Dit protocol laat zien hoe zeer reproduceerbare sferoïden kunnen worden gekweekt en laat zien hoe proteomische experimenten kunnen worden uitgevoerd om de biologische functie van 3D-structuren te karakteriseren. Onze 3D-cultuur kan tegelijkertijd honderden biologische replicaten produceren in dezelfde bioreactor, en de LC-MS-benadering kan de overvloed van duizenden eiwitten in één experiment meten. De procedure wordt gedemonstreerd door Stephanie Stransky, een postdoc van het lab.
Neem om te beginnen de suspensie van HepG2/C3A- en THLE-3-cellen. Tel het aantal cellen en verdun de celsuspensie in volledige groeimedia om 1 miljoen cellen te verkrijgen in een maximaal volume van 1,5 milliliter. Was de putjes van een ultralage opzetplaat, ronde bodemplaat met 24 putjes met 0,5 milliliter groeimedia en centrifugeer gedurende vijf minuten op 3.000 g.
Breng de celsuspensie over op de plaat en centrifugeer deze gedurende drie minuten op 120 g. Incubeer vervolgens de plaat om de vorming van sferoïden te initiëren. Breng vervolgens de bioreactor 24 uur voor het overbrengen van de sferoïden in evenwicht door de vochtigheidskamer te vullen met 25 milliliter steriel water en de celkamer met negen milliliter groeimedia met behulp van een spuit van 10 milliliter met een lange naald.
Plaats de bioreactor vervolgens 24 uur in een 3D-incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Pipeteer de sferoïden voorzichtig op en neer met behulp van punten van één milliliter met een brede boring om ze los te maken van de ultralage bevestigingsplaat en over te brengen naar een weefselkweekschaaltje. Om eventuele resterende sferoïden op te vangen, wast u de plaat met 0,5 milliliter voorverwarmde groeimedia en brengt u deze over naar de kweekschaal.
Evalueer met een lichtmicroscoop de grootte, compactheid en rondheid van de sferoïden om de sferoïden te selecteren die voldoende gevormd zijn. Breng de geselecteerde sferoïde over in de balancerende bioreactor gevuld met vijf milliliter verse groeimedia. Vul vervolgens de hele bioreactor met verse groeimedia.
Plaats de bioreactor in de 3D-incubator en pas de rotatiesnelheid aan met behulp van de besturingseenheid. Vervang elke twee tot drie dagen 10 milliliter oude groeimedia door 10 milliliter verse media. Wijzig de rotatiesnelheid elke keer na het vervangen van de media.
Kweek de sferoïden gedurende 15 dagen en verdeel ze over twee verse bioreactoren. Open de 3D-app die op de tablet is geïnstalleerd, selecteer de bioreactor en leg het beeld vast. Als alternatief kunt u een zwarte achtergrond achter de bioreactor plaatsen en ervoor zorgen dat er geen licht wordt weerkaatst op de celkamer.
Leg het beeld zo dicht mogelijk bij de bioreactor vast. Verzamel vervolgens sferoïden door vijf milliliter media uit de bioreactor te verwijderen met behulp van een spuit die aan een lange naald door de bovenste poort is bevestigd. Zorg ervoor dat de sferoïden afdalen naar het onderste midden van de bioreactor.
Open nu de voorste poort en verzamel de sferoïden met behulp van een punt van één milliliter met een brede boring. Breng deze sferoïden over in microcentrifugebuisjes, centrifugeer gedurende vijf minuten op 500 g en gooi de media weg. Was de sferoïde door 200 microliter HBSS toe te voegen om de FBS te verwijderen.
Centrifugeer hierna gedurende vijf minuten op 500 g en gooi het supernatant weg. Dompel de sferoïde pellet vervolgens snel onder in vloeibare stikstof om deze in te vriezen en bewaar deze bevroren pellet bij min 80 graden Celsius tot verdere verwerking. Om de cellen te lyseren, neemt u een buis met verzamelde sferoïden en resuspendeert u ze in 25 microliter 5%SDS.
Homogeniseer de pellet door op en neer te pipetteren. Los vervolgens één microgram monsters en 10 microliter 0,1% trichloorazijnzuur op. Na het extraheren van het eiwit en het reinigen van de monsters, stelt u de MS-acquisitiemethode in om de MS/MS-spectra te genereren uit de geïdentificeerde peptidesignalen.
Breng de plaat vervolgens over in de nanoliter vloeistofchromatografie autosampler. Stel de volledige MS-scan in op 300 tot 1.100 massa-tot-laadverhouding in de Orbitrap. Stel de resolutie in op 120000 en stel het doel van de automatische versterkingsregeling in op 125.
Stel vervolgens MS/MS in de Orbitrap in met een sequentieel isolatievenster van 50 massa-tot-ladingsverhouding. Richt het doel van de automatische versterkingsregeling op 400 en stel een hogere energie in op de dissociatie-energie van 30. Volgens de levensvatbaarheidsanalyse van sferoïden nemen de niveaus van adenylaatkinase toe tot dag 17, wat resulteert in ongeveer 7% van de celdood.
Daarna daalt het sterftecijfer tot onder de 5%Bovendien onthult een analyse van de eerste hoofdcomponent een duidelijk onderscheid tussen sferoïde monsters en platte celculturen. De proteomische analyse gaf aan dat THLE-3- en HepG2/C3A-sferoïden vergelijkbare profielen hebben die de leverfunctie weerspiegelen. Bovendien vertoonden de sferoïden overexpressie van twee isovormen van metallothioneïnen in vergelijking met platte cellen.
Functioneel gegroepeerde netwerken toonden genontologische verrijking voor het koolhydraatmetabolische proces in HepG2/C3A- en THLE-3-sferen. Om te voorkomen dat groeimedia worden gemorst, mag u de voorste poort niet openen of sluiten wanneer de celkamer volledig gevuld is met vloeistof. De monstervoorbereiding en -analyse die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden gebruikt om het proteoom van celkweek te onderzoeken met behulp van 2D- en 3D-methoden, evenals weefselmonsters.
