جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عامل النسخ أربعة ، والدوكسيسيكلين محرض Lentiviral نظام تنبيغ

Summary

يمكن للمحرض دوكس Stemgent ماوس TF تعيين الفيروسة البطيئة إعادة برمجة الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) إلى الخلايا المحفزة التي يسببها (آي بي إس) الجذعية. نحن هنا لشرح بروتوكول للDOX - محرض التعبير من العوامل الماوس النسخ برمجة Oct4 ، Sox2 ، وKlf4 ج Myc إلى توليد المستعمرات التي تعبر عن الجذع المشترك علامات MES تعدد القدرات.

Abstract

باستخدام مجموعة محددة من عوامل النسخ وظروف ثقافة الخلية ، ياماناكا وزملاؤه أظهرت أن الفيروس الارتجاعي بوساطة التسليم والتعبير عن Oct4 ، Sox2 ، C - Myc وKlf4 قادر على حمل تعدد القدرات في الخلايا الليفية الماوس. ¹ التقارير اللاحقة أثبتت فائدة من الدوكسيسيكلين (DOX) محرض lentiviral نظام التسليم لتوليد خلايا الجذع في المرحلتين الابتدائية والثانوية من مجموعة متنوعة من غيرها من أنواع الماوس الكبار الخلية الجسدية. ^2،3

الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) خلايا مماثلة للخلايا الجنينية (ES) الجذعية في الانتشار ، والقدرة على التشكل للحث على تشكيل مسخي. ويمكن استخدام كلا النوعين من الخلايا مثل المادة المحفزة انطلاق لجيل من الخلايا أو الأنسجة المختلفة في مجال الطب التجديدي. ^4-6 خلايا الجذع أيضا أن يكون لها ميزة واضحة على خلايا ES لأنها مفتاح خواص الخلايا من دون وفاق معضلة أخلاقية جنين التدمير.

نحن هنا لشرح بروتوكول لإعادة برمجة الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEF) الخلايا مع محرض DOX Stemgent تعيين ماوس الفيروسة البطيئة TF. علينا أيضا أن تثبت محرض DOX Stemgent ماوس TF تعيين الفيروسة البطيئة هي قادرة على التعبير عن كل واحد من عوامل النسخ four على تنبيغ في MEFs مما يحفز الخلية الجذعية المحفزة الدولة الذي يعرض العلامات المميزة للخلايا تعدد القدرات وفاق.

Protocol

1. تنبيغ الفيروسية من MEFs

1. وقبل يوم من بداية التجربة ، ومعطف خلية 15 سم صحن الثقافة العقيمة مع الجيلاتين 0.2 ٪ التي تمت تصفيتها في DDH ₂ O. احتضان لوحة ليلا 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂.
2. نضح السائل من الطبق المطلي الجيلاتين ، وخلايا MEF البذور (كنا Nanog-GFP/rtTA الخلايا MEF) في كثافة 4x10 ⁵ خلايا في طبق. احتضان الخلايا في 30 مل من وسط النمو MEF (450ml DMEM تستكمل مع FBS 50 مل ، 5 مل 100X غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 5 مل البنسلين / الستربتوميسين ، 5 مل 200 ملي L - الجلوتامين و 0.5 مل 55mM β المركابتويثانول) ل يومين في 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ ₂ حتى ما يقرب من 80 ٪ متموجة.
3. نضح على المديين المتوسط ​​وإضافة 30 مل من متوسط ​​النمو MEF تستكمل مع الفيروسة البطيئة المركزة (4 × 100 ميكرولتر الأسهم فيروس + حل وسط النمو 29.6 مل). صخرة الطبق برفق لضمان التوزيع حتى من المتوسط. احتضان الخلايا ليلا 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂.

2. الدوكسيسيكلين المستحثة إعادة برمجة

1. 20-24 ساعة بعد تنبيغ ، يعرض للتريبسين الخلايا transduced ، الطرد المركزي في 200 XG لمدة 5 دقائق والمتوسطة في النمو resuspend ES / IPS (450 مل DMEM خروج المغلوب تستكمل مع 50ml مصل العجل ES الخلية المؤهلين ، والبنسلين 5 مل / ستربتوميسين 5 مل 200 مم L - الجلوتامين ، و 0.5 مل β - LIF المركابتويثانول و 25 ميكرولتر). transduced البذور MEF في لتركيز مناسبة لحجم الخلية صحن الثقافة (كنا 2.5 × 10 ⁵ خلايا في طبق 10 سم لإعادة البرمجة تجارب الكفاءة والعزلة مستعمرة ، و 2 × 10 ⁴ خلايا لكل بئر في 4 لوحات جيدا للتجارب ICC). يحضن بين عشية وضحاها في 37 ° C ثاني ، و 5 ٪ ₂. ملاحظة : يمكن تجميد أي الخلايا المتبقية transduced في النيتروجين السائل لتحليل المستقبل.
2. نضح على المديين المتوسط ​​واستبدال ES / IPS المتوسطة أعد الطازجة وتستكمل مع الدوكسيسيكلين إلى تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / لتر (ونحن وسيط وبدون أضاف DOX كعنصر تحكم سلبية). احتضان على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ ₂.

3. Immunocytochemical تحليل الكفاءة تنبيغ

48 ساعة بعد الدوكسيسيكلين التعريفي ، وتحديد كفاءة تنبيغ بواسطة المناعية (ICC). المحكمة الجنائية الدولية تنفذ الاختبارات على الخلايا replated في 4 لوحات جيدا. وينبغي تعديل كافة وحدات التخزين المدرجة في البروتوكول التالية وفقا لحجم الخلية لوحة الثقافة.

1. اغسل الخلايا مرة بلطف مع برنامج تلفزيوني (بدون المغنيسيوم ^{2 +} + أو CA ^{2 +}).
2. إصلاح الخلايا مع 500 ميكرولتر من 0.5 مل بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. اغسل الخلايا بلطف مرتين مع برنامج تلفزيوني.
4. Permeabilize الخلايا من خلال إضافة 500 ميكرولتر من الجليد الباردة 0.2 ٪ -20 ® توين في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. اغسل الخلايا بلطف مرتين مع برنامج تلفزيوني.
6. كتلة غير محددة وملزمة مع العازلة ميكرولتر 200 حظر لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
7. احتضان الخلايا مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية محددة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (كنا Oct4 ، Klf4 ، وSox2 Myc ج).
8. اغسل الخلايا بلطف مرتين مع برنامج تلفزيوني.
9. احتضان الخلايا مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، وحماية لوحات من نور (كنا حمار المتقارن رودامين المضادة للأرنب ، حمار مكافحة عنزة AlexaFluor ® 594 المتقارن ، حمار المضادة للماوس المتقارن رودامين والمعادية للحمار أرنب ، رودامين المتقارن).
10. اغسل الخلايا بلطف مرتين مع برنامج تلفزيوني.
11. إضافة دابي (تركيز النهائي 2 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) ، واحتضان 10 دقيقة لتصور النوى.
12. اغسل الخلايا برفق مع برنامج تلفزيوني.
13. أضف لمكافحة تتلاشى أكوا جبل قبل التصوير باستخدام مجهر مقلوب الفلورسنت.

4. عزل وتوسيع المستعمرات خلية الجذع

1. بعد البدء في عملية إعادة برمجة (كما هو موضح في القسم 2) ، ورصد الثقافات واستبدال المتوسط ​​كل 48 ساعة. استخدمنا الدوكسيسيكلين المتوسط ​​تحتوي على خلايا لثقافة لاثني عشر يوما أولا ثم إزالتها في وقت لاحق من الدوكسيسيكلين المتوسطة لضمان أن المستعمرات الجذع التقطت يدويا للتوسع ستكون DOX مستقلة.
رصد خلايا يوميا لتغيرات شكلية يدل على عملية إعادة البرمجة ، أو عند استخدام الخلايا مثل MEF Nanog-GFP/rtTA ، ومراقبة الصرف ومضان GFP لتحديد المستعمرات برمجتها. وسوف يكون كل تجربة مختلفة ، ولكن عادة ما تكون مستعمرات كبيرة بما يكفي لعزل بين 16 و 22 يوما. يمكن المستعمرات التي تم تحديدها خلال هذا الإطار الزمني ثم يكون معزولا يدويا وtrypsinized للتوسع والتحليل.
2. وقبل يوم من عزل وtrypsinizing المستعمرات برمجتها ، وإعداد لوحة 24 بشكل جيد من قبل البذر مع غاما المشع تغذية طبقة MEFs في كثافة 5 × 10 ⁴ خلايا لكل بئر. يحضن بين عشية وضحاها في 37 ° C ثاني ، و 5 ٪ ₂.
3. اختيار يدويا في كل مستعمرة الجذع ويعرض للتريبسين أن يفرق بين الركام الخلية. إعادة لوحة خلايا الجذع في ES / IPS المتوسطة في الآبار الفردية لوحة 24 - جيدا قبل البطولة مع غاما المشع تغذية طبقة MEFs. وينبغي المصنف الآبار في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 ⁵ خلايا / جيد. احتضان على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ ₂. تغيير وسائل الإعلام كل 24 ساعة.
4. مراقب المستعمرات الجذع اليومية للنمو ومضان GFP. نحن احتضان ثقافاتنا لمدة 6 أيام قبل الركض.
5. تحديد أي لوحة من الآبار ال 24 جيدا يعبرون بانتظام GFP. يمكن trypsinized الآبار التي GFP التعبير جيدة وpassaged 1:08 إلى 4 - جيدا لوحات التي تم مسبقا مع المصنف غاما المشع تغذية طبقة MEFs. ويمكن استخدام هذه اللوحات لتحليلها من قبل المحكمة الجنائية الدولية علامة المحفزة وتلطيخ AP.

5. Immunocytochemical تحليل لتعدد القدرات

جرى اختبار لدينا من المحكمة الجنائية الدولية على توسيع نطاق الخلايا في 4 لوحات جيدا. وينبغي تعديل كافة وحدات التخزين المدرجة في البروتوكول التالية وفقا لحجم الخلية لوحة الثقافة.

1. اغسل الخلايا بلطف مرتين مع برنامج تلفزيوني (بدون المغنيسيوم ^{2 +} + أو CA ^{2 +}).
2. احتضان في 0.5 مل من 0.2 ٪ من الجليد الباردة توين 20 في برنامج تلفزيوني للبئر الواحد لمدة 10 دقيقة.
3. اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
4. كتلة غير محددة وملزمة مع العازلة ميكرولتر 200 حظر لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
5. احتضان الخلايا مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية محددة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (كنا SSEA - 1 ، وNanog Oct4).
6. اغسل الخلايا بلطف مرتين مع برنامج تلفزيوني.
7. احتضان الخلايا مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، والابتعاد عن الضوء (كنا حمار المضادة للماوس رودامين المتقارن وحمار المتقارن رودامين المضادة للأرنب).
8. اغسل الخلايا بلطف مرتين مع برنامج تلفزيوني.
9. إضافة دابي (تركيز النهائي 2 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) ، واحتضان 10 دقيقة لتصور النوى.
10. اغسل الخلايا برفق مع برنامج تلفزيوني
11. أضف لمكافحة تتلاشى أكوا جبل قبل التصوير باستخدام مجهر مقلوب الفلورسنت.

6. الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) تلون المستعمرات خلية الجذع

الجذع المستعمرات من الباب 4 يتم تحليلها لنشاط AP استخدام مجموعات المتاحة تجاريا وبعد بروتوكول الشركة المصنعة.

الجزء 7. ممثل النتائج

ومحرض DOX Stemgent ماوس TF تعيين الفيروسة البطيئة لإعادة برمجة خلايا الجذع لMEFs. بعد تنبيغ من MEFs والتعبير عن عوامل النسخ Oct4 ، ويمكن الكشف عن Sox2 ، Klf4 وج Myc في الخلايا تعامل مع الدوكسيسيكلين يمكن اكتشافه (DOX +) ، ولكن التعبير ضئيلة أو معدومة في الخلايا (DOX) غير المعالجة (الشكل 1) . سوف تغيرات شكلية التقدم مع مرور الوقت (12 يوما من العلاج DOX في هذا المثال) لتوليد ES أكبر وأكثر الخلايا مثل المستعمرات مع حواف محددة مستعمرة النمو وثلاثة الأبعاد (الشكل 2A). عند إزالة DOX ، هناك انعكاس ملحوظ في التشكل الخلوي لبعض مستعمرات الخلايا مثل وفاق ، ومع ذلك ، واصلت العديد من مستعمراتها الجذع مورفولوجيا (الشكل 2A). هذه المستعمرات المحفزة ، وعندما التقطت passaged ، وعرض نموذجي التعبير علامة من تعدد القدرات الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) ، Nanog ، وOct4 SSEA - 1 (الشكل 3). نوع من الخلايا المستخدمة في MEF هذه التجربة (Nanog-GFP/rtTA الخلايا MEF) عن GFP من موضع Nanog الذاتية عند برمجتها لحالة تعدد القدرات. ولذلك يمكن أن يستخدم التعبير GFP كمؤشر أولي لإعادة البرمجة الناجحة (الشكل 3).

الشكل 1 : كيمياء سيتولوجية مناعية (ICC) التحليل 48 ساعة بعد DOX التعريفي. لوحة من اليسار المتطرف (- DOX) هو ممثل الرقابة السلبية للتعبير عن العوامل الاربعة من دون تحريض تنبيغ DOX. وتم تأكيد عوامل النسخ وأعرب بشكل صحيح من قبل الأجسام المضادة المقابلة (كما هو موضح باللون الأحمر) ، ملطخة دابي لتصور النواة.

الشكل 2 : التحويل من MEFs Nanog-GFP/rtTA المورفولوجية للدولة خلية الجذع. أ) المقابل المرحلة 100X التصوير من الخلايا مما يدل على الضغط وتحويل المستعمرات إلى MEFs المحفزة على مر الزمن من يوم 3 (D3 + دوكس) ليوم 22 (D22). تم سحب DOX في يوم 12. اللوحة اليمنى العليا : 20X صورة سلبية من السيطرة - DOX وحة. B) 200X المرحلة على النقيض من الصور ومضان GFP اليوم أبرز ما بعد 18 مستعمرة DOX تحريض IPS. C) 200X المرحلة على النقيض من الصور ومضان GFP من 18 يوما اضافيا بعد DOX مستعمرة تحريض IPS.

الشكل 3 : التحليل المستعمرات IPS. (أ) المرحلة المجهري التباين وAP تلون مستعمرة الجذع (200X). (ب) تحليل تعدد القدرات علامة : لوحة بقي يظهر تراكب المرحلة النقيض من التعبير GFP مراسل برمجة. GFP التعبير يعكس مستوى التعبير Nanog الذاتية. وسط لوحة تبين للمحكمة الجنائية الدولية لتلطيخ علامات تعدد القدرات. اللوحة اليمنى يظهر تلوين دابي لتصور النوى (100X).

Discussion

هذه النتائج تثبت أنه يمكن استخدام الماوس محرض DOX Stemgent TF تعيين الفيروسة البطيئة لتوليد بكفاءة الجذع المستعمرات بالتحريض على التعبير خارج الرحم من transduced عوامل النسخ في الخلايا الليفية الماوس الجنينية. عند تصميم التجارب برمجة ، ينبغي النظر في متغيرات عدة لتحسين كفاءة إعادة برمجة. الأول ، أنه من الممكن تعديل نسبة الخلايا النشطة الفيروس إلى الهدف (أي وزارة الداخلية) أثناء الخطوة الإصابة الأولية إلى زيادة أو نقصان الكفاءة تنبيغ ، مما يؤثر على عدد من الفيروسات متكامل في الهدف السكان الخلية. الثانية ، يمكن تعديل طول الوقت تتعرض الخلايا لDOX يؤثر على كفاءة الخلية الجذع الجيل مستعمرة. ثالثا ، يمكن للقدرة التكاثري للتأثير إعادة برمجة الخلايا المستهدفة ، والخلايا التي تنمو بشكل نشط وتقسيم أكثر قابلية لإعادة البرمجة. أخيرا ، عند تعديل البروتوكول لأعداد مختلفة من الخلايا أو أطباق مختلفة ثقافة حجم الأنسجة ، فمن المستحسن أن تعدل أرقام الخلية المستهدفة نسبيا إلى مساحة الصحن الثقافة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set	Stemgent	00-0003