Name: population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Die Arbeit im Van Melderen-Labor wird durch die ARC-Aktionen 2018-2023, den Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F), unterstützt. T.O. wird durch ein ULB-Stipendium unterstützt. T.S. wird durch ein FRIA-Stipendium (FNRS) unterstützt. J.C. wird durch ein Postdoktoranden-Stipendium "chargé de recherches" (FNRS) unterstützt.

<ol>
	<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence.">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+between+resistance,+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment.">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li><li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+mutagenesis,+gambler+cells,+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution.">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074 (2022).</li><li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli.">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li><li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens.">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li><li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation.">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin.">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).</li><li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance.">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li><li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli.">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).</li><li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives.">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).</li><li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening.">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li><li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival.">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li><li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations.">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).</li><li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch.">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li><li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis:+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state.">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li><li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+&#223;-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening.">Enrichment of persisters enabled by a &#223;-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).</li><li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations.">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li><li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock.">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li><li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm.">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).</li><li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment.">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li><li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells.">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation:+Stress,+metabolism,+the+host,+and+new+directions.">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).</li><li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+(MIC)+of+antimicrobial+substances.">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li><li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures.">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA.">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li><li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolone+antibiotics.">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li><li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinolones:+Action+and+resistance+updated.">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+antibiotics+kill+bacteria:+From+targets+to+networks.">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li><li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli.">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li><li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair.">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li><li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET:+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET.">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging.">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522 (2014).</li><li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide.">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222 (2014).</li><li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAPI:+A+DNA-specific+fluorescent+probe.">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li></ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Das in dieser Arbeit vorgestellte Protokoll ermöglicht die Analyse des Persistenzphänotyps, der als Reaktion auf eine Antibiotikabehandlung auf Populations- und Einzelzellebene beobachtet wird. Die Experimente wurden mit dem E. coli MG1655-Stamm durchgeführt, der in einem chemisch definierten Medium (MOPS-Glycerin 0,4%) gezüchtet wurde. Time-Kill-Assays und Mikroskopie-Experimente wurden an Exponentialphasenkulturen durchgeführt. Wir verwendeten OFX, ein Fluorchinolon, in einer Konzentration von 5 μg·mL−1, um die Persisterzellen sichtbar zu machen. Die hier beschriebenen Ansätze können auf andere bakterizide Antibiotika angewendet werden, wie z. B. β-Lactame, Aminoglykoside oder antimikrobielle Verbindungen31. Dementsprechend können andere Bakterienstämme, Medien oder Wachstumsbedingungen verwendet werden. Die Überwachung verschiedener Fluoreszenzfusionen in einem ähnlichen Aufbau wie dem hier beschriebenen kann nützlich sein, um zelluläre Prozesse wie DNA-Replikation32, DNA-Reparatur25, 33 und Zellteilung34 vor, während und nach der Antibiotikabehandlung zu verfolgen. In ähnlicher Weise können fluoreszierende Reporter genutzt werden, um verschiedene Aspekte der Zellphysiologie zu untersuchen, wie z. B. den intrazellulären pH-Wertvon 35, ATP36 oder ROS37. Alternativ zu fluoreszierenden Fusionen könnten auch chemische Farbstoffe eingesetzt werden. Zum Beispiel könnte die hupA-mCherry-Fusion durch 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) ersetzt werden, einen Fluoreszenzfarbstoff, der DNA38 färbt. Die Durchführung von Zeitraffermikroskopie in Verbindung mit solchen Fluoreszenzfarbstoffen sollte jedoch vermieden werden, da diese Färbetechniken die Dynamik des Zellzyklus während Zeitrafferexperimenten stören können. Alternativ können solche Experimente durch Zeitverlaufsanalysen von Schnappschüssen zu relevanten Zeitpunkten ersetzt werden.
Während solche fluoreszierenden Reporter hilfreich sind, sollte die Menge an Informationen, die durch die Analyse von Phasenkontrastbildern extrahiert werden können, nicht vernachlässigt werden. Hier haben wir die Entwicklung der Zelllänge während des Wachstums, der OFX-Behandlung und der Erholungsphase beobachtet. Andere Parameter, die auf Phasenkontrastbildern basieren, wie z. B. Zellbreite, Phasenkontrastintensität und Krümmungen der Bakterienzellen, können ebenfalls problemlos mit geeigneter Software wie MicrobeJ27 extrahiert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das hier beschriebene Verfahren auf andere Erkrankungen und Bakterienarten angewendet werden kann, um zelluläre Reaktionen auf sich verändernde Umgebungen oder Stressoren zu überwachen18,19. Durch die Verwendung anderer Fluoreszenzreporter (transkriptionelle und translationale Reporter, chemischer Farbstoff) in Kombination mit einer Populationsanalyse, wie z.B. Durchflusszytometrie/FACS, können interessante Fragestellungen in einem Multiskalenrahmen bearbeitet werden.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, den bakteriellen Persistenzphänotyp als Reaktion auf eine spezifische Antibiotikabehandlung auf Einzelzell- und Populationsebene zu analysieren. Persistenz beschreibt die Fähigkeit kleiner Subpopulationen innerhalb einer isogenen Population, hohe Dosen bakterizider Antibiotika (Fluorchinolone, Aminoglykoside, β-Lactame usw.) zu ertragen, wobei die minimale Hemmkonzentration (MHK) der sogenannten Persisterzellen identisch mit der des Großteils der Bevölkerung ist. Die biphasische Abtötungsdynamik zeigt bei der Messung des bakteriellen Überlebens im Laufe der Zeit in Gegenwart eines Antibiotikums das Vorhandensein vorübergehender medikamententoleranter Zellen, mit einer anfänglichen schnellen Eradikation der Nicht-Persister-Zellen, gefolgt von einer viel langsameren Abtötungsrate der Persisterzellen. Nach Entfernung des Antibiotikums führen diese Zellen zu einer genetisch identischen Population, die eine ähnliche Abtötungsdynamik aufweist, wenn sie mit demselben Antibiotikum behandeltwird 1,2. Im Gegensatz zur Persistenz wird die Antibiotikaresistenz auf Populationsebene definiert und ist in der Regel entweder eine Folge von de novo Mutationen oder dem horizontalen Gentransfer eines resistenzverleihenden Plasmids3. Während die Mutationen, die für die Resistenz verantwortlich sind, meist im Zielmolekül des Wirkstoffs oder in den Promotorregionen der Wirkstoff-Effluxpumpen lokalisiert sind, haben sich Gene, die die Persistenzhäufigkeit verändern, die durch genomweite und gezielte Mutantenanalyseansätze identifiziert wurden, als zahlreich und vielfältig erwiesen 2,3,4,5,6,7,8 . Daher ist es wahrscheinlich, dass Bakterienzellen über mehrere Wege in den Persisterzustand eintreten können 9,10,11, und es sind Ansätze zur Untersuchung des Persistenzphänomens auf Einzelzellebene erforderlich, um die Physiologie dieser Persisterzellen zu charakterisieren.
Die jüngste Entwicklung mikrofluidischer Werkzeuge, die in Kombination mit der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, hat den Weg für die Charakterisierung des Persistenzphänotyps geebnet und die Rolle wichtiger zellulärer Prozesse wie Chromosomenreplikation12, DNA-Reparatur 13 und Zellteilung14 bei der Bildung von Persisterzellen hervorgehoben. In dieser Arbeit beschreiben wir einen integrierten Ansatz, der klassische mikrobiologische Assays mit Einzelzell-Live-Bildgebung kombiniert, um Persisterzellen zu charakterisieren, die in exponentiell wachsenden Escherichia coli-Kulturen erzeugt wurden, die mit einer hohen Dosis Ofloxacin behandelt wurden. Das hier beschriebene Protokoll kann angewendet werden, um das Phänomen der Antibiotikapersistenz bei anderen Bakterienarten, wie z. B. Bacillus subtilis15, oder Erkrankungen (z. B. Antibiotikapersistenz nach β-Lactam-Behandlung 16) zu untersuchen, und kann leicht modifiziert werden, um die vielen Phänomene zu untersuchen, die mit phänotypischer Heterogenität verbunden sind17,18,19 . Darüber hinaus kann der in dieser Arbeit beschriebene Aufbau mit anderen fluoreszierenden Reportern kombiniert werden, um bestimmte zelluläre Parameter von Interesse zu untersuchen, wie z. B. intrazelluläre Konzentrationen von pH20 oder ATP21 auf Einzelzellebene, was möglicherweise neue Einblicke in das Phänomen der Antibiotikapersistenz liefern könnte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2.2H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-S0000&#160;</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck</td>
			<td>ONIX2 1.0.1&#160;</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2.6H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02539.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4.5H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02790.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td>Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td>
			<td></td>
			<td>BE10</td>
			<td>wt reference strain, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td>
			<td></td>
			<td>BE16</td>
			<td>HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>24244.232</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/&#160;</td>
			<td>Image software; Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>56815</td>
			<td>Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CELLSTAR&#174; multiwell culture plate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8812-100EA</td>
			<td>24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6768-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
			<td>Digital Image Acqusition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05099.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05029.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05153.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agar medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22700041</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780029</td>
			<td>Growth medium for MIC determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05832.1000</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>7487-88-9</td>
			<td>Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ&#160;</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck</td>
			<td>B04A-03-5PK&#160;</td>
			<td>Plate for microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05927.0100</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, Free Acid ULTROL&#174; Grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>475898-500GM</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>SIgma-Aldrich</td>
			<td>S5886-1KG</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01180.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.01145.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ofloxacin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>82419-36-1</td>
			<td>Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>&#160;840-208200</td>
			<td>UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SoftMax Pro</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Microplate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-[Tris(hydroxym&#233;thyl)-m&#233;thyl]-glycine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08602.0250</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss&#174; immersion Oil 518F</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil to increase resolution of microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen3.2 Pro</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscopic image acquisition and processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O&#160;</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08883.0500</td>
			<td>For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

population and single-cell analysis of antibiotic persistence in escherichia coli

Die Persistenz von Antibiotika bezieht sich auf die Fähigkeit kleiner bakterieller Subpopulationen, hohe Dosen bakterizider Antibiotika vorübergehend zu tolerieren. Nach einer bakteriziden Antibiotikabehandlung wird der Großteil der Bakterienpopulation schnell abgetötet. Auf diese erste schnelle Phase der Abtötung folgt eine deutliche Abnahme der Abtötungsrate, da die Persisterzellen lebensfähig bleiben. Klassischerweise wird die Persistenz auf Populationsebene durch Time/Kill-Assays bestimmt, die mit hohen Antibiotikadosen und für definierte Expositionszeiten durchgeführt werden. Diese Methode liefert zwar Informationen über den Gehalt an Persisterzellen und die Abtötungskinetik, spiegelt aber nicht die intrinsische Zell-zu-Zell-Heterogenität wider, die dem Persistenzphänomen zugrunde liegt. Das hier beschriebene Protokoll kombiniert klassische Time/Kill-Assays mit der Einzelzellanalyse mittels Echtzeit-Fluoreszenzmikroskopie. Durch die Verwendung geeigneter Fluoreszenzreporter kann die mikroskopische Bildgebung lebender Zellen Aufschluss über die Auswirkungen des Antibiotikums auf zelluläre Prozesse wie Chromosomenreplikation und -segregation, Zellverlängerung und Zellteilung geben. Die Kombination von Populations- und Einzelzellanalyse ermöglicht die molekulare und zelluläre Charakterisierung des Persistenzphänotyps.

Watch this Scientific Journal Video about Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli at JoVE.com

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

Die Antibiotikapersistenz beschreibt die Fähigkeit kleiner Subpopulationen innerhalb einer empfindlichen isogenen Population, hohe Dosen bakterizider Antibiotika vorübergehend zu tolerieren. Das vorliegende Protokoll kombiniert Ansätze zur Charakterisierung des Antibiotika-Persistenz-Phänotyps auf molekularer und zellulärer Ebene, nachdem Escherichia coli tödlichen Dosen von Ofloxacin ausgesetzt wurde.

Populations- und Einzelzellanalyse der Antibiotikapersistenz in Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine integrative Methode dar, die klassische mikrobiologische Assays mit Einzelzell-Live-Bildgebung kombiniert, um Escherichia coli Persisterzellen nach einer Behandlung mit hohem Ofloxacin-Gehalt zu charakterisieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, das Persistenzphänomen auf Populations- und Einzelzellebene zu analysieren. Die Kombination von Populations- und Einzelzellanalyse ermöglicht die molekulare und zelluläre Charakterisierung des Persistenzphänotyps.Streifen Sie zunächst den interessierenden Bakterienstamm aus einem gefrorenen Glycerinvorrat auf eine LB-Agarplatte und inkubieren Sie ihn über Nacht bei 37 Grad Celsius für einen Zeitraum von 15 bis 19 Stunden, um einzelne Kolonien zu erhalten. Beimpfen Sie eine isolierte Kolonie in einem Glasröhrchen, das fünf Milliliter MOPS-Wachstumsmedium enthält, das mit 0,4 % Glukose angereichert ist, und fügen Sie dem Medium bei Bedarf ein selektives Antibiotikum hinzu. Legen Sie das Röhrchen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 180 U/min in einen Schüttelinkubator.Zentrifugieren Sie am nächsten Tag einen Milliliter Kultur mit 2.300 g für drei Minuten, um die Zellen zu pelletieren, und resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit dem gleichen PBS-Volumen. Messen Sie den OD bei 600 Nanometern und berechnen Sie das Volumen, das für einen anfänglichen OD600 von 0,01 in einem Endvolumen von zwei Millilitern benötigt wird. Als nächstes geben Sie zwei Milliliter MOPS-Glycerin 0,4%medium in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit transparentem Boden und beimpfen Sie mit dem berechneten Kulturvolumen über Nacht.Legen Sie die 24-Well-Platte in einen automatisierten Mikroplatten-Reader, um den OD600 24 Stunden lang zu überwachen. Stellen Sie den Mikroplatten-Reader so ein, dass der OD600 alle 15 Minuten bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius und einer hohen Orbitalrotation von 140 U/min gemessen wird. Schmelzen Sie 100 Milliliter LB-Agar und lagern Sie den Kolben bei 55 Grad Celsius, um eine Erstarrung zu vermeiden.Bereiten Sie sechs kleine Glaskolben vor und pipettieren Sie mit einer sterilen Pipette fünf Milliliter flüssiges LB-Agar-Agarmedium in jeden Kolben. Nehmen Sie 10 Mikroliter der fünf Milligramm pro Milliliter Loxacin-Stammlösung und verdünnen Sie sie in 90 Mikrolitern Reinstwasser. Geben Sie zunehmende Volumina des verdünnten Ofloxacins in jeden der sechs Glaskolben, die LB-Agar-Medium enthalten, um eine Endkonzentration von null bis 0,1 Mikrogramm pro Milliliter Ofloxacin zu erhalten.Mischen Sie die Lösung, indem Sie die Kolben mehrmals drehen, und gießen Sie das mit Antibiotika versetzte LB-Agar-Medium in eine Sechs-Well-Kulturplatte. Lassen Sie den Agar abkühlen, bis er fest ist, und trocknen Sie die Platte vor der Verwendung. Verdünnen Sie eine Bakterienkultur über Nacht auf eine endgültige Zelldichte von eins mal 10 bis siebte KBE pro Milliliter mit PBS.Geben Sie zwei Mikroliter verdünnte Kultur auf jede Vertiefung der getrockneten Sechs-Well-Platte. Lassen Sie die Flecken trocknen, bevor Sie die Platte über Nacht in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius stellen. Prüfen Sie am nächsten Tag, bei welcher Ofloxacin-Konzentration das Wachstum von Bakterienkolonien gehemmt ist.Gießen Sie ca. 25 Milliliter des vorbereiteten LB-Agars in eine Petrischale. Geben Sie dann fünf bis acht sterile Glasperlen auf jede erstarrte und getrocknete Platte. Drehen Sie die Platten um und beschriften Sie sie.Als nächstes bereiten Sie zehnfache Glasröhrchen mit serieller Verdünnung vor, die 900 Mikroliter 0,01-molare Magnesiumsulfatlösung enthalten. Verdünnen Sie in einem Glasröhrchen eine Übernachtkultur in frischem und temperaturangepasstem Medium auf einen endgültigen OD600 von ca. 0,001 und lassen Sie die Kultur über Nacht in einem Inkubator wachsen. Am nächsten Tag, wenn der OD600 0,3 erreicht, übertragen Sie 100 Mikroliter der Kultur zur Verdünnung gemäß den Spot-Assay-Daten.Führen Sie eine zehnfache serielle Verdünnung der Bakterienkultur durch. Anschließend werden 100 Mikroliter der verdünnten Kultur auf die vorbereiteten LB-Agarplatten gelegt. Geben Sie die gewünschte Konzentration von Ofloxacin in die Bakterienkultur und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.Entnehmen Sie zu relevanten Zeitpunkten 100 Mikroliter der Kultur und verdünnen Sie die Kultur entsprechend den Spot-Assay-Daten. 100 Mikroliter der verdünnten Kultur auf die LB-Agarplatten geben. Am nächsten Tag zählen Sie die Kolonien der über Nacht bebrüteten Platten bei den beiden höchsten Verdünnungen, für die Kolonien nachgewiesen werden können.Berechnen Sie das Überlebensverhältnis, indem Sie die KBE pro Milliliter zu jedem Zeitpunkt an der KBE pro Milliliter bei T0 normalisieren, und stellen Sie den normalisierten Wert der logarithmischen Basis 10 als Funktion der Zeit dar. Entfernen Sie die Konservierungslösung aus jeder Vertiefung der mikrofluidischen Platte und ersetzen Sie sie durch frisches Nährmedium. Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte mit dem Verteilersystem, indem Sie auf die Schaltfläche Versiegeln oder über die mikrofluidische Software klicken.Führen Sie als Nächstes auf der mikrofluidischen Softwareschnittstelle eine erste Priming-Sequenz durch, indem Sie auf Run Liquid Priming Sequence klicken. Inkubieren Sie die Platte in einem thermostatisch gesteuerten Schrank des Mikroskops bei 37 Grad Celsius für mindestens zwei Stunden, bevor Sie mit der Mikroskopie-Bildgebung beginnen. Starten Sie dann eine zweite Run Liquid Priming-Sequenz, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte, indem Sie auf der mikrofluidischen Softwareschnittstelle auf Platte entsiegeln klicken. Ersetzen Sie das Medium in den Vertiefungen durch 200 Mikroliter frisches Medium, antibiotikahaltiges frisches Medium und 0,01 OD verdünnte Kulturprobe im frischen Medium. Nachdem Sie die mikrofluidische Platte wie zuvor gezeigt versiegelt haben, legen Sie die Platte auf das Mikroskopobjektiv im Mikroskopschrank.Klicken Sie in der Mikrofluidik-Software auf Run Cell Loading Sequence, um das Laden der Zellen in die Mikrofluidikplatte zu ermöglichen. Stellen Sie mit dem Durchlichtmodus einen optimalen Fokus ein und wählen Sie mehrere Bereiche von Interesse aus, in denen eine angemessene Zellzahl von bis zu 300 Zellen pro Feld beobachtet werden kann. Bearbeiten Sie in der Mikrofluidik-Software die Option Benutzerdefinierte Sequenz ausführen, um die Injektion von frischem Medium mit 6,9 Kilopascal für sechs Stunden in die Vertiefungen eins und zwei zu programmieren, gefolgt von dem Medium mit dem Antibiotikum bei 6,9 Kilopascal oder sechs Stunden in Vertiefung drei und schließlich das frische Medium mit 6,9 Kilopascal für 24 Stunden in die Vertiefungen vier und fünf.Führen Sie die Mikroskopie-Bildgebung im Zeitraffermodus mit einem Bild alle 15 Minuten mit Durchlicht und der Anregungslichtquelle für den Fluoreszenzreporter durch und starten Sie das mikrofluidische Programm. Öffnen Sie die ImageJ- oder Fiji-Software auf dem Computer und ziehen Sie die Hyperstack-Zeitraffer-Mikroskopiebilder in die Fidschi-Ladeleiste. Verwenden Sie "Bild", gefolgt von "Farbe" und dann "Zusammengesetzt" erstellen, um die verschiedenen Kanäle des Hyperstacks zu verschmelzen.Verwenden Sie "Bild", "Farbe" und dann "Kanäle anordnen", wenn die Kanäle nicht der gewünschten Farbe entsprechen. Öffnen Sie das MicrobeJ-Plugin und erkennen Sie die Bakterienzellen mithilfe der manuellen Bearbeitungsoberfläche. Löschen Sie die automatisch erkannten Zellen, und umreißen Sie die gewünschten Persisterzellen manuell Bild für Bild.Verwenden Sie nach der Erkennung das Ergebnissymbol in der manuellen Bearbeitungsoberfläche von MicrobeJ, um eine ResultJ-Tabelle zu generieren. Verwenden Sie die ResultJ-Tabelle, um Einblicke in verschiedene relevante Parameter der Einzelzellenanalyse zu erhalten, und speichern Sie die ResultJ-Datei. Der MHK von Ofloxacin wurde für beide Stämme mit 0,06 Mikrogramm pro Milliliter bestimmt, was darauf hindeutet, dass die hupA-mCherry-Fusion die Sensitivität von Ofloxacin im Vergleich zum isogenen Wildtyp-Stamm nicht beeinflusste.Der Spot-Assay zeigte isolierte Klone bei geeigneten Verdünnungen über die Zeit, z. B. 10 bis zur negativen fünften Verdünnung zum Zeitpunkt Null. Im Time-Kill-Assay wurde eine typische biphasische Kurve beobachtet, bei der die erste Steigung die schnelle Abtötung der Nicht-Persister-Population widerspiegelt. Die zweite Phase zeigte eine langsamere Abtötungsrate, was das Vorhandensein von medikamententoleranten Persisterzellen zeigte.Bemerkenswert ist, dass die Time-Kill-Kurve zeigt, dass das hupA-mCherry-Fusionsprotein keinen Einfluss auf die Time-Kill-Kinetik hatte. Im mikrofluidischen Experiment deutet die erste Wachstumsphase darauf hin, dass die Zellen vor der Behandlung mit Ofloxacin lebensfähig waren und sich teilten. Nach dieser ersten Wachstumsphase wurde die Zellteilung blockiert, sobald das Antibiotikum die Zellen erreichte.Nach der Behandlung mit Ofloxacin, bei Perfusion mit frischem Medium, war die überwiegende Mehrheit der Zellen nicht in der Lage, ihr Wachstum wieder aufzunehmen. Im Gegensatz dazu könnte sich eine kleine Subpopulation verlängern und filamentöse Zellen bilden, die als Persisterzellen definiert werden. Das sich teilende Persisterfilament erzeugte mehrere Tochterzellen, von denen die meisten ähnlich wie unbehandelte Zellen zu wachsen und sich zu teilen begannen.Die Zunahme der Zelllänge korrelierte mit einer Zunahme der gesamten mCherry-Fluoreszenzintensität, was einen Neustart der Replikation und eine Zunahme der Nukleoidhäufigkeit widerspiegelt. Bei der Verwendung eines Stammes, der einen intrazellulären Reporter enthält, um die Persistenz zu untersuchen, ist es im Vergleich zu einem Wildtyp-Stamm unerlässlich, dass die Anwesenheit des Reporters das Wachstum, die MHK und die Abtötung nicht beeinträchtigt. Das hier beschriebene Verfahren kann auf andere Erkrankungen und Bakterienarten angewendet werden, um zelluläre Reaktionen auf sich verändernde Umgebungen oder Stress zu überwachen.Durch die Verwendung anderer fluoreszierender Reporter in einem identischen Aufbau können neue Einblicke in die Physiologie von Persisterzellen gewonnen werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Forschung

Biologie

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

High Throughput Screening von Fungal Endoglucanaseaktivität in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Und<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Erkennung von Live-<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...