このプロトコルは、任意の心臓組織から棒状の心筋細胞を単離する方法を提供し、手動分析なしでこれらの心筋細胞の策略および核形成状態を測定するために使用することができる。他の技術と比較して、我々のプロトコルはより一貫した細胞収量および細胞形態を提供し、フローサイトメトリーとは対照的に、心筋細胞の核形成および策略状態を視覚的に検証することができる。この方法の視覚的なデモンストレーションは、心臓組織の分裂と関連が理解しやすいため重要です。
まず、安楽死させたマウスをスーピーンの位置に置き、延長された手足をテーピングします。胸を切り裂いて心臓を露出させるために、鈍い頭のはさみを使用してください。その後、下降大動脈と内静脈カバをカットします。
23ゲージの蝶の針で設定された注入に取り付けられた蠕動ポンプを使用して、左心室を通して3ミリリットルの塩化カリウムPBS溶液を注入して心臓を浸透させます。中隔を貫通しないようにしてください。その後、1分間に1ミリリットルの速度で10分間4%PFA溶液の10ミリリットルを注入します。
はさみを使って心臓全体を取り除きます。必要に応じて、特定の領域を分離します。4%PFA溶液の1ミリリットルを含む1.5ミリリットル遠心管に組織を入れる。
ロッカーに1時間インキュベートします。PBS溶液でシャーレに心臓を入れます。心室に残っているPFAを取り除くためにそれを絞り、PBSでそれを洗います。
コラーゲン溶液を含む新しい1.5ミリリットルのチューブに固定心臓を入れます。その後、一晩摂氏37度でロッカーに心臓をインキュベートします。翌日、コラーゲン溶液を含む35ミリメートルのペトリ皿に心臓を入れ、鉗子またははさみで1ミリメートルに解離する。
次に、移管ピペットを使用して、解離した組織をさらに2分間トリチュレートする。組織粒子がまだ残っている場合は、より狭い先端を持つピペットを使用し、組織の大部分が分解されるまでトリチュレーションを続けます。15ミリメートルの遠心管の上に200〜600マイクロメートルのナイロンメッシュを置きます。
解約した細胞に5ミリリットルのPBSを加え、ナイロンメッシュを通してそれらをフィルタリングします。追加の4ミリリットルのPBSを渡してナイロンメッシュを洗います。次に、1分間Gの10〜100倍にろ過した溶液を遠心分離する。
上清を捨て、染色する前にPBSの10ミリリットルでペレットを再懸濁します。フィジーのイメージ J のディストリビューションをダウンロードした後、フィジーを開き、ヘルプをクリックし、更新プログラムサイトを管理します。バイオメッドグループとIFPBプラグインを確認してください。
依存関係プラグインをダウンロードするには、楕円分割とmorpho lib J.次に閉じるをクリックして変更を適用します。次に、RStudio をダウンロードして開きます。テキスト原稿のコードをRConsoleのコマンドラインにコピーし、Enterキーを押します。
すべての依存関係をインストールするすべてのプロンプトに応答して Y と入力します。画像の定量を実行するには、フィジーを開き、核化をドラッグします。ステータスバーに入ります。
スクリプト編集ウィンドウが開いたら、左下隅の[実行]をクリックします。出力データ ディレクトリの場所を尋ねるダイアログ ボックスがポップアップ表示されます。ソフトウェアで使用されるすべての解析データ、数値、およびその他のデータを保存するフォルダを選択します。
解析パラメータで、解析する画像の場所を選択し、正規表現を使用して画像ファイル名の形式を入力します。必要な設定を選択したら、[OK] をクリックします。さまざまな段階の分析パイプラインの画像が画面に表示されるように、しきい値とセグメンテーションが正しく行われていることを確認するために、それらを検査します。多核化サーバーを開きます。
Rstudio の r。次に、folder name という変数に、最後のステップで選択した出力データ フォルダーへのファイル パスを最後のスラッシュなしで入力します。スクリプト編集ウィンドウの左上隅にある [アプリの実行] をクリックします。
スライダーを使用して、最小有効な核平均強度しきい値、最小有効な核面積しきい値、および心筋細胞の最大最小フェレット直径のしきい値を設定します。下にスクロールして[選択したしきい値を適用]をクリックし、[プロット強度分布]をクリックすると、サンプル全体の核強度分布のプロットと、各グループ変数の個別のサブプロットがレンダリングされます。サンプル内変動を考慮するには、下にスクロールしてグループ別に正規化を確認し、[計算]をクリックして推定プロイド分布をプロットします。
正規化されたサンプルグラフ全体が表示されたら、2つのピークパターンが表示されます。スライダを使用してしきい値を選択し、ディプロイドピークと四倍数ピークを互いに外れ値から分離します。次に、下にスクロールして、計算策略と核生成をクリックします。
最後に、ボタンプロットをクリックして結果フォルダに保存します。この方法は、細胞を汚染することなく比較的純粋である均一に単一化された心筋細胞を分離するために使用することができる。実装が容易で、異なる分離から一貫した心筋細胞の収率と品質を提供します。
このプロトコルで単離された心筋細胞は、抗体およびフルオロクロム共役アジードを使用して染色することができる。サルコメアの特徴的なZ線染色パターンを示すために、細胞をαアクチニンを認識する抗体で染色した。別の実験では、EdUを固定心筋細胞を単離する前にマウスに投与した。
単離後、S相を経た単核、二核、三核化心筋細胞が検出された。個々の核を同定するために、元のDNA染色像を強度に基づいて閾値した。楕円は核マスクにフィットし、個々の核をセグメント化した。
次に、画像のピクセルは、それらが最も近い楕円に基づいて領土に分割され、これらの領土の境界は核クラスターを通して線を引くために使用されました。同様のセグメンテーションプロセスを使用して心筋細胞を検出した。このセグメンテーション戦略は、新生児マウス由来の心筋細胞の大部分が単核化されることを示した。
単核化心筋細胞の頻度は、生後2週間のマウスでははるかに低く、全心筋細胞集団の約25%を占める。心筋細胞内の個々の核のプロイド状態を測定したところ、若年マウスで四量体核の高い頻度が検出された。心筋細胞を単離する場合、すべての細胞塊が三分分解を解消していることを確認することが重要です。
