この作品は、国立心肺血液研究所助成HL-36573によってサポートされていました。我々は、この原稿を編集するためのデービッド·ゾーヴァに感謝します。

マウス上のすべての研究は手順や国立衛生研究所のガイドラインに従って行われていた、およびプロトコルは、トレド大学の制度的動物実験委員会、医学、生命科学大学によって承認された。 1。灌流システム準備<ol><li>アイソ前日、速いアルカリ残留物のない洗剤の溶液で（貯水池を含む）全体の灌流系を埋める。ソリューションは、数時間または一晩のためにシステムに浸透することができます。 </li><li>翌朝、37℃のサーモサイクラーの温度を調整し、溶液を温めることができます。洗剤溶液を除去し、滅菌蒸留水で十分にシステムをフラッシュします。すべての側枝を忘れないでください。 </li><li>一定の蠕動ポンプを介して灌流液を使用してシステムを記入し、保護するためにサイドマウント注射器で大動脈室（気泡トラップ）から泡の空気を描く冠動脈閉塞の心。蠕動ポンプの流量は、日常的にチェックする必要があります。 </li></ol> 2。バッファの調製、培養培地、食器<ol><li>灌流バッファー：使用前に1X潅流液の500ミリリットルを加えます。このカルシウムを含まないバッファーは113のNaCl、4.7のKCl、0.6mMのKH 2 PO 4、0.6のNa 2 HPO 4、1.2のMgSO 4、10のNa-HEPES、12mMの炭酸水素ナトリウム、10 mMのKHCO 3、0.032が含まれています10mMのフェノールレッド、30mMのタウリン、10mMのBDM、および5.5 mMグルコース。 2 M HClでpHを7.0に調整し、0.2μmのフィルターで濾過し、4℃で保存 注：a）は、灌流溶液は、それが使用されるのと同じ日に調製されるべきである。いくつかの場合においては、4℃で3日未満用溶液を保存するために許容可能であるB）このバッファは休止心筋細胞を維持することができます15.3 mmまでの高カリウム濃度の上昇を持って、ATP Cを減らすonsumptionおよびCa 2 +トレラント能力を高める。 </li><li>消化緩衝液（300 U / mlの25〜50ミリリットル/ハート）：直前に灌流する準備をします。 II型コラゲナーゼの総活性の15,000 Uを量り、培養フード内の50ミリリットルの灌流液に溶解する。最終的なカルシウム濃度は50μMを作るために100のCaCl 2（原液を、濾過滅菌）の25を添加する。分離のための準備ができて37℃にバッファを温めます。トリプシンとは異なり、コラゲナーゼは、50〜100μMのCa 2 +の存在下で最適に動作します。 </li><li>停止緩衝液（50ミリリットル/ハート）：培養フードで動作します。 5ミリリットルの滅菌FBSを灌流液の45ミリリットルを混ぜる。 <ol><li>私（12.5μMのCa 2 +）のCa 2 +ソリューション：停止緩衝液20mlに100 mMのCaCl 2を 2.5μLを加え、混合する。 </li><li> Ca 2 +の溶液II（100μMのCa 2 +）：ストップ緩衝液10mlに100のCaCl 210μlのを追加して混合する。 </li><li> Ca 2 +のソリューションIII（400μMのCa 2 +）：ストップ緩衝液10mlに100のCaCl 2の40μl加え、混合する。 </li><li> Ca 2 +のソリューションIV（900μMのCa 2 +）：ストップ緩衝液10mlに100のCaCl 2の90μl加え、混合する。 </li></ol></li><li> （50ミリリットル/ハート）培地をメッキ：BDM原液の転送培養フード中の滅菌50 mlのコニカルチューブに2 mMのL-グルタミンおよび1.26のCaCl 2を含むMEMの43ミリリットルとFBSの5ミリリットルを加え、1ミリリットルを（ 500 mMの、フィルター滅菌した）、および0.5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン（10,000 U / ml）を加えた。混合し、2％のCO 2、緩いキャップを37℃のインキュベーターに先立って、筋細胞の単離に2〜3時間平衡化させます。右筋メッキの前に、培地中に200 mMのATPの0.5ミリリットル（pHは7.2、原液を、滅菌フィルタ）を追加します。 </li><li>培養液（50ミリリットル/ハート）：転送培養フード中の滅菌50 mlのコニカルチューブに2 mMのL-グルタミンおよび1.26のCaCl 2を含むMEMの48ミリリットルとBDM原液（500 mMの、filteの1ミリリットルを追加r）を滅菌し、0.5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン（10,000 U / ml）を加えた。混合し、2％のCO 2、37℃インキュベーター前筋細胞の単離には平衡化させます。使用前に、培地中に100 mg / mlのBSA（濾過滅菌）の0.5ミリリットルを追加。 注 ：2％CO 2インキュベーターを使用するmyoctyesは24時間までそれらの棒状の形態を維持するのに役立つ6.9〜7.0で培養培地のpHを維持することが容易になる。 </li><li>ラミニン（1〜2μgの/ cm 2）をコーティングしたディッシュまたはプレート：転送1 mg / mlの自然なマウスラミニン200μlの滅菌PBSを20ミリリットルの（W / O、カルシウム、マグネシウム）と混ぜる。 、100 mmの皿に35-mmディッシュ、60mmの皿に2.5ミリリットル、または5ミリリットルに1ミリリットルを追加均等に表面を覆うように振る、と場所のCO 2 2％、37℃のインキュベーター筋メッキ時まで。 注：皿又はプレートをコーティングした日に使用されていない場合は、パラフィルムで密封し、4℃で一晩（スローコーティング）で保存することができる。シールのrequです蒸発や汚染を防止するために赤外発光ダイオード。コー​​ティングされたプレートを、1週間まで4℃で保持することができる。 </li></ol> 3。マウスハートの取り外しおよびカニューレ挿入<ol><li> 30分間、70％エタノールではさみや鉗子を浸し、それらを乾燥させます。 </li><li>最寄りの0.1グラムにマウスを量る。その体重、系統、性別、生年月日を記録します。 </li><li> 200μlのヘパリン（100 IU /マウス）冠状動脈の血液の凝固を防ぐために、従来の腹腔内麻酔を10分間注入する。 200ケタミンのmg / kg体重と腹腔内注射によるキシラジンの10 mg / kg体重でマウスを麻酔し、マウスは尾/つま先ピンチに応答を停止するまで、5〜10分間待ちます。 </li><li>優しく灌流システムに近い動物の手術トレーやテーブルベンチにpinnable作業面（ すなわち発泡スチロール）に前足と後足を固定して仰臥位でマウスを固定します。 </li><li> 70％エタノールで胸と腹部を拭きます。正中皮Iを作る外科はさみで横隔膜半ば腹部からncision。 </li><li>別の外科はさみで横隔膜をカットし、湾曲した鋸歯状の鉗子で胸骨を保持します。両側性に切断して心臓を露出させ胸郭をretroflect。 </li><li>少し細かい曲線状の鋸歯状と非外傷性鉗子を用いて心臓を持ち上げて、背側胸壁にできるだけ近い胸腔から心を解剖。 </li><li>冷たい灌流バッファーを含む100 mmの皿に心を移します。慎重に、肺、胸腺、および気管支などの結合組織を切り取る。 </li><li>通常、胸腺および脂肪パッドによって隠されている大動脈とその頭蓋枝を識別します。心を持ち上げ、大動脈壁をつかみ、その最初の分岐13の下に大動脈を切断し、少し灌流液で満たされた大動脈カニューレ（フラット/鈍先端とノッチ1及び上記2ミリメートルと1.0ミリメートル外径のステンレス鋼カニューレにそれをスリップ2超精密チップFを使用するか、22 G、再利用可能な給餌針）の先端orceps。 注：a）は、灌流液が冠状動脈に入るの気泡を防止するために、心臓の空洞中に滴下されるべきである; B）だけで大動脈弁の上にカニューレの先端を保管してください。 </li><li>カニューレに大動脈をクランプし、6-0、手術絹糸でカニューレに大動脈を結紮。全体挿管未満120秒を取る必要があります。 </li></ol> 4。心灌流し、消化<ol><li> 、流出液が透明になるまで、50μMCaCl 2を含む消化緩衝液に切り替え、マウス系統に依存して3.5から20分間灌流4mL /分、約4-5分の流速で、カルシウムを含まない灌流緩衝液で心臓を灌流灌流圧とコラゲナーゼ活性。該当する場合は、消化する際、70〜80 mmHgのに大動脈圧力を高める。必要に応じて、酵素消化のために灌流液が再循環させることができる。典型的には、300 U / mlの酵素緩衝液を4ml /分の流速で10〜12分間で心を消化する;70 mmHgの圧力で後負荷を印加した場合、300 U / mlのを4ml /分の流速でのみ3.5-5.5分かかります。 </li><li>心が少し薄いと弛緩性になったときに消化を停止します。優しく挟まれたときには、スポンジ状にする必要があります。 </li></ol> 5。細胞解離とカルシウムの再導入<ol><li> 70％エタノールに浸漬した鉗子を用いてカニューレから大動​​脈を引き、2.5ミリリットル消化緩衝液を含む滅菌60 mmの皿に心を置く。このための滅菌技術とフォローアップの手順に留意滞在し、滅菌した消耗品を使用して培養フードに移動します。 </li><li>細かい外科ハサミで大動脈、心房、および大血管を削除します。優しく2先の細いピンセットで10月12日小さな断片に心室をいじめる。 </li><li>静かに10mlのホールピペットで10倍〜上下に心片や細胞をピペットして、15 mlのポリプロピレン製コニカルチューブに移す。私は12.5μMのCaCl 2、転送を7.5ミリリットル含むカルシウム溶液で、皿をすすぐこのチューブに、10mlの最終体積になる。 </li><li>穏やかに上昇し、心臓組織の大きな断片を分散させるために先の細いトランスファーピペットを用いて上下細胞懸濁液をピペット。 </li><li>そして、このような内皮細胞や線維芽細胞などの小さな非筋細胞を分離する20×gで3分間遠心する。 </li><li> 200のATP（pHは7.2、原液を、濾過滅菌）を100μlのサプリメントを吸引し、上清を切り、10ミリリットルカルシウム溶液に筋細胞ペレットを再懸濁し、私は。 3〜5分間フード内チューブを残す。 </li><li>転送は、棒状の丸い筋細胞をカウントする血球計に10μLずつを複製します。筋細胞の合計数を計算し、棒状の筋細胞のパーセンテージを計算する。 </li><li> 20×gで3分間の筋細胞を遠心分離する。上清を除去し、100μMのCaCl 2を含む10ミリリットルカルシウム溶液IIにペレットを懸濁します。ピペッティングして精密チップ転送ピペットで筋細胞を分散させる上下に。 </li><li>それぞれ、カルシウム溶液III（400μMの塩化カルシウム）およびIV（900μMのCaCl 2）を使用して、上記のステップ（5.8）を繰り返します。 </li><li>マウスの筋細胞初代培養用の培地をメッキ5mlに最終的な筋細胞ペレットを再懸濁します。筋細胞の総数をカウントし、棒状の筋細胞の割合を計算します。 </li></ol> 6。細胞培養<ol><li> 50 mlチューブ25,000棒状筋細胞/ mlになるように、棒状筋細胞の濃度を調整する。優しくそれらをよく中断し、10 mlのピ​​ペットを用いて心筋細胞をピペット。各皿またはプレートのための同等の細胞密度を確保するために、ピペット、チューブに細胞沈降を避ける。 </li><li>ラミニンコーティング液を吸引除去した後、それらの皿またはプレートに筋細胞をプレート。そっと培養フードの表面に皿またはプレートを前後や左右に十字状のパターンでの3〜4倍にスライドさせます。 </li><li> 2％のCO中皿またはプレートを配置37℃で2インキュベーター約80％の割合で筋細胞の付着を可能にするために1-3時間インキュベートする。 </li><li>付着した後、穏やかに取り付けられていない筋細胞および細胞破片を含有する培地を吸引する。静かに皿またはプレートの側面に培養液を追加します。 1で、この培地交換のいずれかを実行します。すぐにインキュベーターに皿またはプレートを返す。 </li><li> O / N培養した後、筋細胞は、短期細胞シグナル伝達の研究の前に、BDMない同じ培地に変更することができる。肥厚性またはアポトーシスアッセイのために、長期培養でBDMを保つ。 注 ：BDM（2,3 -ブタンジオンモノオキシム）は、ミオシンATPアーゼを阻害し、収縮を防止することができる。ミオシンベースの収縮の阻害は容易に可逆的である。なお、BDMは、例えば、非特異的ホスファターゼとして作用SRからのカルシウム放出を増加させること、および遊離カルシウム濃度および細胞の電気プロペンの変化など、いくつかの潜在的な副作用を有し得ることが報告されているrtiesので、治療の前に、BDMを削除する必要があります。また、場合によっては、特定のミオシンII阻害ブレビスタチンは心筋細胞の収縮8,9を阻害するための代替薬である可能性があります。しかし、私たちの例では、BDMは心筋細胞の質と量のためブレビスタチンよりも優れています。 </li></ol>

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	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. 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F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

最高の準備のために、最も重要なステップは次のとおりです。1）速やかに切除した後にカニューレにマウス心臓をフック。 2）適切な心臓灌流。また、その水質、潅流温度、緩衝液のpH、滅菌、化学的純度、クリーン、非汚染されたチューブに注意し、室内も重要な要素である。 18.2mΩの分子生物学グレードのH 2 Oが非常にバッファの準備をお勧めします。 200のATP原液のpHは7.2、見逃しやすいステッ?...

心筋細胞は、増殖性ではありません。 HL-1およびマウス心房腫瘍由来AT-1細胞のようないくつかの心房心筋細胞系があり、;しかし、研究のために利用可能な大人の心室の心筋細胞株は存在しない。成体マウスの心筋細胞の初代細胞培養は、細胞および分子レベルでの心臓研究のための強力なモデルを提供する。今日まで、これらは生化学的、生理学的、および薬理学的研究1のために広く使用されてきた。さらに、遺伝子改変マウスを頻繁に使用すると、心筋細胞の単離の効果的な方法を必要としている。純粋培養では、内因性神経ホルモンやホルモン様因子2,3を介するなどの他の臓器や体循環との相互作用から自由な条件を可能にします。しかし、心筋細胞の正常な絶縁が困難な場合があります。 我々はここに紹介するプロトコルは、成体ラットcardiomyocytと私たちの経験に基づいていますESとオコンネルら 4,5に記載されている方法。特に2007 5は、それらは、細胞培養および機能アッセイ緩衝液製剤からの詳細な技術を説明した。マウス筋細胞がラットの心筋細胞に比べて拘縮を非常に受けやすいので、マウスプロトコルでの灌流、消化、Ca 2 +の寛容、メッキ、培養に用いるバッファまたはメディアは、非特異的な興奮収縮連関阻害剤、2を補足している彼らの自発収縮を阻害する3 - ブタンジオンモノオキシム（BDM）は、したがって生存棒状筋細胞の収量が有意に改善する。ここで紹介するプロトコルでは、筋細胞はII型コラゲナーゼを有する改変ランゲンドルフ灌流によって単離心臓から高カリウムバッファーで分離される。コラゲナーゼIIは、効果的に細胞間マトリックスを解放細胞を分解します。灌流液は、低レベル6で、細胞の代謝を維持します。 additi中で、ここで使用されるハーバード装置から分離した心臓システムは、正確な温度と一定の圧力制御7用にうまく設計されている。このアプローチは、非常に再現性製剤および心臓肥大アッセイのためのシグナル伝達タンパク質または2-3日培養を測定するための一晩培養に使用することができる単一の細胞型の均一な集団を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="774">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:257px;">Isolated heart system for small rodent</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">IHSR-mouse 73-4019</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td>
			<td style="width:131px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:99px;">73-2816</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Dumont #4 Forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11294-00</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight sharp serrated scissors</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">14070-12</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11050-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Curved, serrated Graefe forceps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">11052-10</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Straight Mini Serrefines clamps</td>
			<td style="width:131px;">Fine science tools</td>
			<td style="width:99px;">18054-28</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">MEM</td>
			<td style="width:131px;">Gibco</td>
			<td style="width:99px;">11575-032</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:257px;">Collagenase II</td>
			<td style="width:131px;">Worthington</td>
			<td style="width:99px;">4176</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mucosal universal detergent</td>
			<td style="width:131px;">Sigma</td>
			<td style="width:99px;">Z637181</td>
			<td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

技術の進歩は、遺伝子導入および遺伝子ノックアウトマウスは、多くの研究分野において不可欠なツールを含む、遺伝子改変マウスを作った。大人の心筋細胞は広く、心臓細胞生理学や病態生理のためだけでなく、薬学的介入のための良いモデルとして受け入れられています。遺伝子改変マウスは、心筋細胞 &#39;最終分化に非効率的で必要な遺伝子型を生成するために、複雑な心筋細胞の感染プロセスの必要性を排除する。高量と質の機能的心筋細胞の単離および培養は劇的に循環器病研究の利益と細胞シグナル伝達研究や薬剤開発のための重要なツールを提供します。ここでは、少しのトレーニングを実施することができる成体マウス心筋細胞の単離のための十分に確立された方法を記載する。マウスの心臓を摘出し、孤立した心臓のシステムにカニューレを挿入し、その後、カルシウムを含まない、高Pで灌流otassiumバッファは、ランゲンドルフ逆行灌流モードでのII型コラゲナーゼ消化した。このプロトコルは、遺伝子改変マウスの様々から機能成体マウスの心筋細胞の収集のための一貫性のある結果が得られます。

1。成功絶縁定量二つの基準は、分離の成功を定量するために使用されている：第一に、単離され、そして第二の心筋細胞の総数は、ロッド状のカルシウム耐性の割合は非耐性筋細胞を丸める。一般的に、このプロトコルは、1成体マウスの心臓から心筋細胞メッキや利回りに心臓の除去から（収穫総筋細胞70〜90％）の約100万棒状の心筋細胞の周りに75〜90分かかります。こ?...

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Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

我々は、成体マウス心筋細胞の単離のための信頼できる方法を記載している。このプロトコルは、遺伝子改変マウスの様々から機能大人の心筋細胞の培養のための一貫性のある結果が得られます。

細胞シグナリングのための成体マウスの心筋細胞の単離と文化<em&gt; in vitroで</em&gt;心肥大

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.3K ビュー.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences. 我々は、成体マウス心筋細胞の単離のための信頼できる方法を記載している。このプロトコルは、遺伝子改変マウスの様々から機能大人の心筋細胞の培養のための一貫性のある結果が得られます。 

ビデオ: Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

生物学

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

マウス心筋細胞の単離と生理解析

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...