Génération de cellules souches pluripotentes induites par la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris avec un facteur de transcription Quatre, doxycycline inductible système de transduction lentiviraux

Résumé

Inductible Stemgent Dox souris Lentivirus TF Set peut reprogrammer des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) pour souches pluripotentes induites (iPS). Ici nous démontrons le protocole de DOX-expression inductible de facteurs de transcription de souris reprogrammation Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc pour générer des colonies iPS qui expriment des marqueurs communs MES pluripotence.

Résumé

L'utilisation d'un ensemble défini de facteurs de transcription et de conditions de culture cellulaire, Yamanaka et ses collègues ont démontré que des rétrovirus médiation de livraison et d'expression de Oct4, Sox2, c-Myc et Klf4 est capable d'induire la pluripotence dans des fibroblastes de souris. ¹ Des rapports subséquents ont démontré l'utilité de la doxycycline (DOX) inductible système de livraison lentiviral pour la génération de cellules iPS fois primaire et secondaire d'une variété d'autres types de souris cellule somatique adulte ^2,3.

Souches pluripotentes induites (iPS) sont similaires à souches embryonnaires (ES) cellules de morphologie, de la prolifération et la capacité d'induire la formation de tératome. Les deux types de cellules peuvent être utilisés comme matériau de départ pluripotentes pour la génération de cellules différenciées ou de tissus en médecine régénérative. ^4-6 cellules iPS ont également un net avantage sur les cellules ES comme ils présentent des propriétés clés des cellules ES sans le dilemme éthique la destruction d'embryons.

Ici nous démontrons le protocole pour la reprogrammation des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), les cellules avec la souris inductibles DOX Stemgent Set TF lentivirus. Nous démontrons également que le inductible Stemgent DOX souris Lentivirus TF Set est capable d'exprimer chacun des quatre facteurs de transcription à la transduction dans MEFs induisant un état de cellules souches pluripotentes qui affiche les marqueurs de pluripotence caractéristiques des cellules ES.

Protocole

1. Transduction virale des FAE

1. Le jour avant le début de votre expérience, manteau d'un plat de 15 cm de culture cellulaire avec 0,2% de gélatine stérile filtrée dans le trou DDH ₂ O. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 ° C et 5% de CO ₂.
2. Aspirer le liquide du plat de gélatine couché, et les cellules MEF semences (nous avons utilisé Nanog-GFP/rtTA cellules MEF) à une densité de 4x10 ⁵ Cellules par boîte. Incuber les cellules dans 30 ml de milieu de croissance du MEF (450ml DMEM supplémenté avec 50 FBS ml, 5 ml 100x non acides aminés essentiels, 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5 ml de 200 mM de L-glutamine et 0,5 ml 55mm β-mercaptoéthanol) pour deux jours à 37 ° C CO et 5% ₂ Jusqu'à environ 80% de confluence.
3. Aspirer le moyen et ajouter 30 ml de milieu de croissance MEF complétées par des lentivirus concentré (4 x 100 ul solution stock de virus + 29,6 ml milieu de croissance). Rocher le plat doucement pour assurer une distribution égale du milieu. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C et 5% de CO ₂.

2. Doxycycline induit Reprogrammation

1. 20-24 heures après la transduction, trypsiniser les cellules transduites, centrifuger à 200 xg pendant 5 minutes et remettre en suspension dans un milieu de croissance ES / IPS (450 ml Knockout DMEM supplémenté avec du sérum 50ml ES cellules qualifiées de veau, 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5 ml 200 mM L-glutamine, 0,5 ml β-mercaptoéthanol et 25 FRV ul). Graine transduites MEF à une concentration appropriée pour la taille de la parabole de culture cellulaire (nous avons utilisé 2,5 x 10 ⁵ Cellules par 10 cm plat pour la reprogrammation des expériences d'efficacité et de l'isolement des colonies, et 2 x 10 ⁴ Cellules par puits dans 4 assiettes et pour des expériences de la CPI). Incuber une nuit à 37 ° C CO et 5% ₂. Remarque: toutes les cellules restantes transduites peuvent être congelés dans l'azote liquide pour analyse future.
2. Aspirer le moyen et le remplacer par ES / IPS milieu préparé frais et complétée par la doxycycline à une concentration finale de 2 pg / ml (nous avons également ajouté milieu sans DOX comme contrôle négatif). Incuber à 37 ° C CO et 5% ₂.

3. Analyse immunocytochimique de efficacité de transduction

48 heures post-doxycycline par induction, de déterminer l'efficacité de transduction par immunohistochimie (CPI). Effectuer des tests de la CPI sur les cellules réensemencées dans 4 assiettes bien. Tous les volumes sont énumérés dans le protocole suivant doit être ajusté en fonction de la taille plaque de culture cellulaire.

1. Lavez délicatement les cellules une fois avec du PBS (sans Mg ^{2 +} + Ou Ca ^{2 +}).
2. Fixer les cellules avec 500 ul de 0,5 ml de paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante.
3. Lavez délicatement les cellules deux fois avec du PBS.
4. Perméabiliser les cellules en ajoutant 500 pi d'glacée 0,2% de Tween ® -20 en PBS. Incuber 10 minutes à température ambiante.
5. Lavez délicatement les cellules deux fois avec du PBS.
6. Bloquer la liaison non spécifique avec 200 ul du tampon de blocage pendant une heure à température ambiante.
7. Incuber les cellules avec 200 pi de l'anticorps primaire spécifique nuit à 4 ° C (nous avons utilisé Oct4, Klf4, Sox2 et c-Myc).
8. Lavez délicatement les cellules deux fois avec du PBS.
9. Incuber les cellules avec 200 pi d'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante, protéger les plaques de la lumière (nous avons utilisé conjugué rhodamine âne anti-lapin, l'âne anti-chèvre AlexaFluor ® 594 conjugué, âne anti-souris conjugué rhodamine et Donkey anti- Lapin-rhodamine conjugué).
10. Lavez délicatement les cellules deux fois avec du PBS.
11. Ajouter au DAPI (concentration finale 2 ug / ml dans PBS) et incuber 10 minutes à visualiser les noyaux.
12. Lavez délicatement les cellules avec du PBS.
13. Ajouter Aqua anti-fade-Mont, avant d'imagerie utilisant un microscope inversé fluorescentes.

4. L'isolement et l'expansion des colonies de cellules iPS

1. Après avoir initié le processus de reprogrammation (comme décrit dans la section 2), de surveiller les cultures et les remplacer moyenne toutes les 48 heures. Nous avons utilisé moyennes doxycycline contenant à la culture des cellules pour les douze premiers jours, puis ensuite retiré la doxycycline à partir du milieu pour s'assurer que les colonies iPS manuellement pris de l'expansion serait DOX indépendants.
2. Les cellules doivent être surveillés quotidiennement pour des changements morphologiques indicative du processus de reprogrammation, ou lorsque l'utilisation de cellules, comme Nanog-GFP/rtTA MEF, la morphologie de surveiller et d'identifier fluorescence de la GFP colonies reprogrammé. Chaque expérience sera différente, mais les colonies sont généralement assez grand pour l'isolement entre 16 et 22 jours. Colonies identifiés durant ce laps de temps peut alors être manuellement isolées et traitées à la trypsine d'expansion et d'analyse.
3. Le jour avant d'isoler et de trypsinisation les colonies reprogrammé, préparer une plaque à 24 puits par ensemencement avec des rayons gamma d'alimentation couche MEFs à une densité de 5 x 10 ⁴ Cellules par puits. Incuber une nuit à 37 ° C CO et 5% ₂.
4. Choisir manuellement chaque colonie iPS et trypsiniser de dissocier les agrégats de cellules. Re-plaque de la cellules iPS en ES / IPS moyenne des puits individuels de la plaque de 24 puits de pré-ensemencés avec des rayons gamma d'alimentation couche FAE. Les puits doivent être ensemencées à une densité de 2 x 10 ⁵ Cellules / puits. Incuber à 37 ° C CO et 5% ₂. Changer les médias toutes les 24 heures.
5. Surveiller les colonies iPS quotidien pour la croissance et la fluorescence de la GFP. Nous incuber nos cultures pendant 6 jours avant repiquage.
6. Déterminez quels puits de la plaque de 24 puits sont uniformément exprimant la GFP. Les puits qui ont une bonne expression de la GFP peut être trypsinées et passages en 4-01h08 ainsi que les plaques ont été pré-ensemencés avec des rayons gamma d'alimentation couche FAE. Ces plaques peuvent être utilisées pour l'analyse des marqueurs pluripotentes par la CCI et coloration AP.

5. Analyse immunocytochimique pour la pluripotence

Notre test de la CPI a été réalisée sur des cellules élargi dans 4 assiettes bien. Tous les volumes sont énumérés dans le protocole suivant doit être ajusté en fonction de la taille plaque de culture cellulaire.

1. Lavez délicatement les cellules deux fois avec du PBS (sans Mg ^{2 +} + Ou Ca ^{2 +}).
2. Incuber dans 0,5 ml de glace-froid 0,2% de Tween 20 dans du PBS par puits pendant 10 minutes.
3. Lavez délicatement les cellules trois fois avec PBS.
4. Bloquer la liaison non spécifique avec 200 ul du tampon de blocage pendant une heure à température ambiante.
5. Incuber les cellules avec 200 pi de l'anticorps primaire spécifique nuit à 4 ° C (nous avons utilisé SSEA-1, Nanog et Oct4).
6. Lavez délicatement les cellules deux fois avec du PBS.
7. Incuber les cellules avec 200 pi d'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante, en gardant loin de la lumière (nous avons utilisé âne anti-souris conjugué rhodamine et conjugué rhodamine âne anti-lapin).
8. Lavez délicatement les cellules deux fois avec du PBS.
9. Ajouter au DAPI (concentration finale 2 ug / ml dans PBS) et incuber 10 minutes à visualiser les noyaux.
10. Lavez délicatement les cellules avec du PBS
11. Ajouter Aqua anti-fade-Mont, avant d'imagerie utilisant un microscope inversé fluorescentes.

6. Phosphatase alcaline (AP) Coloration des colonies de cellules iPS

1. Colonies iPS de l'article 4 peuvent également être analysés pour l'activité AP utilisant des kits disponibles dans le commerce et après le protocole du fabricant.

Partie 7. Les résultats représentatifs

Le inductible Stemgent DOX souris Lentivirus TF Set peut être utilisé pour reprogrammer des cellules iPS au MEF. Après transduction du MEF, l'expression de Oct4 facteurs de transcription, Sox2, Klf4 et c-Myc peut être détecté dans les cellules traitées avec doxycycline (Dox +), mais l'expression peu ou pas peut être détecté dans traitée (DOX-) cellules (figure 1) . Les modifications morphologiques va progresser au fil du temps (12 jours de traitement DOX dans cet exemple) pour générer des ES plus grands, plus comme des cellules des colonies avec des bords définis colonie et trois dimensions de croissance (figure 2a). Lorsque DOX est enlevé, il ya un retour notable de la morphologie cellulaire pour certaines cellules ES-like colonies, cependant, la plupart des colonies ont maintenu leur morphologie iPS (figure 2a). Ces colonies iPS, quand ramassé et passées, affichage typique expression du marqueur de pluripotence de la phosphatase alcaline (AP), Nanog, Oct4 et SSEA-1 (figure 3). Le type de cellules MEF utilisés dans cette expérience (Nanog-GFP/rtTA cellules MEF) expriment la GFP du locus endogène Nanog lors reprogrammée à l'état de pluripotence. Expression de la GFP peut donc être utilisé comme un indicateur préliminaire pour la reprogrammation réussie (figure 3).

Figure 1: Immunocytochimie (ICC) analyse 48 heures après l'induction de DOX. Le panneau de gauche (-Dox) est un contrôle négatif pour l'expression représentative des quatre facteurs de transduction sans induction DOX. Facteurs de transcription correctement exprimées ont été confirmées par les anticorps correspondants (en rouge), colorées avec du DAPI pour visualiser le noyau.

Figure 2: La conversion morphologique des Nanog-GFP/rtTA FAE à l'état de cellules iPS. A) l'imagerie à contraste de phase 100x de cellules démontrant le compactage et la conversion de FAE en colonies iPS au fil du temps du jour 3 (D3 + Dox) au jour 22 (D22). DOX a été retirée le jour 12. Upper panneau de gauche: 20x image de contrôle négatif de la plaque-DOX. B) 200x à contraste de phase et d'images fluorescence de la GFP de la journée ont souligné l'après-18 DOX à induction iPS colonie. C) 200x à contraste de phase et d'images fluorescence de la GFP de la journée supplémentaire de 18 l'après-DOX à induction iPS colonie.

Figure 3: Analyse des colonies iPS. (A) microscopie à contraste de phase et de la coloration d'une colonie AP iPS (200x). (B) analyse des marqueurs pluripotence: panneau de gauche montre superposition contraste de phase avec expression de la GFP journaliste de la reprogrammation. Expression de la GFP reflète le niveau d'expression endogènes Nanog. Panneau du milieu montre coloration CPI pour des marqueurs de pluripotence. Panneau de droite montre DAPI coloration de visualiser les noyaux (100x).

Discussion

Ces résultats démontrent que les souris inductibles Stemgent DOX Lentivirus Set TF peut être utilisé pour générer efficacement des colonies iPS en induisant l'expression ectopique de transduction des facteurs de transcription dans les fibroblastes embryonnaires de souris. Lors de la conception des expériences de reprogrammation, plusieurs variables doivent être considérés afin d'optimiser l'efficacité de la reprogrammation. Premièrement, il est possible de modifier le ratio de la cellule active du virus à cibler (c'est à dire MOI) pendant l'étape de l'infection primaire pour augmenter ou diminuer l'efficacité de transduction, affectant ainsi le nombre de virus intégré dans la population de cellules cibles. Deuxièmement, en ajustant la longueur de temps les cellules sont exposées à DOX peut affecter l'efficacité de la production d'iPS colonie cellulaire. Troisièmement, la capacité proliférative des cellules cibles peuvent avoir un impact reprogrammation, comme les cellules qui sont en pleine croissance et en divisant se prêtent davantage à une reprogrammation. Enfin, lors de la modification du protocole pour le nombre de cellules différentes ou différents plats de taille de culture de tissu, il est recommandé que le nombre de cellules cibles être ajustée proportionnellement à la surface de la boîte de culture.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set	Stemgent	00-0003