Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

Resumen

El Inducible Stemgent Dox ratón TF Set Lentivirus puede reprogramar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células. Aquí se demuestra el protocolo para la expresión de DOX-inducible de los factores de la transcripción del ratón reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc para generar iPS colonias que expresan marcadores comunes MES pluripotencia.

Resumen

El uso de un conjunto definido de factores de transcripción y las condiciones de cultivo celular, Yamanaka y sus colegas demostraron que los retrovirus mediada por la entrega y la expresión de Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4 es capaz de inducir la pluripotencialidad en fibroblastos de ratón. ¹ Informes posteriores han demostrado la utilidad de la doxiciclina (DOX) inducible sistema de entrega de lentivirus para la generación de células iPS de primaria y secundaria a partir de una variedad de otros tipos de ratón célula somática adulta. ^2,3

Madre pluripotentes inducidas (iPS) son similares a las células madre embrionarias (ES) en la morfología de las células, la proliferación y la capacidad de inducir la formación de teratoma. Ambos tipos de células se pueden utilizar como material de partida pluripotentes para la generación de células o tejidos diferenciados en la medicina regenerativa. ^4-6 células iPS tienen una clara ventaja sobre células madre embrionarias, ya que muestran las características clave de células madre embrionarias sin el dilema ético de la embrión de la destrucción.

Aquí se demuestra el protocolo para la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), las células con la inducible Stemgent DOX Raton TF Lentivirus. También demuestran que la inducible Stemgent DOX ratón TF Set Lentivirus es capaz de expresar cada uno de los cuatro factores de transcripción en la transducción en MEFs lo que induce un estado de células madre pluripotentes que muestra los marcadores de pluripotencia característica de las células ES.

Protocolo

1. Transducción viral de MEFs

1. El día antes de comenzar el experimento, un abrigo de 15 cm de células placa de cultivo estéril con 0,2% de gelatina en el filtrado ddH ₂ O. Incubar la placa durante la noche a 37 ° C y 5% de CO ₂.
2. Aspirar el líquido de la cápsula de gelatina revestido, y las células de las semillas MEF (usamos Nanog-GFP/rtTA células MEF) a una densidad de 4x10 ⁵ Células por plato. Se incuban las células en 30 ml de medio de cultivo MEF (450 ml DMEM suplementado con FBS 50 ml, 5 ml 100x no aminoácidos esenciales, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml de 200 mM L-glutamina y 0,5 ml de 55 mm β-mercaptoetanol) para dos días a 37 ° C CO y el 5% ₂ Hasta que confluyen alrededor del 80%.
3. Aspira el medio y agregar 30 ml de medio de cultivo complementado con MEF lentivirus concentrado (4 x 100 l solución stock de virus + 29,6 ml de medio de cultivo). Roca el plato con cuidado para garantizar una distribución uniforme del medio. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% de CO ₂.

2. Doxiciclina inducida Reprogramación

1. 20-24 horas después de transducción, trypsinize las células transducidas, centrifugar a 200 xg durante 5 minutos y resuspender en medio de cultivo ES / IPS (450 ml golpe de gracia DMEM suplementado con 50 ml de suero de células ES-calificado de ternera, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml 200 mM L-glutamina, 0,5 ml de β-mercaptoetanol y 25 l LIF). Semilla transducidas MEF en una concentración adecuada para el tamaño de la celda placa de cultivo (en el ejemplo 2.5 x 10 ⁵ Células por placa de 10 cm para la reprogramación de los experimentos la eficiencia y el aislamiento de colonias, y 2 x 10 ⁴ Células por pocillo en 4 platos y para los experimentos de la CPI). Incubar toda la noche a 37 ° C CO y el 5% ₂. Nota: todas las células transducidas restantes pueden ser congeladas en nitrógeno líquido para su posterior análisis.
2. Aspirar el medio y reemplazar con ES / iPS medio preparado fresco y se complementa con la doxiciclina a una concentración final de 2 mg / ml (también hemos añadido medio sin DOX como control negativo). Se incuba a 37 ° C CO y el 5% ₂.

3. Análisis inmunocitoquímico de transducción de la eficiencia

48 horas después de la inducción de la doxiciclina, determinar la eficiencia de transducción mediante técnicas de inmunohistoquímica (ICC). Realizar las pruebas de la CPI en las células replated en 4 placas. Todos los volúmenes que figuran en el siguiente protocolo debe ser ajustado de acuerdo con el tamaño de la celda placa de cultivo.

1. Lave suavemente las células una vez con PBS (sin Mg ^{2 +} + O Ca ^{2 +}).
2. Fijar las células con 500 l de 0,5 ml de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3. Lave suavemente las células dos veces con PBS.
4. Permeabilizar las células mediante la adición de 500 l de helado de 0,2% de Tween ® -20 en PBS. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
5. Lave suavemente las células dos veces con PBS.
6. Bloquear la unión no específica con 200 l buffer de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente.
7. Se incuban las células con 200 ul del anticuerpo primario específico la noche a 4 ° C (en el ejemplo Oct4, Klf4, Sox2 y c-Myc).
8. Lave suavemente las células dos veces con PBS.
9. Se incuban las células con 200 l de anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente, la protección de las placas de la luz (en el ejemplo burro anti-conejo conjugado Rodamina, Donkey anti-cabra conjugado AlexaFluor ® 594, burro anti-ratón conjugado rodamina y anti burro -Conejo rodamina conjugado).
10. Lave suavemente las células dos veces con PBS.
11. Añadir DAPI (concentración final de 2 mg / ml en PBS) e incubar 10 minutos para visualizar los núcleos.
12. Lave suavemente las células con PBS.
13. Añadir anti-fade Aqua-Monte antes de imagen usando un microscopio de fluorescencia invertido.

4. Aislar y expandir colonias de células iPS

1. Después de iniciar el proceso de reprogramación (como se describe en la sección 2), monitor de las culturas y reemplazar el medio cada 48 horas. Se utilizó medio de doxiciclina que contiene para cultivar las células durante los primeros doce días y luego se retira posteriormente la doxiciclina del medio para asegurarse de que las colonias de iPS manualmente elegido para la expansión sería DOX independiente.
2. Las células deben ser controlados diariamente por los cambios morfológicos indicativos del proceso de reprogramación, o cuando se utilizan células como Nanog-GFP/rtTA MEF, la morfología del monitor y fluorescencia de GFP para identificar las colonias de reprogramar. Cada experimento será diferente, pero las colonias suelen ser lo suficientemente grande como para el aislamiento de entre 16 y 22 días. Las colonias identificadas durante este período de tiempo puede ser manual aislados y trypsinized para la expansión y el análisis.
3. El día antes de aislar y trypsinizing las colonias reprogramado, preparar un plato de 24 pozos de siembra con irradiados con rayos gamma de alimentación capa MEFs a una densidad de 5 x 10 ⁴ Células por pocillo. Incubar toda la noche a 37 ° C CO y el 5% ₂.
4. Manual de selección de cada colonia y iPS trypsinize de disociar los agregados celulares. Placa de volver a las células iPS en ES / iPS medio en los distintos pozos de la placa de 24 pozos de pre-siembra con irradiados con rayos gamma de alimentación capa MEFs. Los pozos deben ser sembradas a una densidad de 2 x 10 ⁵ Células /. Se incuba a 37 ° C CO y el 5% ₂. Cambiar los medios de comunicación cada 24 horas.
5. Monitor de colonias de iPS a diario para el crecimiento y la fluorescencia de GFP. Nos incubar nuestras culturas para 6 días antes de pases.
6. Determinar que los pozos de la placa de 24 pozos de manera uniforme que expresan GFP. Los pozos que tienen una buena expresión de GFP se trypsinized y pasajes de 1:08 a 4 y placas que se han pre-siembra con irradiados con rayos gamma de alimentación capa MEFs. Estas placas se pueden utilizar para análisis de marcadores pluripotentes por la CCI y la tinción de AP.

5. Análisis inmunocitoquímico de pluripotencia

Nuestras pruebas de la CPI se llevó a cabo en células expandidas en 4 placas. Todos los volúmenes que figuran en el siguiente protocolo debe ser ajustado de acuerdo con el tamaño de la celda placa de cultivo.

1. Lave suavemente las células dos veces con PBS (sin Mg ^{2 +} + O Ca ^{2 +}).
2. Se incuban en 0,5 ml de helado de 0,2% de Tween 20 en PBS por pocillo durante 10 minutos.
3. Lave suavemente las células tres veces con PBS.
4. Bloquear la unión no específica con 200 l buffer de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente.
5. Se incuban las células con 200 ul del anticuerpo primario específico la noche a 4 ° C (en el ejemplo SSEA-1, y Nanog Oct4).
6. Lave suavemente las células dos veces con PBS.
7. Se incuban las células con 200 l de anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente, manteniéndose alejado de la luz (en el ejemplo del burro anti-ratón conjugado y rodamina burro anti-conejo conjugado Rodamina).
8. Lave suavemente las células dos veces con PBS.
9. Añadir DAPI (concentración final de 2 mg / ml en PBS) e incubar 10 minutos para visualizar los núcleos.
10. Lave suavemente las células con PBS
11. Añadir anti-fade Aqua-Monte antes de imagen usando un microscopio de fluorescencia invertido.

6. Fosfatasa alcalina (AP) La tinción de colonias de células iPS

1. Colonias de iPS a partir de la sección 4 también se puede analizar la actividad de AP utilizando kits comerciales y siguiendo el protocolo del fabricante.

Parte 7. Resultados representante

El Inducible Stemgent DOX ratón TF Set Lentivirus se puede utilizar para reprogramar a las células iPS MEFs. Después de la transducción de la MEFs, la expresión de Oct4 factores de transcripción, Sox2, Klf4 y c-Myc se pueden detectar en las células tratadas con doxiciclina (DOX +), pero poca o ninguna expresión puede ser detectada en no tratados (DOX) células (figura 1) . Los cambios morfológicos que se avance en el tiempo (12 días de tratamiento DOX en este ejemplo) para generar ES más grande, más similares a las células colonias con bordes definidos y tres colonias de crecimiento tridimensional (figura 2a). Cuando DOX se retira, hay una notable reversión de la morfología celular por alguna ES similares a las células colonias, sin embargo, muchas de las colonias mantuvieron su morfología iPS (figura 2a). Estas colonias iPS, al recogerlo y se pasaron, la pantalla típica expresión de marcadores de pluripotencia de fosfatasa alcalina (AP), Nanog, Oct4 y SSEA-1 (figura 3). El tipo de células MEF utilizados en este experimento (Nanog-GFP/rtTA células MEF) expresan GFP de la endógena lugar Nanog cuando reprogramado para el estado de pluripotencia. La expresión de GFP por lo tanto, se puede utilizar como un indicador preliminar para la reprogramación de éxito (figura 3).

Figura 1: Inmunocitoquímica (CPI), el análisis de 48 horas después de DOX inducción. El panel de la izquierda (-DOX) es un control negativo para la expresión representativa de los cuatro factores de transducción sin inducción DOX. Expresado correctamente los factores de transcripción fueron confirmados por los anticuerpos correspondientes (en rojo), se tiñeron con DAPI para visualizar el núcleo.

Figura 2: Conversión morfológica de Nanog-GFP/rtTA MEFs al estado de células iPS. A) Fase de 100x de imágenes con contraste de las células que demuestra la compactación y la conversión de MEFs en las colonias de iPS en el tiempo desde el día 3 (D3 + Dox) hasta el día 22 (D22). DOX fue retirada el día 12. Panel superior izquierdo: 20x control de la imagen negativa de la placa-DOX. B) 200x de contraste de fase y las imágenes de fluorescencia de GFP del día 18 post-destacó DOX iPS inducción colonia. C) 200x de contraste de fase y las imágenes de fluorescencia de GFP del día adicional de 18 post-DOX iPS inducción colonia.

Figura 3: Análisis de las colonias de iPS. (A) microscopio de contraste de fase y tinción de AP de una colonia de iPS (200x). (B) análisis de los marcadores de pluripotencia: panel izquierdo muestra superposición de contraste de fase con la expresión de GFP reportero de la reprogramación. GFP expresión refleja el nivel endógeno Nanog expresión. Panel central muestra la tinción de la CPI para los marcadores de pluripotencia. Panel de la derecha muestra la tinción DAPI para visualizar los núcleos (100x).

Discusión

Estos resultados demuestran que la inducible Stemgent DOX ratón TF Set Lentivirus se puede utilizar para generar eficientemente las colonias de iPS mediante la inducción de la expresión ectópica de transducidas factores de transcripción en fibroblastos embrionarios de ratón. En el diseño de experimentos de reprogramación, las variables se deben considerar varias para optimizar la eficiencia de la reprogramación. En primer lugar, es posible modificar la actividad del virus al objetivo proporción de células (es decir, MOI) durante la etapa de infección primaria para aumentar o disminuir la eficiencia de transducción, lo que afecta la cantidad de virus integrado en la población celular destinataria. En segundo lugar, ajustando la longitud de tiempo que las células son expuestas a DOX puede afectar la eficiencia de la generación de iPS colonia de células. En tercer lugar, la capacidad proliferativa de las células diana puede afectar la nueva programación, como las células que están en crecimiento activo y dividir son más susceptibles a la reprogramación. Por último, al modificar el protocolo para el número de células diferentes o diferentes platos de tamaño del tejido cultural, se recomienda que los números de las células diana se ajustará proporcionalmente a la superficie de la placa de cultivo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set	Stemgent	00-0003