Dit protocol toont de juiste methodologie voor het snijden en kleuren van hart- en hersenweefsel. Het biedt ook richtlijnen voor het vaststellen van belichtings- en camera-opstellingen en fotografietechnieken voor beeldacquisitie. Deze methoden zijn bijzonder nuttig voor het uitvoeren van metingen in beeldplanimetrische analyse in knaagdierweefsels en kunnen van waarde zijn voor algemene wetenschappelijke macrofotografie.
Maak om te beginnen de hartcanule los van de spuit gevuld met Krebs-Henseleit-oplossing en aangesloten op een spuit gevuld met warme Krebs-Henseleit-oplossing met 0,1% methyleenblauw. Perfuseer het rattenhart met vier milliliter methyleenblauwoplossing met een snelheid van vier milliliter per minuut. Nadat u de canule van de spuit hebt losgekoppeld en het hart uit de canule hebt verwijderd, verwijdert u het overtollige methyleenblauw door het hart voorzichtig op tissuepapier te rollen.
Na het verwijderen van het overtollige methyleenblauw, maakt u de ligatuur rond de kransslagader los door de hemostatische tang te openen en de plastic slang rond de chirurgische hechting te verwijderen. Plaats vervolgens het bevlekte rattenhart in een roestvrijstalen matrix om te snijden. Snijd de ventrikels in twee millimeter dikke plakken, met als doel zes tot zeven plakken van één volwassen rattenhart.
Breng na het snijden de plakjes over in een plastic buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens vijf milliliter 1% trifenyltetrazoliumchloride opgelost in PBS toe aan de buis met de hartplakken en incubeer gedurende 10 minuten in een waterbad bij 37 graden Celsius met zachte menging na vijf minuten. Was na de incubatie de hartplakken minstens twee tot drie keer met PBS en bereid je voor op het vastleggen van beelden.
Na het verwijderen van de hersenen, inclusief de hersenstam, uit de schedel, plaats je de hersenen met zijn ventrale kant omhoog in de hersenmatrix. Afhankelijk van het gewicht van de dieren, kies de juiste grootte van de hersenen roestvrij stalen matrix. Beperk met behulp van messen de frontale en caudale delen van de hersenen.
Plaats vervolgens de messen gedeeltelijk in de kanalen tussen de eerste en de laatste messen. Wanneer alle messen parallel zijn ingebracht en gerangschikt, drukt u alle messen tegelijkertijd met de handpalm naar beneden om de hersenen in coronale plakjes van twee millimeter te snijden. Pak vervolgens de messen stevig vast langs de zijkanten met twee vingers en verwijder ze samen met de gesneden hersenen uit de matrix.
Schik de hersensneden één voor één in een bakje en zorg ervoor dat het binnenoppervlak van elke plak altijd naar boven is gericht. Giet vervolgens warme 1% trifenyl tetrazoliumchloride oplossing en PBS op de hersenplakken en incubeer gedurende acht minuten bij 37 graden Celsius in het donker. Breng na incubatie de hersenschijfjes over in een blauwe plastic bak om beelden vast te leggen.
Schik de hersenplakken in opeenvolgende volgorde van het frontale naar het caudale deel en gebruik een scalpel om de hemisferen in het sagittale vlak te scheiden. Fotografeer de plakjes van het weefsel direct na het kleuren. Stel de camera naar keuze in met een opgeladen batterij, geheugenkaart en aangesloten lens op een standaard.
Afhankelijk van de beschikbare lichtbronnen selecteert u de juiste witbalansinstellingen of voert u de kleurtemperatuurkalibratie uit volgens de instructies in de handleiding van de camera. Dompel de hartplakken volledig onder in een container met PBS. Schik de hersenschijfjes in een droge bak zonder PBS of andere vloeistoffen.
Plaats de container met plakjes onder de camera met de macrolens. Zorg ervoor dat alle segmenten volledig in het gezichtsveld passen en zich op hetzelfde vlak bevinden. Schakel de camera naar de volledig handmatige modus, stel de ISO 100 en het diafragma in op F10.
Pas de sluitertijd aan voor een optimale beeldbelichting en zorg ervoor dat het brandpuntsvlak van de camera evenwijdig is aan het oppervlak waar het monster zich bevindt. Nadat u het monsternummer hebt vastgelegd, draait u het cirkelvormige polarisatiefilter totdat reflecties verdwijnen en stelt u het weefselsegment in beeld met behulp van een externe trigger om te voorkomen dat de camera trilt wanneer de sluiter wordt losgelaten, en draait u vervolgens de segmenten en legt u beelden vast vanaf de andere kant. Deze foto van een met methyleenblauw en trifenyltetrazoliumchloride gekleurd hartschijfje na een hartinfarct bevat voldoende detail- en kleurinformatie voor verdere planimetrische analyse van de grootte van het infarct.
Bevriezing van hartweefsel gedurende 24 uur beïnvloedt de integriteit en vermindert de mitochondriale functie. Trifenyltetrazoliumchloridekleuring van het hart is dus niet rood maar lichtroze en de grens tussen de necrotische en levensvatbare weefsels is wazig. Van de twee methoden die zijn vergeleken om reflecties in de monsters te verminderen, is onderdompeling de meest efficiënte methode en produceert gedetailleerde beelden met een goed contrast.
Het polarisatiefilter is ook effectief, maar het vermindert de resolutie en microcontrast van het beeld enigszins. Een afbeelding van een hartschijfje zonder onderdompeling of filter bevat veel reflecties en is niet geschikt voor verdere analyse. In de planimetrische analyse moet de niet-aangedane kant van de hersenen worden vergeleken met de door een beroerte aangedane kant.
Handmatige camera-instellingen zorgen voor een optimale belichting en witbalans van alle beelden, waardoor een uniforme analyse mogelijk is. Voorbeelden van overbelichte en onderbelichte afbeeldingen van hartplakken worden hier getoond. Bovendien resulteren onjuiste witbalansinstellingen in een verschuiving naar blauw of geel en magenta of groen in het beeld.
Wetenschappelijke macrofotografie vereist gecontroleerde verlichting en een geschikte beeldvormingsopstelling. De gestandaardiseerde methodologie zorgt voor hoogwaardige, gedetailleerde digitale beelden. Deze methode is toepasbaar op alle experimentele kleindierorgelfotografie.