Name: isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2016-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
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このプロジェクトは、（サンドラー財団によって部分的に資金提供）画期的な生物医学研究のためのUCSFプログラム、独立賞にNIH経路（R00HL114738）、およびエドワード・マリンクロット・ジュニア財団によって資金を供給されました。 JJは、NIH（T32HL007731）からポスドクフェローシップによってサポートされていました。著者は、必ずしもNIHの公式見解を示すものではありません。この作品の内容について、単独で責任を負うものとします。

The authors have nothing to disclose.

孤立した心筋細胞の全体的な健康状態は、このプロトコルのいくつかの重要な側面に依存します。まず、灌流に対する心臓の抽出から時間が重要であり、5分以内に行われるべきです。カルシウムの除去は、細胞間相互作用を解離するのに役立ちますが、負の細胞の健康、長期的に影響を与える可能性がある。29-32したがって、我々はそれが十分なEGTA（エチレングリコール四酢酸）キレート化により、灌流の最初の数分の間にカルシウムを除去するために見つけます、 22しかし、すぐに消化し ​​、その後の工程中にカルシウムを復元します。 プロテアーゼXIVの使用が大幅に単独のコラゲナーゼに比べて消化効率を向上させることができます。これは、原因コラゲナーゼバッチ変動に18,24の矛盾を低減し、重力沈降の間の分離を容易にすることによって、心筋細胞の純度を増加させます。それにもかかわらず、過剰消化培養基板への効率的なアタッチメントので、微妙なバランスの私を防ぐことができます細胞接着及び生存能力を維持しながら、細胞収率および純度を最適化するために必要なのです。したがって、プロテアーゼ消化の長さの濃度は、実験の目的に合わせて変更することができます。一般的には、消化の少ない程度は、心筋細胞の付着と生存率を向上させます。トリプシンの使用は、いくつかの心筋細胞の単離プロトコルで報告されている。18しかし、ここで使用するプロテアーゼカクテルにトリプシンの添加（コラゲナーゼおよびプロテアーゼXIV）は、おそらく過剰消化または切断に、培養中の心筋細胞の長期生存率を低下させます本質的な表面及び/又は細胞外マトリックスタンパク質。 単離の間ブタンジオンモノオキシム（BDM）を含めることは、心臓の筋肉の収縮を抑制し、ひいては端子拘縮、エネルギー消費、およびカルシウムパラドックスによる負の影響を軽減します。29,33しかし、我々の経験では、培養前BDMの除去はdedifferentiatioを促進nおよび細胞は2次元での文化に適応することができます。 2-D培養物への長期適応は、収縮性などの心筋細胞の機能的側面に影響を与える可能性があることに留意することが重要です。ネイティブサルコメア組織は無傷のままである場合にこのように、収縮性および電気生理学実験は、単離後すぐに実行する必要があります。さらに、任意のインビトロの実験と同様に、培養中の細胞は、体液性または免疫シグナル伝達などの生体内に存在する特定の外因の影響、を欠いています。一方、定義された共培養は、心筋細胞および他の細胞型との間の相互作用を研究するために実施することができる。5,34また、 インビトロ培養において培地中で規定された分子信号と心筋細胞の挙動を研究するために使用することができます。したがって、実験の全体​​的な目標は、慎重に検討し、この培養系の限界と利点を比較検討する必要があります。 。35 FBSおよび他の動物由来の血清は、細胞生理に影響を与える可能性が未知の成分を含むことに留意すべきです。36,37 FBSにおける成長因子のよく感謝存在にもかかわらず、ここで提示38心筋細胞培養物は増殖しません。むしろ、細胞周期のブロックは、ex vivoで 、開発の周産期の間にそれらの細胞周期の出口から維持。12,39このプロパティは、心臓再生医療の分野の主要な関心事である成体マウスの心筋細胞の永続的なプロパティであると思われます増殖性の表現型への哺乳類成体心筋細胞の復帰が3,26,40-42は注目すべきことに、心筋細胞が細胞周期を再入力するために必要とされるどの程度脱分化現在不明である。重く追求目標であったが、contributioました下等脊椎動物における再生への脱分化のnはよくさらに43,44,10,11に支持されて、脱分化はますます筋原繊維分解6,12,9を含む、少なくとも機能レベルで、哺乳動物系で心筋細胞の増殖と心臓再生に観察されていますしたがって、培養中の心筋細胞の分化の状態を注意深く研究目標のニーズに応じて考慮され、変調されるべきです。このように、培養条件は、潜在的にさらに血清濃度、使用定義された血清代替物または無血清培地を減少させるために修飾することができます。例えば、整理サルコメアを示す成体ラット心筋細胞は、血清なしで長期培養したが、例えば、線維芽細胞増殖因子などの増殖因子、上皮成長因子、およびトリヨードチロニンは、規定培地で使用した。45これは、同様の培地処方物、または潜在的に他のことが考えられますこのようなdifferentiから適合させたものとして製剤エーションプロトコル、46は高い組織サルコメア構造を示す、培養中の十分に分化成体マウス心筋細胞を維持するために使用されてもよいです。代替の処方物はまた、実験の必要性に応じて（例えば、高度に脱分化した心筋細胞のような）他の表現型6を達成するために開発され得るが、さらなる作業が必要となります。 線維芽細胞の役割は、新生児マウス心筋細胞周期5および長期培養中（肥大IL6シグナル伝達を介した）成体マウスの心筋細胞分化の制御に関与している。19したがって、培養中の線維芽細胞の成長は実験的な解釈で考慮されるべきです。培養中の線維芽細胞の増殖は、プレめっき工程を経て、シトシンアラビノシド19（のAraC）等の化合物を制限増殖を添加することによって制御することができる。28ただし 、のAraCもそう代替、心筋細胞の増殖を阻害します方法は、心筋細胞の細胞周期に関する研究において線維芽細胞の増殖を制御するために使用されるべきです。ここで説明するプロトコルでは、初期の心筋細胞の純度は、重力沈降工程を繰り返すことにより向上させることができる（1.4.8を参照）。 本明細書の方法は、成体哺乳類の心筋細胞周期遮断の性質を研究するために使用することができるインビトロシステムを提供します。例えば、ラットやモルモットなどの他の生物由来の初代細胞とは対照的に、マウスの主心筋細胞は、ノックインモデルのトレースなどのCreベースの系統などの強力な、よく特徴付けられた遺伝子ツールの富を提供し、47に容易に使用することができます既存の心筋細胞に由来する細胞を同定する。12,48はまた、主要な成体マウス心筋細胞46は、それらconvenienにもかかわらず、その細胞株および分化したES又はIPSC細胞とは異なり、細胞周期の遮断をもたらす天然発生の条件に供されています大きな薬物スクリーニングのCEおよび適応は、2、成人心筋細胞周期の出口の性質をプロービング実験で限られた有用性を有し得ます。 このプロトコルは、信頼性の高い単離するための方法および培養成体マウスの心筋細胞を概説します。いくつかの方法が以前に短期留学のための成体マウスの心筋細胞の単離を実証しているが、現在までに、いくつかの報告は、成人マウス心筋細胞の長期培養の存在。18,19培養中の成体マウスの心筋細胞を維持する能力を有効にする必要があります長期的な検査を必要とする実験条件下で心筋細胞生物学のin vitro研究。例えば、遺伝子発現は、典型的には、完全な発現を達成するために数日を必要とするアデノウイルスベクターを使用して操作することができます。その後の表現型の変化と分析は、実験の目的に応じて時間のさらに長い期間が必要な場合があります。ここで紹介する方法は、成体マウスcardiomの文化を許します数週間yocytes。これは、細胞周期の調節に関係するもののような心筋細胞生物学の慎重な質問、の調査のための強力なシステムを提供する必要があります。

培養心筋細胞は、しばしば、インビトロで十分に制御された環境における細胞の挙動を監視するために使用されます。例えば、形態学的、電気的、生化学的、または機械的な電池特性は、定義された培地中で1,2、および小分子薬剤、ペプチド、遺伝子調節、3または電気的刺激に応答して操作された基板上に研究することができる。4細胞の含有量ができますまた、定義された共培養を使用して制御される。5これらのインビトロ実験は、大きな薬物または遺伝子スクリーニングにおいて有用であり、心筋細胞の生物学に関わる研究の様々なタイプのためのインビボの方法で補います。 長期培養は、表現型の変化を達成するために長時間を必要とする実験的な道を可能にします。タイムリーな例は、脱分化、細胞周期に再進入し、細胞分裂は、典型的には、それ自体の上に検討されている成体哺乳類の心筋細胞の増殖、のものです週にveral日。ここで6,7、延長培養時間は、遺伝子操作、7,8-機能脱分化（ 例えば、筋節解体）9と、潜在的に転写脱分化を促進する。6その後の細胞周期の再入国と細胞分裂がさらに長い培養期間を必要とします分裂複数回の実験の目標である場合は特に、観察しました。心筋細胞周期の重要性は、既存の心筋細胞の脱分化と増殖は、ゼブラフィッシュおよび新生児マウスにおける心臓の再生を担うことが示されている心臓再生における最近のいくつかの重要な科学的な作品、の中心である。10月12日このように、可能性哺乳類の成体の心筋細胞に脱分化、細胞周期の再入国を刺激することは、人間の心臓の再生13-15で重要な問題のまま I nは 、哺乳動物の心臓の細胞周期を研究するインビトロ実験筋細胞は、主に起因するマウスモデルと比較して、長期培養のが比較的容易に、ラットのソースを使用していた。16しかし 、マウス系は両方のin vitroおよびin vivoで有用である十分に特徴付けられたトランスジェニックツールや疾患モデルの豊富なリソースを提供していますプロトコル。例えば、Creをベース系統のトレースは、in vivoでの新生児マウスの心臓に心筋を再生するソースとして既存の心筋細胞の同定を可能にした。系譜トレース新生児マウス心筋細胞のin vitro試験において 、12は間質との相互作用の検討を有効にしています線維芽細胞との共培養による細胞。5しかし、その課題に、17ほとんど報告が成体マウスの心筋細胞の単離および長期的な文化の存在。18,19 単独での短期培養のための実行可能な成体マウス心筋細胞の単離は困難な作業であることが知られています。このprotocオールは、短期および長期の調査の両方に使用することができる成体マウスから実行可能な心筋細胞を達成する方法について順を追って説明します。このプロトコルを使用して単離された心筋細胞を効率的にアデノウイルスベクター週間20,21培養で形質導入することができます。これらの方法には、in vitroで心筋細胞生物学を研究するための強力なシステムを提供します。 本明細書に記載の方法は、ランゲンドルフ逆行性灌流のバリエーションを使用して、以前の作品からいくつかの要素に基づいています。18,22、いくつかのプロトコルは、短期培養および研究のための成体マウスの心筋細胞の単離に公開されているが、23-25 ​​利点のこのプロトコルは、培養する能力孤立した心筋細胞の長期的です。これは、異所性遺伝子発現に関与すると、携帯リプログラミング戦略のように長期間を要する細胞プロセスの研究に有用であろう。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heated water jacket</td><td>Radnoti</td><td>158831</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heated water bath, Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>3013</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory pump</td><td>Watson-Marlow</td><td>323</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Exelta</td><td>63042-090</td><td></td></tr><tr><td>Tissue forceps</td><td>VWR</td><td>470128034</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 curved forceps</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fine forceps</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Small dissection scissors</td><td>VWR</td><td>470128034</td><td></td></tr><tr><td>Extra fine bonn scissors</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fine spring scissors</td><td>FST</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>S25837</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>S25414</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>86329</td><td></td></tr><tr><td>Butane dione monoxime (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>BP310100</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Novo Nordisk</td><td>393153</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Amresco</td><td>0732-288</td><td></td></tr><tr><td>Protease, type XIV</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>15-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>JRS</td><td>43613</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invitrogen</td><td>NC9141851</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Carbamate</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA44804-18</td><td></td></tr><tr><td>215 micron mesh</td><td>Component supply</td><td>U-CMN-215-A</td><td></td></tr><tr><td>20 G blunt ended needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305183</td><td></td></tr><tr><td>20 G beveled needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Lab tape</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tape</td><td>3M</td><td>1527-0</td><td></td></tr><tr><td>Silk suture, 7-0</td><td>Teleflex</td><td>15B051000</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-alpha-actinin antibody</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21121</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes

培養心筋細胞がインビボ系に相補的な技術を使用して心筋細胞生物学を研究するために使用することができます。例えば、 インビトロ培養の純度とアクセシビリティは、生化学分析、ライブイメージング、および電気生理学を細かく制御を可能にします。心筋細胞の長期培養は、短期培養で完了することができない追加の実験的アプローチへのアクセスを提供しています。例えば、脱分化、細胞周期の再進入、および細胞分裂のインビトロ研究は、これまで主として長期培養においてより堅牢であると思われるラット心筋細胞に限定されています。しかし、トランスジェニックマウス系統とよく発達した疾患モデルの豊富なツールセットの利用可能性は、心臓研究のためのマウスのシステムは魅力的です。いくつかの報告は、成体マウスの心筋細胞の単離の存在するが、いくつかの研究は、それらの長期培養を実証します。ここで紹介する、ステップ・バイ・ステップ方式であります単離および成体マウスの心筋細胞の長期培養。まず、逆行ランゲンドルフ灌流を効率的に重力沈降精製を行っプロテアーゼ、と心を消化するために使用されます。単離後脱分化の期間の後、細胞は徐々に培養に付着し週間培養することができます。アデノウイルスの細胞溶解物を効率的に単離された心筋細胞を形質導入するために使用されます。これらの方法は、心臓の生物学を研究するために、シンプルでありながら強力なモデルシステムを提供します。

野生型大人のICR（CD1）マウスの心臓は、一般的に成功したアイソレーション〜500,000百万〜1心筋細胞が得られます。すぐに分離した後、細胞は無傷のサルコメアとほとんど棒状の外観（ 図3A）を維持し、心筋収縮を伴う機能的研究のために使用することができます。 （90％以上）の棒状の心筋細胞の高い割合は、効果的な灌流および消化の指標です。生存可能な心筋細胞が大きくなる（〜100 -長さが200μm）とし、明視野照明（ 図3A）の下でシャープな外膜を持っているように見えます。例えばα-アクチニンなどの心筋細胞特異的筋節マーカーのための免疫染色、明確なサルコメアバンドパターン（ 図3C）になります。 DAPIで形態素解析及び核染色と組み合わせて、免疫染色は、単離された心筋細胞の純度を評価するために使用することができます。 FIBRoblastsだけ分離した後、小さくて丸いですが、すぐに付着し、細胞培養プラスチック上に薄い広げ、このように心筋細胞から容易に区別を可能にします。 棒状心筋細胞の低い割合は失敗分離の指標です。これは、心臓が動物から抽出された後すぐに、大動脈にカニューレを挿入するために、障害に起因することができます。非効率的な灌流は、空気塞栓症または例えば、誤ったカニュレーションのために、また、心筋細胞の形態および生存率に影響を与えることができます。 文化の中で、数日後、心筋細胞は丸い形態（ 図3B）を想定します。 1以内- 2週間、ライブ心筋細胞は、基板に付着した （ 図3D、E）を拡散始めます。死んだ細胞は、トリパンブルーを含めることによって同定することができます。成功した分離と文化が生きて心肺約50％が得られます1週間後の筋細胞。線維芽細胞などの非心筋細胞による汚染は、それらの増殖能に、後の培養におけるこれらの細胞の割合が高いことになります。これは、純度を高めるために、および/ ​​またはプレめっきを介して重力sedimentationsの数を増加させることによって回避することができる。28 72時間（ 図3E） -アデノウイルスで形質導入48内の強力な遺伝子発現を達成するために使用することができます。アデノウイルス血清型5が原因coxackieアデノウイルス受容体の高発現にin vitroで成体マウスの心筋細胞を形質導入で効率的ですが、使用するメディアの種類に依存してもよい。20 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54012/54012fig1.jpg" /> 図1. 心筋細胞分離装置および計測。マウスを抽出するために使用される（A）手術器具心臓と上から下へ、大動脈にカニューレを挿入：止血、組織鉗子、湾曲鉗子、デュモン＃5細かい鉗子、小さな切開はさみ、細かいアイリスはさみ、ファインスクイーズハサミ（B）マウス心臓を消化するために使用さランゲンドルフ灌流システム。 。潅流緩衝液は、灌流ポンプにより入口管（1）を介して吸引されている（2）及び温水ジャケットの入口ポートにポンプ出口管（3）〜（4）。潅流バッファは、それらが螺旋ガラス管、脱泡チャンバを通って移動するにつれて温水ジャケットによって暖められ、その後ストップコックによって接続された灌流出口ポート（5）に取り付けられたカニューレ挿入針から外れています。以下のコニカルチューブは、入口管を通して再循環さ灌流バッファを、キャッチ。圧力ポート（6）、コンプライアンスポート（7）及び（8）一定の流量を維持するために灌流の間閉じたまま通気。ウォータージャケットは番目から入射循環水浴によって加熱されますEジャケット入口（9）と出口（10）ポート。リングスタンドは、垂直位置（赤クランプ、紫色のコニカルチューブラック下の黒ベース）に加熱された水ジャケットを保持するために使用されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54012/54012fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54012/54012fig2.jpg" /> 図2.灌流システムの回路図の概要。原稿にいう灌流装置の重要な部分が標識されている。灌流緩衝液の流れの方向は矢印で示されています。大動脈カニューレの位置に注意し、先端が半透明、大動脈を通して見えるはず、それは大動脈弁の上方に配置されている保証されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54012/54012fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3. 成体マウスの心筋細胞を単離しました。心筋細胞は 8,000細胞/ cm 2 プロトコルここで説明したように（A）。ラミニン被覆96ウェルプレート上に孤立し、播種した新しく単離した心筋細胞、播種し、約。新たに単離し、生存可能な心筋細胞は約現れる鋭いエッジ（白矢印）で棒状のことに注意してください。しかし、明視野下での拡散外膜を有すると思われる心筋細胞は死んでいます。培養の最初の数日間の間に、心筋細胞は丸みを帯びた形状（B）を前提としています。（C）αアクチニンの免疫染色（緑）は、D1単離後に心筋細胞に特徴的な筋節バンディングを明らかにする。青色で表示核染色（DAPI）。上部示すように、下側画像に概説領域の画像をズーム（D） </st（11単離後は、CMVプロモーターの制御下でGFPレポーターを運ぶアデノウイルスで形質導入した日に心筋細胞を示し栄&gt;主催サルコメアもD11の単離後にも広がり心筋細胞における再分化した後に見ることができます。（E）明視野および落射蛍光画像UT南西にあるロバート・ジェラードからの贈り物）。細胞は、約18,000細胞/ cm 2を播種し、細胞当たり約800プラーク形成単位（PFU）の感染多重度を用いて、0日目に形質導入しました。スケールバー：50μmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54012/54012fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4"> 心筋細胞の単離緩衝液（CIB） </td></tr><tr><td colspan="4">マグの下できれいなビーカーに超純水900ミリリットルを追加します。磁攪拌。 </td></tr><tr><td colspan="4">示されているように、テーブル内のバッファコンポーネントを追加します。 </td></tr><tr><td>成分</td><td> MW </td><td>最終濃度（mM）の</td><td> 1×（G / L） </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 58.44 </td><td> 120 </td><td> 7.013 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 74.55 </td><td> 5.4 </td><td> 0.403 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO4.7H 2 O </td><td> 268.07 </td><td> 0.33 </td><td> 0.088 </td></tr><tr><td> MgSO 4・7H 2 O </td><td> 246.48 </td><td> 0.5 </td><td> 0.123 </td></tr><tr><td>タウリン</td><td> 125.1 </td><td> 30 </td><td> 3.753 </td></tr><tr><td> BDM </td><td> 101.1 </td><td> 10 </td><td> 1.011 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 238.3 </td><td> 25 </td><td> 5.958 </td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 180.16 </td><td> 22 </td><td> 3.964 </td></tr><tr><td colspan="4"> pH値のウィットを調整しますH 5 M NaOHで。 </td></tr><tr><td colspan="4">超純水で1リットルにボリュームを調整します。 </td></tr><tr><td colspan="4">滅菌フィルターワット/ 0.22μM真空フィルター。 </td></tr><tr><td colspan="4">心筋細胞の単離緩衝液1リットル当たり0.1 U / mlのインスリンの0.5μlを添加します。 </td></tr><tr><td colspan="4"> 潅流緩衝液 </td></tr><tr><td>成分</td><td>最後の</td><td>容量（ml） </td><td></td></tr><tr><td> CIB </td><td> - </td><td> 200 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA（0.4M） </td><td> 0.4 mMの</td><td> 0.2 </td><td></td></tr><tr><td>合計</td><td> - </td><td> 200 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 消化緩衝液 </td></tr><tr><td>成分</td><td>最後の</td><td>量</td><td></td></tr><tr><td> CIB </td><td> - </td><td> 15ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム（1M） </td><td> 300μM </td><td> 4.5μlの</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼXIV </td><td> 0.2 mg / mlで</td><td> 3ミリグラム</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼII </td><td> 2.4 mg / mlで</td><td> 36 mgの</td><td></td></tr><tr><td>合計</td><td> - </td><td> 15ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> 停止緩衝液 </td></tr><tr><td>成分</td><td>最後の</td><td>容量（ml） </td><td></td></tr><tr><td>潅流緩衝液</td><td> 95％ </td><td> 14.25 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム（1M） </td><td> 1.5 mMの</td><td> 22.5 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5％ </td><td> 0.75 </td><td></td></tr><tr><td>合計</td><td> - </td><td> 15ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td> 培地 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>成分</td><td>最後の ％ </td><td>容量（ml） </td><td></td></tr><tr><td> MEM培地</td><td> 90％ </td><td> 90 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10％ </td><td> 10 </td><td></td></tr><tr><td> Primocin </td><td> 0.2％ </td><td> 0.2 </td><td></td></tr><tr><td>合計</td><td> 100％ </td><td> 100ミリリットル</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">培地を37℃、5％二酸化炭素で平衡化することを可能にします。 </td></tr></tbody></table> 表1： ソリューションおよびバッファ。

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Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

26.5K ビュー.  University of California, San Francisco. This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability. 

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Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

生物学

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

医学

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...