Name: isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2013-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
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私たちは、新生ラットとマウスの心筋細胞の分離技術への導入のための名誉教授ジャン=クロード·PerriardとイヴリンPerriard（テクノロジー、スイスのスイス連邦工科大学）に感謝しています。我々は彼らのサポートのために教授チュ陳教授シルビア·エバンス（UCSD、米国）に感謝したいと思います。 EEの実験室での作業は、MRCキャリア設立助成金によって賄われていた。 SLは、NIH / NHLBI（HL107744）からの独立賞にK99/R00経路によってサポートされています。 TMMは、米国心臓協会（11POST7310066）からのポスドクでサポートされていました。

次の手順では、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養のための2日間のプロトコル16,17について説明します。すべてのソリューションは、無菌または滅菌濾過される。すべてのツールは、75％エタノールで表面殺菌により滅菌されています。初期の組織摘出を除き、全ての工程を無菌層流細胞培養フード内で行っている。このプロトコルは、ワンツーごみ（S）からの新生児マウス心臓を単離するためのものです - 約5から14匹が、より大きなゴミサイズとラット新生児心筋細胞に適合させることができる。必要に応じて、スケールのメディア/酵素の使用量。 新生児げっ歯類での作業のために、立法府および/または動物のケアプログラムで定められた、あなたの地元の大学のガイドラインやルールを参照し、お使いの制度的に承認動物プロトコルに準拠しています。このプロトコルで説明されているすべてのメソッドは、カリフォルニア州立大学サンディ​​エゴ校の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、FEDEに付着されていますRALおよび州の規制。 1日目。 1。新生児マウスからの心臓組織の単離<ol><li> 20 mMのBDM 6-8で補充（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）×PBS中の50ミリリットルを用意し、氷の上に配置された2つの滅菌細菌皿に分散させる。 </li><li> 50ミリリットルの滅菌コニカルファルコンチューブに分離培地10mlを準備します。氷の上のすべてのソリューションを保管してください。 、鉗子（湾曲し、デュモン7号）、はさみ（1ストレート湾曲した1）を殺菌する。 </li><li> 1-3日齢の新生仔マウスは、表面殺菌し、75％エタノール溶液中で速やかにリンスする。子犬は、滅菌ハサミ（ストレート）を使用して断頭し、胸は胸腔へのアクセスと心臓（ 図1A、補足ムービーS1）を可能にするために胸骨に沿って開かれる。 技術的なコメント：3日以上経過した新生マウスを使っていますが、少数の生存細胞2になることがあります。 </li><li>心臓から抽出され湾曲したハサミでボディと氷の上で、20 mMのBDMと（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）1X PBSを含む細菌皿にすぐに移す。以下のすべての工程を無菌細胞培養フード内で行っている。 </li><li> （必要に応じて、心房）肺組織、より大きな血管を削除します。血液を除去するために20 mMのBDM（氷上）と（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）1×PBS溶液中での洗浄の心。転送は、鉗子や穴あきスプーン（ 図1B）を使用して、20 mMのBDM（氷上）と（Ca 2 +や Mg 2 +を含まない）1X PBSを含む第二の細菌皿に一皿から心を洗浄した。 </li><li> （氷上で）第三の細菌皿に、約0.5〜1ミリメートル3、以下（小さ ​​な断片に心をミンチする湾曲したハサミを使って、転送分離培地のドロップに心（ 図1C、約250μl）を洗浄/洗浄; 図1D、1E）。 </li><li>円錐形に刻んだ心を移すチューブは（氷上で）分離培地10mlを含む、一晩4℃で穏やかに攪拌しながらインキュベートする。 </li></ol> 2日目。 2。細胞の酵素組織消化とめっき<ol><li>コラゲナーゼ/ディスパーゼ混合物（Roche）を15mgのを計量し、20 mMのBDM（消化培地）を補充した10ミリリットルL15-媒体5に酵素ミックスを溶かす。無菌フィルター新しい滅菌50ミリリットルファルコンチューブに細胞培養フード内消化培地。 </li><li> 20 mMのBDMを補足した30ミリリットルのL-15培地を調製し、培地をメッキする。 </li><li> 1時間の最小のコラーゲン溶液（Sigma C-8919）で被覆細胞培養プレート。無菌層流細胞培養フード内でコラーゲン溶液（再利用することができます）と乾燥コラーゲンコーティングした細胞培養皿を取り外します。 </li><li> 4℃から前消化心を含む円錐管を削除組織片（ 図1G）に集約する必要があります。組織片はに沈むましょうチューブの底部と（いずれの組織片を失うことはないことを確認してください。通常、分離培地の約1ミリリットルは、チューブ内に残っている場合があります）、上清を除去します。消化培地5mlで1分間、酸素または空気を用いて組織フラグメントおよび含酸素化合物の懸濁液に20mMのBDMを補充したL-15を5ml加える。 </li><li>消化溶液の温度を調整するために約2分間37℃の水浴に消化培地中に心臓組織断片を含有する密封された円錐管に移す。 </li><li> 20〜30分（60RPM超えないように設定して37℃、で例えばシェーカー）穏やかに撹拌しながら37℃で心臓組織片をインキュベートする。消化時間が大幅に酵素混合物、ロット番号に依存し得る注意：インキュベーション時間を長く又はより高い酵素濃度は、細胞生存率を減少させることができる。 </li></ol> 技術的なコメント：102696：我々は（カタログ番号ロシュからコラゲナーゼ/ディスパーゼ混合物の使用をお勧めします38001）非常に少ないロット間のばらつきを有している。マウス心筋細胞の単離のための古典的な酵素は、トリプシンおよび/ ​​またはワージントン（カタログ番号CLS-2）から利用可能なコラゲナーゼII型3,16-20です。しかし、コラゲナーゼIIの性能は、ロット間で大きく異なる可能性があります。ワーシントンは、一般的に消化時間を最適化し、使用量を酵素には、いくつかのコラゲナーゼロットのテストが可能になります。あるいは、ワージントンは、予め試験した酵素混合物を用いて心筋細胞単離キットを販売することは、マウス心筋細胞の単離17（：NCISカタログ番号）に適合させることができる含まれる。 <ol start="7"><li>新しい滅菌50mlコニカルファルコンチューブに無菌細胞ストレーナー（40〜100ミクロンのナイロンメッシュ）を配置します。 20 mMのBDMを補足した5ミリリットルのL-15で予め湿らセルストレーナー。約10〜20回予め湿らせた10ミリリットルの細胞培養ピペットを用いて穏やかに磨砕組織断片。組織片は、ほとんどサスペンシオに細胞を放出し、このステップの間に分散​​させる必要がありますN（ 図1H）。 </li><li>より大きな組織片が沈降しましょおよび細胞ストレーナー（ 図1I）を介して新鮮なコニカルチューブに懸濁した細胞を含む上清を移す。 </li><li> 5ミリリットルの消化培地中で未消化の組織片を再することは、一時停止し、穏やかに攪拌しながら37℃でさらに5〜10分間インキュベートする。 </li><li>残りの組織片の継続的な消化した後、ゆっくりと10〜20倍のための組織を粉末化し、最初のセルストレーナーを通して消化物からの円錐管を含む細胞に加える。すべての消化細胞の通過を可能にするために20 mMのBDMを補足した5ミリリットルのL-15で細胞ストレーナーを洗浄します。 </li><li> 300回転（約50〜100×g）で5分間中断した心筋細胞を含む遠心分離コニカルチューブ。 （主に線維芽細胞および内皮細胞を含む）上清を除去し、培地をめっきする10ミリリットル中に再懸濁細胞ペレット。 </li><li>板細胞を10cmの細胞培養皿（ 図2A）へと1インキュベート細胞培養インキュベーター中で-3時間。このプレめっき工程は、コーティングされていない細胞培養皿（ 図2C）に付着した線維芽細胞及び内皮細胞（ 図2B）を除去する。 </li><li>インキュベーション後、転送再懸濁した細胞を無菌の円錐形のFalcon遠心分離管（15 mlまたは50ml）中に（繰り返し皿上にプレーティング培地をピペッティングして再懸濁細胞）を10cm培養皿から非付着性心筋細胞を洗浄し、そして。 オプション：細胞懸濁液から、追加の線維芽細胞を除去するためのめっき前の手順を繰り返します。所望であれば、接着性線維芽細胞および内皮細胞をさらに培養することができる。 </li><li> （ノイバウエル血球計数器、パンブルー排除染色21を使用することによって）細胞を数える。 </li><li> 1cm 2当たり約1.5×10 5細胞（ 図2Dの密度を有する、コラーゲンコートした細胞培養皿にプレート細胞;関連項目メッキの表1のコメントおよびコーティング）。 細胞培養インキュベーターに料理を置き、付着および心筋細胞の拡散を可能にするために12から18時間静置しておきます。 </li></ol> 3日目 - 新生児心筋細胞の培養<ol><li> 37℃の水浴中で維持培地と予熱して調製する。新生児マウスの心筋細胞のリポソームトランスフェクションのための増殖阻害剤または変剤の添加、あるいは手続きについては、表1を参照してください。 </li><li>ある日、めっき後に、心筋細胞は、細胞培養皿に接着し、最適縮小する自然発生的に開始している必要があります（ 図2E、2Fを 、 補足作品S2;分離/培養手順の間に一般的な問題については表2を参照してください）。追加の1-5日間、維持培地、および文化にメッキ培地を交換してください。必要に応じてメディアを変更します。 </li></ol>

心疾患を研究するための動物モデルを使用することは、心臓血管研究の標準となっている。クローサー（ すなわち 、生化学的または生体力学的刺激に心臓細胞の直接の反応を研究する）これらのモデルの生化学的特徴は、一般的に、心臓組織または心筋細胞の単離を必要とする。心の生理学的反応を調査した研究は、生体外 （ 例えば 40をアセチルコリンに対す?...

げっ歯類の心臓細胞の正常な解離と文化のための最も初期の報告は、1960年の1,2にさかのぼります。それでも、ハラリィとファーリーは培養心筋細胞は「定期収縮の要件の研究のためのユニークなシステムを提供することができ、[、とあり] [鼓動]プロセスのための様々な代謝経路の寄与を決定する手段を提供する」ことに気づいた。幼若ラット、元のプロトコルからハラリィとファーリー単離し、培養心筋細胞は、長年にわたって適応し、多くの科学者によって変更されているが、一般的な単離·培養手順が大幅に変更されていません。しかし、より良い酵素3、標準化されたソリューションを4,5、および単離手順6-9の間に細胞を保護する可逆チャンネルとミオシンATPアーゼ阻害剤BDMの添加は、細胞収量及び生存率を改善した。 新生児cardiomyo対アダルトcytes 新生児マウスまたはラットから単離し、培養心筋細胞は、成人の心筋細胞の培養液に比べていくつかの利点がある。成体マウスまたはラット10から心筋細胞の単離と比較した場合、まず、新生仔マウスまたはラットの心臓の分離手順は、簡単かつ低コストである。新生児心筋細胞が大幅に細胞収量を増加させる、解離後のカルシウム含有培地中に再導入するためにはるかに敏感である。大人の心筋細胞は、通常、収縮を誘発するためにペーシングが必要ですが、一般的に、めっき後自発的に拍動細胞では20時間後に、その結​​果、再分化サイクル - もう一つの大きな利点は、新生児マウスの心筋細胞は、より迅速な脱分化を受けることである。新生児の心筋細胞は、成人の心筋細胞は、トランスジェニックDNAの正常な配信のためのウイルスベクターを必要とするのに対して、より容易に、リポソームトランスフェクション法でトランスフェでもある。新生児心筋細胞とは対照的にS、成人の齧歯類心筋細胞11〜13の文化は、筋原線維の劣化と収縮装置の最終的な再構築の検討が可能になります。成人の心筋細胞におけるこれらの特徴的な形態変化は、1〜2週間の期間にわたって発生する。脱分化-再分化サイクルは、それによって人間の心筋症14で観察された病理学的変化を模倣し、胎児の遺伝子プログラムの再発現を伴う。新生児の心筋細胞を培養上の大人のラットの心筋細胞のもう一つの利点は、長期間培養することができることは、これらの細胞である。 マウスの心筋細胞対ラット ラット新生児心筋細胞の単離および培養は、生細胞のより高い収量の増加、トランスフェクション率を含むマウス新​​生児の心筋細胞のそれ以上のいくつかの利点があります。しかし、心疾患のため、遺伝子組み換えマウスモデルの幅広い使用方法（ 例えば、&lt;/ em&gt;は拡張型心筋症15のモデルとして筋肉LIMタンパク質ノックアウトマウス）は、新生児マウス由来の心筋細胞の分離手順の適応につながっている。新生ラットとマウスの心筋細胞を分離するために使用されるプロトコルは、ほとんど同じですが、より大きな注意が、後者のための適切な酵素ミックスの選択に注意する必要があります。実際、新生児マウスの心筋細胞は、減少した細胞収量および生存度で、その結果、一般的には過剰消化を受けやすい。新生仔マウス由来の心筋細胞が新生児ラット心臓由来の細胞と比較してやや小さいのでさらに、播種密度は、調整されるべきである。 形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的および生体力学的パラメータだけでなく、myofibrillogenesisのプロセスのための調査のための多くの用途で、培養された新生児心筋細胞の研究のための最も汎用的なシステムの一つとなっているin vitroでの心臓細胞の機能。成功した検定への第一歩は、しかし、新生児マウスの心筋細胞を分離するための簡単​​で信頼性の高い方法論に依存します。我々のプロトコルは、多くのソースから、その方法論を引き出し、再現性と堅牢性のために最適化された。我々は心筋細胞の収率および生存率に影響を与える要因について議論し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供しています。

<table><tbody><tr><td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) &lt;sup&gt;6-8&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma</td><td>B-0753</td><td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;), filter sterilize, can be kept at 4 &amp;#176;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture&lt;sup&gt;46,47&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td></tr><tr><td>Collagenase type II&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;</td><td>Worthington</td><td>CLS-2</td><td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td></tr><tr><td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td><td>cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td><td>cellgro</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>e,g, cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hank&amp;#8217;s balanced salt solution; without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;) &lt;sup&gt;4&lt;/sup&gt;</td><td>cellgro</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM high glucose</td><td>cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>M-199</td><td>cellgro</td><td>10-060-CV</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>cellgro</td><td>35-011-CV</td><td>cell-culture grade</td></tr><tr><td>horse serum</td><td>cellgro</td><td>35-030-CV</td><td>cell-culture grade</td></tr><tr><td>Leibovitz L-15&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;</td><td>cellgro</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td><td>Sigma</td><td>C-6645</td><td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, filter sterilize, store at 4 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>phenylephrine</td><td>Sigma</td><td>P-6126</td><td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, filter sterilize, store at 4 &amp;#176;C or -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>isoproterenol hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>I-6501</td><td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, filter sterilize, store at 4 &amp;#176;C or -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>0.1% collagen solution</td><td>Sigma</td><td>C-8919</td><td>extracellular matrix for coating</td></tr><tr><td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005-B</td><td>alternative to Sigma collagen solution</td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>appropriate filter size:40 &amp;#956;m-100 &amp;#956;m</td></tr><tr><td>syringe filter 0.2 &amp;#956;m</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>for sterile filtration of digestion medium</td></tr><tr><td>straight scissors</td><td>Fine Sciences Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>curved scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 7 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>perforated spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-19</td><td>optional, for transfer of heart tissue</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>live cell staining</td></tr><tr><td>Neubauer hemocytometer</td><td>Prosource Scientific</td><td>3500</td><td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>14-432-23</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Falcon tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>20 ml syringe</td><td>BD Medical</td><td>14-820-19</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serological pipette</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>30 mm cell culture dish</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>for standard culture of cardiomyocytes</td></tr><tr><td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>for live cell imaging with inverted microscope</td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Nunc</td><td>172958</td><td>for preplating</td></tr><tr><td>Escort III</td><td>Sigma</td><td>L3037</td><td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>52887</td><td>substitute for Escort III</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Buffers and media: &lt;/strong&gt; &lt;ul&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Isolation medium (filter sterilize)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 20 mM BDM&lt;br/&gt; 0.0125% trypsin&lt;br/&gt; in HBSS&lt;sup&gt;4&lt;/sup&gt; (without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Digestion medium (filter sterilize)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 20 mM BDM&lt;br/&gt; 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix&lt;br/&gt; in L15 medium&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Plating medium&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 65% DMEM high glucose&lt;br/&gt; 19% M-199&lt;br/&gt; 10% horse serum&lt;br/&gt; 5% fetal calf serum&lt;br/&gt; 1% penicillin/streptomycin&lt;/li&gt; &lt;li&gt;&lt;strong&gt;Maintenance medium&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt; 78% DMEM high glucose&lt;br/&gt; 17% M-199&lt;br/&gt; 4% horse serum&lt;br/&gt; 1% penicillin/streptomycin&lt;br/&gt; &lt;em&gt;optional:&lt;/em&gt;&lt;br/&gt; 1 &amp;#956;M AraC&lt;br/&gt; 1 &amp;#956;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; The plating and maintenance medium can be stored at 4 &amp;#176;C for up to 6 months.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

培養された新生児の心筋細胞は、長いmyofibrillogenesisと筋原線維の機能を研究するために使用されてきた。培養心筋簡単な調査と操作生化学的経路の、そして自然に心筋細胞を破っての生体力学的特性に及ぼす影響を考慮。 次の2日間のプロトコルは、新生児マウスの心筋細胞の単離および培養について説明します。我々は簡単に、新生児の心臓を解剖心臓組織を解離し、心臓の細胞集団から心筋細胞を豊かにする方法を示しています。我々は、細胞分離のために異なる酵素混合物の使用、および細胞生存性に与える影響を議論。孤立した心筋細胞は、その後、形態的、電気生理学的、生化学的、細胞生物学的または生体力学的検定のさまざまな目的で使用することができます。私たちは、商業的に利用可能なソリューションを使用することにより、堅牢性と再現性のためのプロトコルを最適化し、酵素がそのSHをミックスOW少しロット間変動。また、心筋細胞の単離および培養に関連する一般的な問題に対処し、単離および培養条件の最適化のためのさまざまなオプションを提供します。

このプロトコルを使用して、我々は（ 図1A、1B、補足映画S1）8一日古い新生仔マウスからの心臓を単離した。洗濯やハサミ（ 図1C-1F）と心をミンチした後、組織片を穏やかに撹拌しながら4℃で一晩分離培地で予め消化された。前消化（ 図1G）に続いて、我々は新たに作製した消化培地に組織片を移して、穏やかに攪拌しながら37℃で20分間の組織片を培養...

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

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Research

JoVE Journal

Biology

62.5K ビュー.  King’s College London. 初代マウス心筋細胞培養は、筋原線維組織や機能の調査のための極めて重要なツールの一つである。以下のプロトコルは、新生児マウスの心臓から初代心筋細胞の単離および培養について説明します。得られた心筋細胞培養物は、続いて、生体力学的、生化学的および細胞生物学の種々のアッセイに使用することができる。 

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Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

新生児ラット心筋細胞の単離と凍結保存

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

発生生物学

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

生物学

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

神経科学

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

医学

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...