Denne protokollen beskriver en metode som muliggjør stedsspesifikk identifisering av oksiderte cystinrester av proteiner. Metoden tillater kvantitative og stedsspesifikke data av oksyderte cystinrester som skal genereres fra ulike prøvetyper. For å starte den assisterte fangstprosedyren, vask de utfelte proteinpellets to ganger med aceton ved sentrifuging ved 20.500 G, i fire grader Celsius i 10 minutter.
Dekanter deretter acetonen og fjern gjenværende aceton med en mikropipette. Ved hjelp av en glass serologisk pipette legg til tre milliliter fersk iskald aceton til røret og bland godt ved å invertere røret flere ganger. Etter den andre vasken, la pellets lufttørke i ett til to minutter uten å la dem tørke over.
Tilsett en milliliter buffer B til den tørkede proteinpelleten. For å oppløse proteinet, sonikere pelleten gjentatte ganger i en badsoniker med en effekt på 250 watt i 15 til 30 sekunder om gangen, sammen med kort vortexing. Utfør Bicinchoninic acid eller BCA analysen for å måle proteinkonsentrasjonen.
For å standardisere proteinkonsentrasjonene, overfør 500 mikrogram proteinprøve til et 0,5 milliliter, 10 kilodaltons sentrifugalfilter, og volum opp prøven til 500 mikroliter med resuspenderingsbuffer. Sentrifuger proteinbufferblandingen ved 14.000 G i romtemperatur, til volumet i sentrifugalfilteret er mindre enn 100 mikroliter. Samle prøven ved å invertere filteret i et oppsamlingsrør.
Sentrifuger prøven ved 1000 G i to minutter og tilsett buffer C for å få et endelig volum på 500 mikroliter. For å redusere proteintiolene, tilsett 20 mikroliter 500 millimolar dithiothreitol eller DTT, til prøven for å få en endelig konsentrasjon på 20 millimolar, og inkuber prøvene i 30 minutter ved 37 grader Celsius med risting ved 850 RPM. Etter reduksjon, sentrifuge til prøvene i 0, 5 milliliter 10 kilodalton sentrifugalfiltre ved 14.000 G ved romtemperatur, til volumet i sentrifugalfilteret er mindre enn 100 mikroliter.
Legg til buffer D for å gjøre opp volumet til 500 mikroliter og gjenta sentrifugering. Etter den fjerde sentrifugeringen samler du prøvene ved å invertere filteret i et oppsamlingsrør for å sentrifugere ved 1000 G i to minutter. Mål deretter proteinkonsentrasjonen ved hjelp av BCA-analysen.
Deretter plasserer du spinnkolonnene på en vakuummanifold, og ved hjelp av en mikropipette overfører du 500 mikroliter av den nytilberedte tiolaffinitetsharpikslurryen til hver kolonne. Påfør vakuum for fjerning av vann. Gjenta prosedyren en gang for å oppnå 30 milligram harpiks per kolonne.
Vask harpiksen fem ganger med 500 mikroliter ultrarent vann, ved å påføre vakuum for å fjerne vannet og deretter fem ganger med 500 mikroliter buffer E.In et nytt rør, tilsett buffer C til 150 mikrogram av den reduserte proteinprøven til det endelige volumet er 120 mikroliter. Overfør proteinoppløsningen til en plugget spinnkolonne som inneholder harpiksen. Plasser hetten på kolonnen og inkuber i to timer ved romtemperatur med risting ved 850 o / min.
Vask harpiksen som beskrevet i manuskriptet. Bytt ut pluggen. For å utføre tryptisk fordøyelse på harpiks, tilsett 120 mikroliter nytilberedt trypsinløsning til prøvene, og inkuber kolonnen over natten ved 37 grader Celsius, med risting ved 850 RPM.
Neste dag, vask harpiksen flere ganger som beskrevet i manuskriptet og bytt ut pluggen. Ved hjelp av en mikropipette, tilsett 40 mikroliter 100 millimolar Triethylammonium bikarbonatbuffer til den vasket harpiksen. Tilsett deretter 70 mikroliter av det oppløste tandemmassemerket eller TMT-merkingsreagenset, og inkuber i en time ved romtemperatur med risting ved 850 o / min.
Oppbevar eventuelt gjenværende TMT-reagens ved minus 80 grader Celsius. Vask harpiksen og sett på pluggen. Elute TMT-merkede peptider ved å tilsette 100 mikroliter 100 millimolær ammoniumbikarbonatbuffer ved pH 8,0, som inneholder 20 millimolar DTT, til kolonnen, og inkubere kolonnen på en termisk mikser ved romtemperatur i 30 minutter ved 850 o / min.
Etter inkubasjon, utfør eluering ved å plassere kolonnen på en vakuummanifold, påføre vakuumet og eluere prøvene i et fem milliliter mikrosentrifugerør. Gjenta trinnet en gang, og tilsett deretter 100 mikroliter 80% acetonitril med 0,1% trifluoreddiksyre til kolonnen. Etter inkubering av kolonnen i 10 minutter ved romtemperatur, eluere prøven i samme fem milliliter sentrifugerør.
Plasser de eluerte prøvene i en vakuumkonsentrator til de er tørre. Oppbevar deretter de tørre peptidene ved minus 80 grader Celsius til videre bruk. Den kvalitative analysen av peptidprøver fra RAW 264.7-celler ble utført med SDS-PAGE, hvor prøver ble sammenlignet ved å bestemme forskjellige oksidasjonsnivåer på grunn av behandlinger.
De separerte proteinene ble deretter undersøkt av western blot for ytterligere å undersøke oksidasjonsnivåene av individuelle proteiner. Rapporterte ioneintensiteter av cystinholdige peptider ble analysert ved væskekromatografi tandem massespektrometri. Tioloksidasjonsstøkiometrien til iTRAQ, merket berikede og oksyderte peptider på individuelle cystinnivå, ble kvantifisert.
Fjern forsiktig aceton uten å forstyrre proteinpelleten. Sørg for at proteinpelleten er fullstendig oppløselig og kvantifisert nøyaktig, og at harpiks er nøyaktig allokert til spinnkolonner. Pass på å resuspendere harpiks under vasketrinnene.
Videre vurdering av berikede proteiner og peptider kan gjøres ved SDS-PAGE og farging, western blotting og massespektrometri.
