4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

요약

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 셀에 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 재설 정할 수 있습니다. 다음은 마우스 프로그래밍 전사 요인 Oct4의 독스 - inducible 표현에 대한 프로토콜을 보여줍니다, Sox2, Klf4과 c - Myc은 표현하는 일반적인 MES pluripotency 마커 IPS의 식민지를 생성합니다.

초록

전사 요인과 세포 배양 조건 정의된 집합을 사용하여, 야마 나카와 동료는 레트로 바이러스 - 중재 전달과 표현 Oct4의 Sox2, C - Myc, 그리고 Klf4가 마우스 섬유아 세포에서 pluripotency 유도 할 수 있다고 증명 ^1. 후속 보고서 유틸리티를 보여준 doxycycline의 (독스) 기타 성인 마우스 체세포 유형의 다양한 기본 및 보조 모두 IPS 세포의 생성을 위해 lentiviral 전달 시스템을 inducible. ^2,3

유도 pluripotent 줄기 (IPS) 세포는 형태, 증식 및 기형 종의 형성을 유도하는 능력 배아 줄기 (ES) 세포와 유사합니다. 세포의 두 종류의 재생 의료의 차별화된 세포 또는 조직의 생성에 대한 pluripotent 시작 재료로 사용할 수 있습니다.들이의 윤리적 딜레마없이 ES 세포의 주요 특성을 전시 등 ^4-6 IPS 세포는 또한 ES 세포에 비해 뚜렷한 이점을 가지고 배아 파괴.

여기서 우리는 Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF Lentivirus 세트와 마우스 배아 fibroblast (MEF) 세포를 프로그래밍을위한 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 또한 Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트는 따라서 ES 세포의 특징 pluripotency 마커를 표시하는 pluripotent 줄기 세포 상태를 유도 MEFs로 도입에 따라 네 개의 전사 요소의 각을 표현 할 수 있다고 설명합니다.

프로토콜

1. MEFs의 바이러스 전달

일 ₂ O. 37 밤새 번호판을 품어 ° C와 5% CO ₂.
1. 4x10의 밀도에 젤라틴 코팅 접시, 그리고 종자 MEF 세포 (우리가 Nanog-GFP/rtTA MEF 세포를 사용)에서 액체를 기음 ⁵ 접시 당 세포. 에 대한 MEF 성장 매체 30 ML (450ml DMEM 50 ML FBS, 5 ML 100x 아닌 필수 아미노산, 5 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 5 ML 200 MM L - 글루타민과 0.5 ML 55mM β - 메르 캅 토 에탄올과 보충)에 세포를 품어 37 ° C와 5 % CO 이틀 ₂ 약 80 %까지 합류.
2. 매체 기음과 집중 lentivirus (4 X 100 μl 바이러스 재고 솔루션 + 29.6 ML 성장 매체)에 보충 MEF 성장 매체 30 ML를 추가합니다. 매체도 배포를 보장하기 위해 부드럽게 요리를 록. 37 밤새 세포를 품어 ° C와 5% CO ₂.

2. Doxycycline 유도 프로그래밍

1. 20~24시간 포스트 도입, (450 ML 마네 DMEM은 50ml ES 세포 - 자격을 갖춘 송아지 혈청, 5 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 5 분 200 XG에서 원심 분리기를 transduced 세포를 trypsinize 및 ES / IPS 성장 매체 resuspend 5 ML 200 MM의 L - 글루타민, 0.5 ML의 β - 메르 캅 토 에탄올 25 μl 난생). 씨앗은 (우리가 2.5 X 10을 사용 세포 배양 접시의 크기에 적절한 농도에서 MEF의를 transduced ^{5 전지 4 ICC 실험 4 잘 접시에 잘 당 세포). 37 ° C와 5 % CO에서 밤새 품어 ₂. 참고 : 나머지 transduced 세포는 향후 분석을 위해 액체 질소에 냉동 수 있습니다.}
2. 매체 대기음 및 ES / IPS 매체 신선한 준비하고 (우리는 또한 대조군으로 독스없이 매체를 추가) 2 μg / ML의 최종 농도 doxycycline와 보완과 대체합니다. 37 ° C와 5 % CO에서 알을 품다 ₂.

3. 형질 도입 효율 Immunocytochemical 분석

48시간, immunohistochemistry (ICC)에 의해 전달의 효율성을 결정합니다. 네 잘 접시에 replated 세포에 대한 ICC 테스트를 수행합니다. 다음 프로토콜에 나열된 모든 볼륨은 세포 배양 플레이트 크기에 따라 조정되어야합니다.

1. (MG없이 PBS로 가볍게 한 번 세포 와시 ^{2 +} + 또는 칼슘 ^{2 +}).
2. 상온에서 15 분간 PBS에서 0.5 ML 4 % paraformaldehyde 500 μl로 세포를 고정한다.
3. 부드럽게 두 번은 PBS로 세포를 씻으십시오.
4. PBS에서 얼음처럼 차가운 0.2 % 트윈 ® -20 500 μl를 추가하여 세포를 Permeabilize. 실온에서 10 분 알을 품다.
5. 부드럽게 두 번은 PBS로 세포를 씻으십시오.
6. 상온에 한 시간 동안 200 μl 차단 버퍼가 아닌 특정 바인딩을 차단합니다.
7. 4 박 특정 차 항체 200 μl와 세포를 품어 ° C (우리가 Oct4를 사용, Klf4, Sox2 및 C - Myc).
8. 부드럽게 두 번은 PBS로 세포를 씻으십시오.
9. (우리가 돈키 방지 래빗 Rhodamine의 공액를 사용하여, 돈키 방지 염소 빛으로부터 접시를 보호, 실온에서 1 시간 동안 이차 항체 200 μl와 세포를 품어 AlexaFluor ® 594 공액, 돈키 방지 마우스 Rhodamine 공액과 동키의 안티 - 래빗 Rhodamine 공액).
10. 부드럽게 두 번은 PBS로 세포를 씻으십시오.
11. 추가 DAPI (최종 농도 2 PBS에서 μg / ML)과 핵을 시각화하기 위해 10 분 알을 품다.
12. PBS로 부드럽게 세포를 씻으십시오.
13. 이미지가 거꾸로 형광 현미경을 사용하기 전에 방지 퇴색 아쿠아 마운트를 추가합니다.

4. 분리 및 IPS 세포 식민지를 확대

1. 프로그래밍 과정을 시작하면 (같은 제 2의 설명에), 문화를 모니터링하고 중간마다 48 시간을 바꿉니다. 우리는 첫 번째 십이일에 대한 문화 세포를 doxycycline 들어있는 매체를 사용하고 이후에 IPS 식민지 수동 독스 독립적인 것입니다 확장을 위해 선택한 수 있도록 매체에서 doxycycline를 제거했습니다.
2. 세포 프로그래밍 과정을 나타내는 형태학의 변경 사항을 매일 모니터링해야하거나 Nanog-GFP/rtTA MEF, 모니터 형태학 및 재설정 식민지를 식별하는 GFP의 형광과 같은 세포를 사용하는 경우. 각각의 실험이 다를 수 있지만, 식민지는 16 22 일 사이 절연을 위해 일반적으로 충분히 큰 수 있습니다. 이 시간 프레임 동안 식별된 식민지 다음 수동으로 고립 및 확장 및 분석을위한 trypsinized 수 있습니다.
3. 재설정 식민지를 분리하고 trypsinizing 전에 하루, 5 X 10의 밀도에 감마 조사 피더 레이어 MEFs와 시딩하여 24 잘 플레이트를 준비 ⁴ 잘 당 세포. 37 ° C와 5 % CO에서 밤새 품어 ₂.
4. 직접 각 IPS 콜로니를 선택하고 셀 집계를 떼어 놓다하는 trypsinize. 24 잘 판 감마 조사 피더 레이어 MEFs 사전 씨앗의 개별 웰스의 ES / IPS 매체 재 판 IPS 세포. 웰스 2 X 10의 밀도에 씨앗을해야합니다 ^{5 세포 /. 37 ° C와 5 % CO에서 알을 품다 ₂. 미디어에게 24 시간마다 변경합니다.}
5. 성장과 GFP의 형광을위한 일일 모니터 IPS 식민지. 우리는 passaging 이전 6 일간의 문화를 품다.
6. 24 잘 접시의 우물이 균일하게 GFP를 표현하는 확인합니다. 좋은 GFP 발현을 가지고 웰스는 감마 조사 피더 레이어 MEFs 사전 씨앗을 품고있다 4 잘 접시에 trypsinized 및 1시 8분을 passaged 수 있습니다. 이 접시는 ICC와 AP의 얼룩으로 pluripotent 마커 분석에 사용할 수 있습니다.

5. Pluripotency에 대한 Immunocytochemical 분석

저희 ICC 테스트는 4 잘 접시 확대 세포에서 실시되었다. 다음 프로토콜에 나열된 모든 볼륨은 세포 배양 플레이트 크기에 따라 조정되어야합니다.

1. (MG없이 PBS로 두 번 가볍게 세포 와시 ^{2 +} + 또는 칼슘 ^{2 +}).
알을 품다.
2. PBS로 세포에게 부드럽게 세 번 씻으십시오.
3. 상온에 한 시간 동안 200 μl 차단 버퍼가 아닌 특정 바인딩을 차단합니다.
4. 4 박 특정 차 항체 200 μl와 세포를 품어 ° C (우리가 SSEA - 1, Nanog와 Oct4를 사용).
5. 부드럽게 두 번은 PBS로 세포를 씻으십시오.
6. 조명 (우리가 돈키 방지 마우스 Rhodamine 공액과 동키의 안티 래빗 Rhodamine의 공액를 사용)에서 멀리 유지, 실온에서 1 시간 동안 이차 항체 200 μl와 세포를 품어.
7. 부드럽게 두 번은 PBS로 세포를 씻으십시오.
8. 추가 DAPI (최종 농도 2 PBS에서 μg / ML)과 핵을 시각화하기 위해 10 분 알을 품다.
9. PBS로 부드럽게 세포 와시
10. 이미지가 거꾸로 형광 현미경을 사용하기 전에 방지 퇴색 아쿠아 마운트를 추가합니다.

6. IPS 세포 콜로니의 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (AP) 스테 이닝

IPS 식민지는 AP 활동 상용 키트를 활용하여 제조 업체의 프로토콜을 다음의 분석하실 수 있습니다.

7 부. 대표 결과

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트는 IPS 세포에 MEFs를 재설 정할 수 있습니다. MEFs, 전사 요인 Oct4 표현의 도입 후, Sox2, Klf4과 c - Myc가 doxycycline로 치료 세포에 감지가 가능하다 (독스 +)하지만, 거의 없거나 전혀없는 표현은 치료 (독스 -) 전지 (그림 1)에서 감지할 수 있습니다 . 형태학의 변화는 정의된 콜로니 가장자리와 입체 성장 (그림 2A)로 세포와 같은 식민지 더 크고 ES를 생성하는 시간 (이 예제에서는 독스 치료 12 일) 동안 진행됩니다. 독스가 제거되면, 일부 ES 세포와 같은 식민지에 대한 세포 형태의 눈에 띄게 복귀있다하지만, 식민지의 많은들은 IPS의 형태 (그림 2A)을 유지. 이러한 IPS 식민지가 들어서 passaged 때, 알카라인 인산 가수 분해 효소 (AP), Nanog, Oct4와 SSEA - 1 (그림 3)의 전형적인 pluripotency 표시자 표현을 표시합니다. pluripotency 상태로 재설정하면 내생 Nanog의 로커스에서이 실험 (Nanog-GFP/rtTA MEF 세포) 표현 GFP에서 사용 MEF 세포의 유형입니다. GFP 발현 따라서 성공적인 프로그래밍 (그림 3)에 대한 예비 지표로 사용할 수 있습니다.

그림 1 : Immunocytochemistry (ICC) 분석 48 시간 이후 독스 유도. 맨 왼쪽 패널 (- 독스)는 독스 유도하지 않고 네 개의 전달 요소의 표현에 대한 대표적인 부정적인 컨트롤입니다. 올바르게 표현 전사 요소가 핵을 시각화하기 위해 DAPI 물들일 해당하는 항체 (빨간색으로 표시)에 의해 확인되었다.

그림 2 : 형태학의 전환. 일 22 일 (D22)에 일 3 시간이 지남에 따라 IPS 식민지로 압축 및 MEFs의 전환 (D3 + 독스)를 보여주는 세포) 100x 위상 콘트라스트 이미징. 독스는 12 일 철회했다. 왼쪽 상단 패널 : 20x 대조군 이미지에서 - 독스 판. B) 200x 위상 대비 및 강조 하루의 GFP 형광 이미지 18 포스트 독스 유도 IPS 콜로니. C) 200x 위상 콘트라스트와 추가 그날의 GFP 형광 이미지 18 포스트 독스 유도 IPS 콜로니.

그림 3 : 분석. (A) 위상 콘트라스트 현미경과 IPS 콜로니 (200x)의 AP의 얼룩. (B) Pluripotency 마커 분석 : 왼쪽 패널 GFP 프로그래밍 기자 표정으로 위상 콘트라스트 오버레이를 보여줍니다. GFP 표현은 내생 Nanog 표현 수준을 반영합니다. 중간 패널 pluripotency 마커에 대한 ICC의 얼룩을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 DAPI는 핵 (100x) 시각화하는 염색법 보여줍니다.

토론

이러한 결과는 생쥐 배아 섬유아 세포에서 전사 요소를 transduced Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트가 효율적으로의 이소성 표현을 유도하여 IPS의 식민지를 생성하는 데 사용할 수있는 것을 보여줍니다. 프로그래밍 실험을 설계할 때, 몇 가지 변수는 프로그래밍의 효율성을 최적화하는 것으로 간주되어야합니다. 첫째, 따라서 대상 셀 인구에 통합 바이러스의 숫자에 영향을 미치는, 전달 효율을 증가 또는 감소에 대한 기본 감염 단계에서 활성 바이러스 - 투 - 대상 세포 비율 (예 : 뫄)을 수정할 수 있습니다. 둘째, 세포 독스에 노출되는 시간의 길이를 조정하면 IPS 세포 콜로니 생성의 효율성에 영향을 줄 수 있습니다. 적극적인 성장과 분열 아르 셀 프로그래밍에 더 많은 의무가 있으므로 셋째, 대상 세포의 proliferative 용량, 프로그래밍 영향을 줄 수 있습니다. 마지막으로, 다른 휴대 전화 번호 또는 다른 크기의 조직 문화 요리에 대한 프로토콜을 수정할 때, 그것은 대상 셀 번호가 문화 요리의 표면 영역에 비례 조정하는 것이 좋습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set	Stemgent	00-0003