Bu araştırma, 18-29-07002 numaralı Hibe numarası olan Rusya Temel Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi. P.K., Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı Devlet Ataması, AAAA-A16-116021660073-5 hibe numarası ile desteklendi. M.V.P., Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı tarafından 075-15-2019-1659 (Kurchatov Genom Araştırmaları Merkezi Programı) hibe numarası ile desteklendi. Çalışma kısmen Moskova Devlet Üniversitesi Kalkınma Programı çerçevesinde satın alınan ekipmanlar üzerinde yapıldı. I.C., S.L., ve M.V.B. ayrıca Moskova Devlet Üniversitesi tarafından "Önde Gelen Bilim Okulu Nuh'un Gemisi" tarafından desteklendi.

1. Maya kültürü hazırlığı
<ol><li>Donmuş stok kültürlerinden uygun ortama sahip taze tabaklarda maya serin. Plakaları 24-48 saat boyunca 30 °C'de bir kültür inkübatöre koyun. NOT: Sıcaklığa duyarlı mutantların izin verilen sıcaklıkta büyümesine izin verin.</li>
	<li>Maya kültürlerini 15 mL tüplerdeki taze çizgiden 2 mL YPGal ortamında (%2 pepton, %1 maya özü, %2 galaktoz) aşılayın ve 30 °C'de 200 rpm'de ajite ederek bir gecede kuluçkaya bırakın.</li>
	<li>Kültürün optik yoğ...

<ol>
	<li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li><li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+with+6000+genes.">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li><li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast.">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li><li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li><li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome.">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li><li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells.">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li><li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aim-less+translation:+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3/Aim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis.">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749 (2016).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria.">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li><li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex.">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li><li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria.">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li><li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution.">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).</li><li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ribosome+(mitoribosome)+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo.">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li><li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast.">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Gen ekspresyasyonu incelemeleri modern yaşam bilimlerinde merkezi bir yer kaplar. Bu karmaşık süreç hakkında fikir veren çok sayıda yöntem geliştirilmiştir. Burada, fırıncı mayası S. cerevisiae mitokondrisinde protein biyosentezine erişmeye izin verme yöntemini tanımladık. Genellikle mutant maya suşunun mitokondrilerindeki mRNA'ların çeviri verimliliklerini, çalışılan mutasyonun sonuçlarına erişmek için vahşi tipe karşı karşılaştırmak için uygulanır. Bu, araştırmacıları...

Mitokondriler, ökaryotik bir hücrenin metabolizmasında derinden yer alan organellerdir. Elektron transfer zincirleri hücreye birden fazla biyokimyasal yolda kullanılan ana enerjik para birimi olan ATP'yi sağlar. Ayrıca, apoptoz, yağ asidi ve heme sentezi ve diğer süreçlerde yer almaktadırlar. Mitokondri disfonksiyonu iyi bilinen bir insan hastalığı kaynağıdır1. Organellerin yapısal veya düzenleyici bileşenlerini kodlayan nükleer veya mitokondriyal genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanabilir2. Fırıncı mayası Saccharomyces cerevisiae, çeşitli nedenlerden dolayı mitokondriyal gen ekspresyonunu incelemek için mükemmel bir model organizmadır. İlk olarak, genomları tamamensıralanmıştır 3, iyi açıklamalı ve bu organizma ile yürütülen uzun araştırma geçmişi sayesinde literatürde büyük miktarda veri zaten mevcuttur. İkincisi, nükleer genomları ile yapılan manipülasyonlar, hızlı büyüme hızları ve yüksek verimli homolog rekombinasyon sistemleri nedeniyle nispeten hızlı ve kolaydır. Üçüncüsü, fırıncı mayası S. cerevisiae, mitokondriyal genomlarla manipülasyonların geliştirildiği birkaç organizmadan biridir. Son olarak, fırıncı mayası, fermente edilebilir karbon kaynakları içeren medyada büyüyebilecekleri için solunum kusurlu mutantların izolasyonu ve incelenmesine izin veren aerobe-anaerobe öğretim üyesi bir organizmadır.
Çeviridüzeyindebaker mayası S. cerevisiae'nin mitokondriyal gen ekspresyonunu inceleme yöntemini açıklıyoruz. Ana prensibi çeşitli gözlemlerden gelir. İlk olarak, maya mitokondriyal genom sadece sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enziminin bir alt bölümü, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p5. Bu sayı küçüktür ve hepsi uygun koşullarda tek bir jel üzerinde elektroforezi ile ayrılabilir. İkincisi, mitokondriyal ribozomlar ökaryotik6yerine prokaryotik sınıfa aittir ve bu nedenle maya sitoplazmik ve mitokondriyal ribozomlar için antibiyotiklere duyarlılık farklıdır. Etiketli amino asidin(35S-metiyonin) sadece mitokondriyal çeviri ürünlerine dahil edildiği koşulları sağlayarak sikloseksüel ile sitoplazmik çevirinin inhibisyonunu sağlar. Sonuç olarak, deney, sekiz ürünün her biri için mitokondriyal çevirinin genel verimliliğini yansıtan, sentezlenen de novo sentezlenen mitokondriyal proteinlerde amino asit indüklenme oranı hakkında bilgi verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biowave Cell Density Meter CO8000</td>
			<td>BIOCHROM US BE</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND standard disposable cuvettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z330361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>288306&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloheximide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1988&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5388&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital block heater</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyTag L-[35S]-Methionine, 500&#181;Ci (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5425</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-864-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE29-0171-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone from meat, bacteriological</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>91249&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660nm Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1645050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protean II xi cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1651802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storm 865 phosphor imager</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Heated Gel Dryer</td>
			<td>Cleaver Scientific</td>
			<td>CSL-GDVH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

labelling and visualization of mitochondrial genome expression products in baker's yeast saccharomyces cerevisiae

Mitokondriler, aerobik solunum yapabilen ökaryotik hücrelerin temel organelleridir. Dairesel genom ve gen ifade aparatı içerirler. Fırıncı mayasının mitokondriyal genomları sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enzimi, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p'nin bir alt bölümüdür. Burada açıklanan yöntemin amacı, bu proteinleri özellikle 35S metiyonin ile etiketlemek, elektroforez ile ayırmak ve sinyalleri ekranda ayrık bantlar olarak görselleştirmektir. Yordam birkaç adım içerir. İlk olarak, maya hücreleri geç logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar galaktoz içeren bir ortamda kültürlenir. Daha sonra, sikloeximide tedavisi sitoplazmik çeviriyi engeller ve sadece mitokondriyal çeviri ürünlerinde 35S metiyonin birleştirilmesine izin verir. Daha sonra, tüm proteinler maya hücrelerinden çıkarılır ve poliakrilamid jel elektroforez ile ayrılır. Son olarak, jel kurutulur ve depolama fosfor ekranı ile inkübe edilir. Ekran, bantları ortaya çıkaran bir fosforimager üzerinde taranır. Yöntem, bir mutant maya suşunun mitokondrilerindeki tek bir polipeptitin biyosentez oranını, mitokondriyal gen ekspresyon kusurlarını incelemek için yararlı olan vahşi tiple karşılaştırmak için uygulanabilir. Bu protokol, tüm maya mitokondriyal mRNA'ların çeviri oranı hakkında değerli bilgiler verir. Bununla birlikte, uygun sonuçlara varmak için çeşitli kontroller ve ek deneyler gerektirir.

Yukarıda açıklanan protokolün ardından, iki S. cerevisiae suşundan mitokondriyal çeviri ürünleri atadık: vahşi tip (WT) ve AIM23 geninin ( AIM23Δ ) silinmesini taşıyan bir mutant), kodlama mitokondriyal çeviri başlatma faktörü 3 (Tablo 1)8. Mitokondriyal çeviri ürünleri radyoaktif olarak etiketlendi ve SDS-PAAG9'da ayrıldı. Örnekler, bir zaman kursu oluşturmak için doygunluk öncesinde her 2,5 dakikada bir toplanmışt?...

Watch this Scientific Journal Video about Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker&#039;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Mitokondriler, aerobik solunum yapabilen ökaryotik hücrelerin temel organelleridir. disfonksiyonları iyi bilinen bir insan hastalığı kaynağıdır. Baker mayası mitokondrileri sekiz proteini kodlayan dairesel genom içerir.Bu videoda, translojiyel ürünlerin radyoaktif etiketlemesi ve daha sonra jel elektroforez ile ayrılması yoluyla maya mitokondrisinde protein biyosentezini test etmek için kullanılan protokolü anlattık. Yordam birkaç önemli adım içerir. Donmuş stok kültürlerinden gelen mayayı uygun ortama sahip taze tabaklarda çizin.Plakaları 24 ila 48 saat boyunca 30 derecede kültür inkübatörüne koyun. Bu kültürleri 15 mililitrelik bir tüpteki taze çizgiden iki mililitre orta derecede aşılayın ve 30 derecede 200 RPM'de ajite ederek bir gecede kuluçkaya yatırın. 600 nanometre dalga boyunda kültürün optik yoğunluğunu ölçün.Steril tüplerdeki 0,2 emiciliği birimine karşılık gelen hacmi alın Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de maya hücrelerini palet edin. Bu süpernatant atın. Hücreleri beş saniye boyunca girdaplayarak 0,5 mililitre steril su ile yıkayın.Maya hücrelerini oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de paletle. Üstnatant atın. Hücreleri iki mililitre taze silme agar ortamında seyreltin.Optik yoğunluk 1,5 ila 1,9 arasında 1,5 ila 1,9 değerlerine ulaşana kadar 200 RPM ve 30 derecede alınan inkübte kenarı. Mikro santrifüj tüpündeki bir optik üniteye eşdeğer kültür hacmini aktarın. Tüpleri bir dakikalığına 3000 G'de döndürün.Üstnatant atın. Hücreleri beş saniye boyunca girdaplayarak 0,5 mililitre steril su ile yıkayın. Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de maya hücrelerini paletle süpernatant atın.Maya hücrelerini 0,5 mililitre steril çeviri tamponunda yeniden askıya alın. Süspansiyonu 15 mililitrelik tüpe yerleştirin. Sitosolik çeviriyi engellemek için 200 RPM ve 30 derecede alınan beş dakikalık kenar için mililitre başına 0,2 miligramlık son konsantrasyona kadar hücre süspansiyonuna sikloeximide ekleyin.25'ten 30'a ekleyin S35 metiyonin S35 metiyonininin 25 ila 30 mikrokülerini hücre süspansiyonuna ekleyin ve 200 RPM ve 30 derecede alınan 30 dakika kenar boyunca kuluçkaya yatırın. 200 RPM ve 30 derecede alınan 10 dakikalık kenar için Incubate etiketlemesini durdurmak için etiketsiz soğuk metiyonin ve borymycin ekleyin. Maya hücrelerini 30 saniye boyunca 9.000 G'de santrifüjleme ile toplayın.Hücreleri beş saniye boyunca girdaplayarak 0,5 mililitre steril su ile yıkayın. Maya hücrelerini oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de paletle. Üstnatant atın.Palete ve girdaplara beş ila 10 saniye boyunca 75 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. pH 6.8 ile 0.5 molar tris tamponunun 500 mikrolitresini ekleyin. pH 6.8 ile.Kısaca Girdap. Numuneye 600 mikrolitre metanol ekleyin. Beş saniyeliğine girdap.Numuneye 150 mikrolitre kloroform ekleyin. Beş saniyeliğine girdap. Numuneleri 12.000 G'de iki dakika santrifüjleyin.Opaface'i bir örnekleyici ile dikkatlice atın.Numuneye 600 mikrolitre metanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek dikkatlice karıştırın. Santrifüj örnekleri 12.000 G.Discard supernatant'ta iki dakika boyunca.Paleti 80 derecede iki dakika kurutun. Çökemiş proteinleri 60 mikrolitre Laemmli numune tamponunda çözün. Numuneleri 14 derecede 10 dakika ısıtın.Neden 17.5% Laemmli SDS poliakrilamid jel. Ceplere her numuneden 15 mikrolitre yükleyin. Mavi boya jel lenfin yaklaşık% 65'ine ulaşana kadar jeli soğuk odada çalıştırın.Jel Kumasi parlak mavi ile leke ve yükleme kontrolü olarak gerekli tarama veya fotoğraf yapmak. Jeli jel kurutucuda kurutun. Üç ila beş gün boyunca depolama fosfor ekranı ile kasette saklayın.Fosfor görüntüleyicilikte ekranı tarayın. Yukarıda açıklanan protokolün ardından, iki Saccharomyces cerevisiae suşundan mitokondriyal çeviri ürünleri atadık. Vahşi tip ve mutant varyantı silinmesi Aim23 gen kodlaması mitokondriyal çeviri başlatma faktörü üç.Mitokondriyal çeviri ürünleri zaten aktif olarak etiketlenmiş ve denatüre poliakrilamid jelde ayrılmıştır. Örnekler, zaman seyrini oluşturmak için doygunluğa iki buçuk dakikada bir toplandı. Jel, beş günlük sergiden sonra lekelendi, kurutuldu ve tarandı.Başarılı bir deneme durumunda, resim standart desene göre atanan sekiz bandı gösterir. Bununla birlikte, bireysel bantların yoğunlukları zorlanmaya ve deneysel koşullara bağlı olarak oldukça değişken olabilir. Her bant bir çeviri ürününe karşılık gelir.Veriler, mutant suşunun mitokondriyal protein sentezi yapabileceğini göstermektedir, çünkü vahşi tipte görünen tüm ürünler bu mutantta görülebilir. Bununla birlikte, bantların yoğunlukları vahşi tipten farklıdır, yani Aim23'ün bu silinmesi mitokondriyal gen ekspresyonını etkiler. Kumasi mavi leke ile demlenir ve yükleme kontrolü görevi görür.Verilerdeki sonuç, Image G veya Image Quan yazılımı kullanılarak suşlar veya deneysel koşullar arasındaki farkları belirlemek için ölçülebilir. Bunlar için her ürüne karşılık gelen sinyalin toplam sinyale oranı hesaplanır. Ortalama değerler ve standart sapmalar en az üç bağımsız deneyde hesaplanır.Sentezlenen proteinin kinetiği geçen yılki deneyde incelenmiştir. Numuneler, etiketleme reaksiyonun soğuk methionin ve borymycin tarafından durdurulmasından sonra belirtilen zaman noktalarında toplanır. Bu kontrol, ürünün kararlılığını tahmin etmek için gereklidir.Anti-Porin ile immün boyama bir antikor yükleme kontrolüdür. Maya mitokondrisinde protein biyosentezini incelemek için sıklıkla kullanılan yöntemi tanımladık. Bu protokol nispeten basit ve gerçekleştirilmesi hızlıdır.Aynı zamanda, son derece avantajlı olan dört mayalı mitokondriyal mRNA'nın çeviri oranı hakkında değerli bilgiler elde etmeyi sağlar. Bununla birlikte, ek deneyler gerektiren çeşitli sınırlamalara sahiptir ve bu eyaletler arası protein ve mRNA seviyelerinde yatmaktadır. Mitokondriyal çeviri sisteminde bu fonksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilir, ancak mekanizmayı keşfetmek için daha gelişmiş teknikler kullanılmalıdır.

labelling-visualization-mitochondrial-genome-expression-products

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

4.2K Views.  M.V. Lomonosov Moscow State University. Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable for aerobic respiration. Their dysfunction is a well known source of human disease. Baker's yeast mitochondria contains circular genome encoding eight proteins.In this video, we described the protocol used to assay protein biosynthesis in yeast mitochondria by means of radioactive labeling of translational products and subsequent separation by gel electrophoresis. The procedure includes several major steps. Streak yeast ...