यह दृष्टिकोण स्वस्थ और रोगग्रस्त दिमाग विकसित करने में विस्तारित समय में प्रत्यारोपित इंटरन्यूरॉन की सेलुलर पहचान, एकीकरण और कार्यक्षमता की जांच करने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न जीबीएर्जिक इंटरन्यूरॉन की एक तेज और अत्यधिक कुशल पीढ़ी का वर्णन करता है जैसे अग्रदूत जो भोले और ट्रांसजेनिक चूहों के हिप्पोकैम्पस में जीवित रहते हैं और परिपक्व होते हैं। यह दृष्टिकोण हमें विकास संबंधी विकारों में सेल थेरेपी का उपयोग करने की चिकित्सीय क्षमता का मूल्यांकन करने में मदद करता है जहां इंटरन्यूरॉन से समझौता किया जाता है।
शुरू करने के लिए, मानव-व्युत्पन्न इंटरन्यूरॉन अग्रदूतों से सेल कल्चर माध्यम को हटा दें और कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना डीपीबीएस के साथ सावधानीपूर्वक कुल्ला करें। छह-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल डिटेचमेंट समाधान के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें। इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर दो से तीन मिनट के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि कोशिकाओं की सीमा चमकदार न दिखने लगे।
फिर, सेल डिटेचमेंट समाधान को रोकने के लिए छह-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में ताजा एन 2 माध्यम के 600 माइक्रोलीटर जोड़ें और एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से अलग करें। सेल निलंबन को एक प्लास्टिक ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर चार मिनट के लिए 180 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। वैक्यूम सिस्टम का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें और प्रत्यारोपण माध्यम में गोली को फिर से निलंबित करें।
एक गिनती कक्ष और एक टैली काउंटर का उपयोग करके निलंबन में कुल कोशिकाओं की गणना करें, और मात्रा को प्रति माइक्रोलीटर 100, 000 कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता में समायोजित करें। सेल निलंबन को बर्फ पर एक बंद ट्यूब में अधिकतम चार घंटे तक प्रत्यारोपण तक रखें। संज्ञाहरण के तुरंत बाद, पिल्ले को गीली बर्फ की सतह पर एक गीले ऊतक पर तीन मिनट के लिए रखें जब तक कि ऊपरी अंग सफेद न हो जाएं।
पिपेट के साथ कोशिकाओं को सावधानीपूर्वक पुन: निलंबित करें और सेल निलंबन के साथ सिरिंज लोड करें। प्यूप को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर रखकर और विपरीत दिशा में कान की सलाखों का उपयोग करके स्थिति दें। इसके बाद, इथेनॉल में भिगोए गए नरम ऊतक का उपयोग करके त्वचा की सतह को साफ करें।
लैम्ब्डा की पहचान करें और निर्देशांक को स्टीरियोटैक्सिक उपकरण के डिजिटल डिस्प्ले कंसोल पर शून्य करने के लिए सेट करें। हैमिल्टन सिरिंज को वांछित निर्देशांक में स्थानांतरित करने के बाद, खोपड़ी में प्रवेश करने के लिए 90 डिग्री मुड़ी हुई इंसुलिन सुई का उपयोग करें, जिससे एक छोटा छेद बन जाए। फिर, हैमिल्टन सिरिंज को नीचे लाएं जब तक कि सुई खोपड़ी को पार न कर ले और डोरसोवेंट्रल समन्वय को शून्य न कर दे।
वांछित डोरसोवेंट्रल निर्देशांक प्राप्त होने तक सुई को कम करें। स्टेम कोशिकाओं को इंजेक्ट किए जाने के बाद सुई को धीरे-धीरे वापस लें। हाथ से पिल्ला को गर्म करके प्रक्रिया को समाप्त करें जब तक कि यह मां को वापस देने से पहले हिलना शुरू न करे।
प्रत्यारोपण के बाद प्रसवोत्तर दिन 14 या दो महीने बाद प्रत्यारोपित कोशिकाओं के खिलाफ कोई प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया या स्थानीय सूजन नहीं पाई गई, जैसा कि आईबीए 1, सीडी 68 और गैलेक्टिन -3 का उपयोग करके पहचाने गए प्रतिक्रियाशील माइक्रोग्लिया की अनुपस्थिति से मूल्यांकन किया गया था। एस्ट्रोग्लियोसिस की सीमा ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन और भड़काऊ साइटोकिन्स, जैसे इंटरल्यूकिन -1, और साइटोटोक्सिक लिम्फोसाइटों की अनुपस्थिति द्वारा निर्धारित की जाती है। Cntnap2 नॉक-आउट चूहों में, मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न इंटरन्यूरॉन जैसी कोशिकाएं प्रत्यारोपण के बाद नौ महीने तक जीवित रहीं और इंजेक्शन साइट पर स्थानीयकृत थीं।
हालांकि, वे मस्तिष्क और यहां तक कि हिप्पोकैम्पस में भी फैले हुए थे, जैसा कि जंगली प्रकार के चूहों में देखा गया था। प्रोटोकॉल को मस्तिष्क के न्यूनतम व्यवधान और संपीड़न को सुनिश्चित करने के साथ-साथ प्रक्रिया की गति और निर्देशांक की सटीकता के बीच एक अच्छा संतुलन रखने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल कई तकनीकों के साथ संगत है, जैसे कनेक्टिविटी अध्ययन या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी या व्यवहार अध्ययन जैसे कार्यात्मक रीडआउट, आपके शोध के आधार पर, रुचि का सवाल।