私たちは、新生ラットとマウスの心筋細胞の分離技術への導入のための名誉教授ジャン=クロード·PerriardとイヴリンPerriard（テクノロジー、スイスのスイス連邦工科大学）に感謝しています。我々は彼らのサポートのために教授チュ陳教授シルビア·エバンス（UCSD、米国）に感謝したいと思います。 EEの実験室での作業は、MRCキャリア設立助成金によって賄われていた。 SLは、NIH / NHLBI（HL107744）からの独立賞にK99/R00経路によってサポートされています。 TMMは、米国心臓協会（11POST7310066）からのポスドクでサポートされていました。

次の手順では、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養のための2日間のプロトコル16,17について説明します。すべてのソリューションは、無菌または滅菌濾過される。すべてのツールは、75％エタノールで表面殺菌により滅菌されています。初期の組織摘出を除き、全ての工程を無菌層流細胞培養フード内で行っている。このプロトコルは、ワンツーごみ（S）からの新生児マウス心臓を単離するためのものです - 約5から14匹が、より大きなゴミサイズとラット新生児心筋細胞に適合させることができる。必要に応じて、スケールのメディア/酵素の使用量。 新生児げっ歯類での作業のために、立法府および/または動物のケアプログラムで定められた、あなたの地元の大学のガイドラインやルールを参照し、お使いの制度的に承認動物プロトコルに準拠しています。このプロトコルで説明されているすべてのメソッドは、カリフォルニア州立大学サンディ​​エゴ校の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、FEDEに付着されていますRALおよび州の規制。 1日目。 1。新生児マウスからの心臓組織の単離<ol><li> 20 mMのBDM 6-8で補充（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）×PBS中の50ミリリットルを用意し、氷の上に配置された2つの滅菌細菌皿に分散させる。 </li><li> 50ミリリットルの滅菌コニカルファルコンチューブに分離培地10mlを準備します。氷の上のすべてのソリューションを保管してください。 、鉗子（湾曲し、デュモン7号）、はさみ（1ストレート湾曲した1）を殺菌する。 </li><li> 1-3日齢の新生仔マウスは、表面殺菌し、75％エタノール溶液中で速やかにリンスする。子犬は、滅菌ハサミ（ストレート）を使用して断頭し、胸は胸腔へのアクセスと心臓（ 図1A、補足ムービーS1）を可能にするために胸骨に沿って開かれる。 技術的なコメント：3日以上経過した新生マウスを使っていますが、少数の生存細胞2になることがあります。 </li><li>心臓から抽出され湾曲したハサミでボディと氷の上で、20 mMのBDMと（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）1X PBSを含む細菌皿にすぐに移す。以下のすべての工程を無菌細胞培養フード内で行っている。 </li><li> （必要に応じて、心房）肺組織、より大きな血管を削除します。血液を除去するために20 mMのBDM（氷上）と（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）1×PBS溶液中での洗浄の心。転送は、鉗子や穴あきスプーン（ 図1B）を使用して、20 mMのBDM（氷上）と（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）1X PBSを含む第二の細菌皿に一皿から心を洗浄した。 </li><li> （氷上で）第三の細菌皿に、約0.5〜1ミリメートル3、以下（小さ ​​な断片に心をミンチする湾曲したハサミを使って、転送分離培地のドロップに心（ 図1C、約250μl）を洗浄/洗浄; 図1D、1E）。 </li><li>円錐形に刻んだ心を移すチューブは（氷上で）分離培地10mlを含む、一晩4℃で穏やかに攪拌しながらインキュベートする。 </li></ol> 2日目。 2。細胞の酵素組織消化とめっき<ol><li>コラゲナーゼ/ディスパーゼ混合物（Roche）を15mgのを計量し、20 mMのBDM（消化培地）を補充した10ミリリットルL15-媒体5に酵素ミックスを溶かす。無菌フィルター新しい滅菌50ミリリットルファルコンチューブに細胞培養フード内消化培地。 </li><li> 20 mMのBDMを補足した30ミリリットルのL-15培地を調製し、培地をメッキする。 </li><li> 1時間の最小のコラーゲン溶液（Sigma C-8919）で被覆細胞培養プレート。無菌層流細胞培養フード内でコラーゲン溶液（再利用することができます）と乾燥コラーゲンコーティングした細胞培養皿を取り外します。 </li><li> 4℃から前消化心を含む円錐管を削除組織片（ 図1G）に集約する必要があります。組織片はに沈むましょうチューブの底部と（いずれの組織片を失うことはないことを確認してください。通常、分離培地の約1ミリリットルは、チューブ内に残っている場合があります）、上清を除去します。消化培地5mlで1分間、酸素または空気を用いて組織フラグメントおよび含酸素化合物の懸濁液に20mMのBDMを補充したL-15を5ml加える。 </li><li>消化溶液の温度を調整するために約2分間37℃の水浴に消化培地中に心臓組織断片を含有する密封された円錐管に移す。 </li><li> 20〜30分（60RPM超えないように設定して37℃、で例えばシェーカー）穏やかに撹拌しながら37℃で心臓組織片をインキュベートする。消化時間が大幅に酵素混合物、ロット番号に依存し得る注意：インキュベーション時間を長く又はより高い酵素濃度は、細胞生存率を減少させることができる。 </li></ol> 技術的なコメント：102696：我々は（カタログ番号ロシュからコラゲナーゼ/ディスパーゼ混合物の使用をお勧めします38001）非常に少ないロット間のばらつきを有している。マウス心筋細胞の単離のための古典的な酵素は、トリプシンおよび/ ​​またはワージントン（カタログ番号CLS-2）から利用可能なコラゲナーゼII型3,16-20です。しかし、コラゲナーゼIIの性能は、ロット間で大きく異なる可能性があります。ワーシントンは、一般的に消化時間を最適化し、使用量を酵素には、いくつかのコラゲナーゼロットのテストが可能になります。あるいは、ワージントンは、予め試験した酵素混合物を用いて心筋細胞単離キットを販売することは、マウス心筋細胞の単離17（：NCISカタログ番号）に適合させることができる含まれる。 <ol start="7"><li>新しい滅菌50mlコニカルファルコンチューブに無菌細胞ストレーナー（40〜100ミクロンのナイロンメッシュ）を配置します。 20 mMのBDMを補足した5ミリリットルのL-15で予め湿らセルストレーナー。約10〜20回予め湿らせた10ミリリットルの細胞培養ピペットを用いて穏やかに磨砕組織断片。組織片は、ほとんどサスペンシオに細胞を放出し、このステップの間に分散​​させる必要がありますN（ 図1H）。 </li><li>より大きな組織片が沈降しましょおよび細胞ストレーナー（ 図1I）を介して新鮮なコニカルチューブに懸濁した細胞を含む上清を移す。 </li><li> 5ミリリットルの消化培地中で未消化の組織片を再することは、一時停止し、穏やかに攪拌しながら37℃でさらに5〜10分間インキュベートする。 </li><li>残りの組織片の継続的な消化した後、ゆっくりと10〜20倍のための組織を粉末化し、最初のセルストレーナーを通して消化物からの円錐管を含む細胞に加える。すべての消化細胞の通過を可能にするために20 mMのBDMを補足した5ミリリットルのL-15で細胞ストレーナーを洗浄します。 </li><li> 300回転（約50〜100×g）で5分間中断した心筋細胞を含む遠心分離コニカルチューブ。 （主に線維芽細胞および内皮細胞を含む）上清を除去し、培地をめっきする10ミリリットル中に再懸濁細胞ペレット。 </li><li>板細胞を10cmの細胞培養皿（ 図2A）へと1インキュベート細胞培養インキュベーター中で-3時間。このプレめっき工程は、コーティングされていない細胞培養皿（ 図2C）に付着した線維芽細胞及び内皮細胞（ 図2B）を除去する。 </li><li>インキュベーション後、転送再懸濁した細胞を無菌の円錐形のFalcon遠心分離管（15 mlまたは50ml）中に（繰り返し皿上にプレーティング培地をピペッティングして再懸濁細胞）を10cm培養皿から非付着性心筋細胞を洗浄し、そして。 オプション：細胞懸濁液から、追加の線維芽細胞を除去するためのめっき前の手順を繰り返します。所望であれば、接着性線維芽細胞および内皮細胞をさらに培養することができる。 </li><li> （ノイバウエル血球計数器、パンブルー排除染色21を使用することによって）細胞を数える。 </li><li> 1cm 2当たり約1.5×10 5細胞（ 図2Dの密度を有する、コラーゲンコートした細胞培養皿にプレート細胞;関連項目メッキの表1のコメントおよびコーティング）。 細胞培養インキュベーターに料理を置き、付着および心筋細胞の拡散を可能にするために12から18時間静置しておきます。 </li></ol> 3日目 - 新生児心筋細胞の培養<ol><li> 37℃の水浴中で維持培地と予熱して調製する。新生児マウスの心筋細胞のリポソームトランスフェクションのための増殖阻害剤または変剤の添加、あるいは手続きについては、表1を参照してください。 </li><li>ある日、めっき後に、心筋細胞は、細胞培養皿に接着し、最適縮小する自然発生的に開始している必要があります（ 図2E、2Fを 、 補足作品S2;分離/培養手順の間に一般的な問題については表2を参照してください）。追加の1-5日間、維持培地、および文化にメッキ培地を交換してください。必要に応じてメディアを変更します。 </li></ol>

心疾患を研究するための動物モデルを使用することは、心臓血管研究の標準となっている。クローサー（ すなわち 、生化学的または生体力学的刺激に心臓細胞の直接の反応を研究する）これらのモデルの生化学的特徴は、一般的に、心臓組織または心筋細胞の単離を必要とする。心の生理学的反応を調査した研究は、生体外 （ 例えば 40をアセチルコリンに対す?...

げっ歯類の心臓細胞の正常な解離と文化のための最も初期の報告は、1960年の1,2にさかのぼります。それでも、ハラリィとファーリーは培養心筋細胞は「定期収縮の要件の研究のためのユニークなシステムを提供することができ、[、とあり] [鼓動]プロセスのための様々な代謝経路の寄与を決定する手段を提供する」ことに気づいた。幼若ラット、元のプロトコルからハラリィとファーリー単離し、培養心筋細胞は、長年にわたって適応し、多くの科学者によって変更されているが、一般的な単離·培養手順が大幅に変更されていません。しかし、より良い酵素3、標準化されたソリューションを4,5、および単離手順6-9の間に細胞を保護する可逆チャンネルとミオシンATPアーゼ阻害剤BDMの添加は、細胞収量及び生存率を改善した。 新生児cardiomyo対アダルトcytes 新生児マウスまたはラットから単離し、培養心筋細胞は、成人の心筋細胞の培養液に比べていくつかの利点がある。成体マウスまたはラット10から心筋細胞の単離と比較した場合、まず、新生仔マウスまたはラットの心臓の分離手順は、簡単かつ低コストである。新生児心筋細胞が大幅に細胞収量を増加させる、解離後のカルシウム含有培地中に再導入するためにはるかに敏感である。大人の心筋細胞は、通常、収縮を誘発するためにペーシングが必要ですが、一般的に、めっき後自発的に拍動細胞では20時間後に、その結​​果、再分化サイクル - もう一つの大きな利点は、新生児マウスの心筋細胞は、より迅速な脱分化を受けることである。新生児の心筋細胞は、成人の心筋細胞は、トランスジェニックDNAの正常な配信のためのウイルスベクターを必要とするのに対して、より容易に、リポソームトランスフェクション法でトランスフェでもある。新生児心筋細胞とは対照的にS、成人の齧歯類心筋細胞11〜13の文化は、筋原線維の劣化と収縮装置の最終的な再構築の検討が可能になります。成人の心筋細胞におけるこれらの特徴的な形態変化は、1〜2週間の期間にわたって発生する。脱分化-再分化サイクルは、それによって人間の心筋症14で観察された病理学的変化を模倣し、胎児の遺伝子プログラムの再発現を伴う。新生児の心筋細胞を培養上の大人のラットの心筋細胞のもう一つの利点は、長期間培養することができることは、これらの細胞である。 マウスの心筋細胞対ラット ラット新生児心筋細胞の単離および培養は、生細胞のより高い収量の増加、トランスフェクション率を含むマウス新​​生児の心筋細胞のそれ以上のいくつかの利点があります。しかし、心疾患のため、遺伝子組み換えマウスモデルの幅広い使用方法（ 例えば、&lt;/ em&gt;は拡張型心筋症15のモデルとして筋肉LIMタンパク質ノックアウトマウス）は、新生児マウス由来の心筋細胞の分離手順の適応につながっている。新生ラットとマウスの心筋細胞を分離するために使用されるプロトコルは、ほとんど同じですが、より大きな注意が、後者のための適切な酵素ミックスの選択に注意する必要があります。実際、新生児マウスの心筋細胞は、減少した細胞収量および生存度で、その結果、一般的には過剰消化を受けやすい。新生仔マウス由来の心筋細胞が新生児ラット心臓由来の細胞と比較してやや小さいのでさらに、播種密度は、調整されるべきである。 形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的および生体力学的パラメータだけでなく、myofibrillogenesisのプロセスのための調査のための多くの用途で、培養された新生児心筋細胞の研究のための最も汎用的なシステムの一つとなっているin vitroでの心臓細胞の機能。成功した検定への第一歩は、しかし、新生児マウスの心筋細胞を分離するための簡単​​で信頼性の高い方法論に依存します。我々のプロトコルは、多くのソースから、その方法論を引き出し、再現性と堅牢性のために最適化された。我々は心筋細胞の収率および生存率に影響を与える要因について議論し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供しています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

培養された新生児の心筋細胞は、長いmyofibrillogenesisと筋原線維の機能を研究するために使用されてきた。培養心筋簡単な調査と操作生化学的経路の、そして自然に心筋細胞を破っての生体力学的特性に及ぼす影響を考慮。 次の2日間のプロトコルは、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養について説明します。我々は簡単に、新生児の心臓を解剖心臓組織を解離し、心臓の細胞集団から心筋細胞を豊かにする方法を示しています。我々は、細胞分離のために異なる酵素混合物の使用、および細胞生存性に与える影響を議論。孤立した心筋細胞は、その後、形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的または生体力学的検定のさまざまな目的で使用することができます。私たちは、商業的に利用可能なソリューションを使用することにより、堅牢性と再現性のためのプロトコルを最適化し、酵素がそのSHをミックスOW少しロット間変動。また、心筋細胞の単離および培養に関連する一般的な問題に対処し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供します。

このプロトコルを使用して、我々は（ 図1A、1B、補足映画S1）8一日古い新生仔マウスからの心臓を単離した。洗濯やハサミ（ 図1C-1F）と心をミンチした後、組織片を穏やかに撹拌しながら4℃で一晩分離培地で予め消化された。前消化（ 図1G）に続いて、我々は新たに作製した消化培地に組織片を移して、穏やかに攪拌しながら37℃で20分間の組織片を培養...

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

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Research

JoVE Journal

Biology

62.0K ビュー.  King’s College London. 初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。 

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

生物学

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

マウス心筋細胞の単離と生理解析

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

新生児肝外胆管細胞を単離する

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...