップを危険な箱に落としてください。
