生物小角度X射线散射提供大分子和大分子复合物的结构测量。理想情况下，要测量的样品应是单分散的。尽管在某些情况下，大小排除色谱 SAXS 不足以产生单分散性，但可以执行基于软件的 SAXS 数据去卷积，以生成理想化的 SAXS 曲线。
按照此协议，一个去卷积程序和用户友好的散射程序可用于分析瓦奇尼亚病毒DNA聚合酶外敏突变体。要对大小排除色谱数据执行背景减法，请打开基于 Java 的 Scatter 4 程序并打开 SEC 选项卡。将缩减的数据文件拖到窗口下方的放置数据中，然后单击输出目录按钮并打开以设置将在其中保存数据的输出目录。
在"保存为保存"框中输入示例名称，然后单击"跟踪"。单击"编辑详细信息"按钮编辑实验详细信息并填写相应的字段。要手动选择缓冲区帧，请单击设置缓冲区。
左键单击并拖动以重新选择缓冲区作为曲线曲线上的平面，然后大小排除色谱列的空隙卷约为 100 帧，然后单击设置缓冲区并更新以重新计算 SEC 文件。左键单击并拖动以选择信号图上感兴趣的区域，左键单击并拖动热图图中的交叉毛，以选择将用于合并的帧的缩放和子集。用另一个左键单击，突出显示热图中与交叉毛的右下角区域对应的框架。
理想情况下，框架应突出显示以青色为主且旋转半径稳定的区域。当对所选帧感到满意时，单击合并以合并减去的帧，然后单击分析选项卡以查看数据。要取消数据卷积，请将数据集加载到去卷积程序中。
在文件下的控制面板中，使用文件夹符号查找数据并突出显示所有 DAT 文件。将在序列图中绘制集成强度与帧数的绘图。在"系列"选项卡下，单击以突出显示曲线并打开 LC 分析弹出窗口。
要选择合适的缓冲区域，请单击"添加区域"以选择色谱峰前的区域和溶剂前面之后的区域，然后单击设置缓冲区。弹出窗口将指示尚未为背景选择框架。要启动 EFA，请右键单击突出显示的文件，然后从菜单中选择 EFA。
在弹出窗口中，应观察数据集的单个值分解。在"控制"框中，选中使用帧框值，以确认强度图中覆盖了要去旋转的整个峰值区域。单数值图将显示基线上方的单数值的强度。
如果左向量和右向量不匹配，请将显著的单数矢量更改为 2，然后移动帧，直到左右单数矢量相似。将计算 EFA，在每个矢量向前和向后方向生成绘图，并指示组件何时开始和退出所选大小排除色谱 SAXS 数据的解剖面。RAW 将尝试标识范围。
如有必要，使用箭头更改范围，以便每个圆都是拐点的起点，从基线上升或下降，然后单击下一步。要减少或消除峰值，请使用范围控制箭头确定与峰值对应的大约帧，以调整组件范围控件。达到最小 Chi 平方后，单击"返回"以执行验证检查。
如果原始 EFA 绘图看起来仍然有效，请单击"下一步"并保存 EFA 数据以保存绘图。然后单击"完成"以关闭 EFA 窗口。然后在 RAW 窗口中，打开绘图面板中的轮廓以查看曲线。
在控制面板的配置文件选项卡中，右键单击以将曲线另存为 DAT 文件。对于 SAXS 测定，请打开散点分析选项卡并选择 G 以选择手动 Guinier 分析工具。在绘图中，添加或删除点，使残差没有微笑或皱眉特征。
Guinier 拟合中的选定数据不应超过最大队列乘以 1.3 的回流极限半径。单击规范化的克拉特基。生成的图提供了大分子、球状、圆柱形、无序、质量和浓度的优化结构状态的评估。
单击相关体积。总散射强度和总散射强度的集成面积作为Q图的函数，将成为验证散射曲线质量的快速参考。要开始灵活性分析，请单击灵活性。
弹出窗口中的每个面板将显示一个图，利用紧凑和拉长的柔性生物聚合物之间存在的权力法关系。使用框底部的滑块更改数据视图，直到到达其中一个绘图中的稳定。执行灵活性分析后，立即单击"音量"。
将生成三个图形的弹出窗口。Porod-Debye 绘图跟踪柔韧性图中的滑块的左侧位置，并显示稳定区域数据。要计算粒子的体积，请移动起点和终点，直到绘图上的蓝线适合稳定区域。
对于一个公正的结果，波罗德-德拜指数权力定律中的残差不应显示任何模式。在 R 形 P 选项卡下，可以观察到样品的实际空间分布和散射曲线。理想情况下，分布曲线应平滑且无波，并且应轻轻触摸 x 轴。
右键单击示例名称，然后单击"查找 DMAX"以打开新窗口。最大维度的限制是预设的，包括建议的最大 Q 范围、用于计算的最大数据点、最大尺寸限制的下限和上限以及下半尺寸限值和下半阿尔法分数。单击"开始"。
将创建复合分布以及建议的最大维度和 Alpha 级别。如果这些数据可以接受，请关闭窗口以返回到 R P 选项卡，其中将裁剪倒数空间图以匹配建议的最大 Q 范围。选择更多模型并单击背景，将 Alpha 级别和最大维度设置为弹出窗口中的建议值。
单击"细化"。将打开交叉验证图，显示是否必须拒绝任何点，如红色所示。如果只有几个被拒绝的点，并且分布看起来不错，那么模型是好的。
您将在分析选项卡中打印报表。左键单击以突出显示示例，右键单击示例名称。选择从单个数据集创建报表。
将打开一个文本框以允许注释，并将生成一个 PDF 文档，显示生成的所有数字和值。在此代表性分析中，E9 DNA聚合酶外核酶减去突变体被绑定到DNA，并采用大小排除色谱小角度X射线散射运行。观察到两个高峰。
第一个大峰代表E9 DNA聚合酶外核酶减去突变DNA复合物。第二个表示未绑定状态。虽然选择帧的经典方法提供了第一峰中复合物的旋转半径，但第二峰明显合并，整个图的旋转半径表明，由于交叉峰污染，第二个兴趣峰没有稳定的回油半径。
在此分析中，只能使用五帧，显示半稳定的旋转半径。减去后，他们给出的旋转半径为36.3个焦虑。当使用 EFA 对峰值进行除节时，第二个峰值的相应曲线与原始峰值叠加，显示噪声信号明显减少，旋转半径为 34.1 安地罗。
数据的Kratky图显示，与错综复杂的峰值的复合体更球状，如PR曲线所证实的，该曲线给出的去旋转曲线的最大尺寸为108.5个焦虑度。此分析的非除流数据更拉长，最大尺寸为 120 个焦虑，很可能是由于未绑定 E9 聚合酶减去外核酶突变产生的异质性。最关键的步骤是选择单数值和数据范围，因为这些值极大地影响去卷积的准确性。
研究结果不应由自己进行，而应采用分析离心或多角度激光散射等附加技术进行进一步评估，以便进行生物解释。在线列耦合 SAXS 与去卷积相结合，并且像散点程序这样的用户友好界面是一个强大的包，即使来自内在困难的系统，也可提供有意义的结构数据。
