Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путем перепрограммирования мышиных эмбриональных фибробластов с Четыре фактора транскрипции, доксициклин индуцибельной лентивирусов системы трансдукция

Резюме

Stemgent индуцибельной Dox Мышь TF лентивирус Установить можно перепрограммировать мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs) для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPS) клеток. Здесь показано, протокол для DOX-индуцибельной экспрессии мыши перепрограммирования транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Myc для получения плюрипотентных колоний, которые выражают общие МЧС плюрипотентности маркеров.

Аннотация

Использование определенного набора транскрипционных факторов и условий, культуры клеток, Яманака и его коллеги показали, что ретровирус-опосредованного доставки и экспрессии Oct4, Sox2, с-Myc, и Klf4 способен вызывать плюрипотентности в мышиных фибробластов. ¹ В последующих докладах показал полезность от доксициклина (DOX) индуцибельной лентивирусов системы доставки для генерации первичных и вторичных плюрипотентных клеток из множества других взрослых мышей типов соматических клеток. ^2,3

Индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клетки похожи на эмбриональные стволовые (ЭС) клеток в морфологии, распространения и способность вызывать образование тератомы. Оба типа ячейки может быть использован в качестве плюрипотентных исходным материалом для поколения дифференцированных клеток или тканей, в регенеративной медицине. ^4-6 плюрипотентных клеток, также имеют явное преимущество перед ЭС клетки, как они проявляют основные свойства ЭС клеток без этической дилеммой зародыш разрушения.

Здесь показано, протокол для перепрограммирования мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) клетки с индуцибельной Stemgent DOX мыши Установить TF лентивирусов. Мы также показали, что Stemgent индуцибельной DOX Мышь TF лентивирус Установить способен выразить каждому из четырех факторов транскрипции на трансдукции в MEFs тем самым вызывая состояние плюрипотентных стволовых клеток, который отображает характерные маркеры плюрипотентности ЭС клеток.

протокол

1. Вирусный трансдукции MEFs

1. За день до начала эксперимента, пальто 15 см клеточных культур блюдо с 0,2% желатина стерильно фильтруют в DDH ₂ О. Инкубируйте планшет в течение ночи при 37 ° С и 5% CO ₂.
2. Аспирацию жидкости из желатина покрытием блюдо, и клетки семенных MEF (мы использовали Nanog-GFP/rtTA MEF клеток) с плотностью 4x10 ⁵ Клеток на блюдо. Инкубируйте клетки в 30 мл среды роста MEF (450 мл DMEM дополнена с 50 мл ФБС, 5 мл 100x без незаменимых аминокислот, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл 200 мМ L-глутамина и 0,5 мл 55 β-меркаптоэтанол) для Два дня при температуре 37 ° С и 5% CO ₂ Примерно до 80% вырожденная.
3. Аспирируйте средних и добавить 30 мл MEF роста среде, дополненной сосредоточены лентивирус (4 х 100 мкл исходного раствора вирус + 29,6 мл питательной среды). Рок блюдо осторожно, чтобы обеспечить равномерное распределение среды. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% CO ₂.

2. Доксициклин Индуцированные Перепрограммирование

1. 20-24 часов после трансдукции, trypsinize трансдуцированных клеток, центрифуги при 200 мкг в течение 5 минут и ресуспендируют в ES / IPS ростовой среде (450 мл Нокаут DMEM дополнен 50мл ЭСК высококвалифицированных телячьей сыворотки, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл 200 мМ L-глутамина, 0,5 мл β-меркаптоэтанола и 25 мкл LIF). Семенной трансдуцированных MEF по адресу соответствующей концентрации на размер тарелки культуры клеток (мы использовали 2,5 х 10 ⁵ Клеток на 10 см блюдо для перепрограммирования эффективности экспериментов и колонии изоляции, и 2 х 10 ⁴ Клеток на лунку в 4-х луночных для экспериментов МУС). Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% CO ₂. Примечание: все оставшиеся трансдуцированных клетки могут быть заморожены в жидком азоте для последующего анализа.
2. Аспирируйте средних и замените ES / IPS среду приготовить свежую и дополнены доксициклин, чтобы конечная концентрация 2 мкг / мл (мы также добавили среды без DOX в качестве отрицательного контроля). Инкубировать при 37 ° С и 5% CO ₂.

3. Иммуноцитохимическая Анализ эффективности трансдукции

48 часов после доксициклин индукцию, определить эффективность трансдукции иммуногистохимии (МУС). Провести тестирование МТП на клетки replated в 4 и пластин. Все тома, перечисленные в следующий протокол должен быть скорректирован в зависимости от размера пластины культуре клеток.

1. Мойте клетки мягко сразу с PBS (без Mg ^{2 +} + Или Са ^{2 +}).
2. Устранение клеток с 500 мкл 0,5 мл 4% параформальдегида в PBS в течение 15 минут при комнатной температуре.
3. Мойте клетки мягко два раза с PBS.
4. Permeabilize клетки путем добавления 500 мкл ледяной 0,2% Tween ® -20 в PBS. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
5. Мойте клетки мягко два раза с PBS.
6. Блок неспецифического связывания с 200 мкл блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре.
7. Инкубируйте клетки с 200 мкл конкретных первичных антител в течение ночи при 4 ° С (мы использовали Oct4, Klf4, Sox2 и с-Myc).
8. Мойте клетки мягко два раза с PBS.
9. Инкубируйте клетки с 200 мкл вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре, защищая от света пластин (мы использовали Donkey анти-кролик родамина сопряжены, Осел анти-Коза AlexaFluor ® 594 сопряжены, Осел анти-Mouse родамина сопряженной и Осел анти -Кролик родамина сопряжены).
10. Мойте клетки мягко два раза с PBS.
11. Добавить DAPI (конечная концентрация 2 мкг / мл в PBS) и инкубировать 10 минут для визуализации ядер.
12. Мойте клетки осторожно PBS.
13. Добавить анти-Fade Аква-гора до визуализации с использованием перевернутой флуоресцентного микроскопа.

4. Изоляция и расширение колоний плюрипотентных сотовый

1. После инициирования процесса перепрограммирования (как описано в разделе 2), монитор культур и заменить среды каждые 48 часов. Мы использовали доксициклин среде, содержащей в культуру клеток для первых двенадцати дней, а затем последовательно удаляется доксициклина из среды для того, чтобы плюрипотентных колонии вручную выбрал для расширения будет DOX независимыми.
2. Ячейки должны контролироваться ежедневно в течение морфологических изменений свидетельствует о перепрограммировании процесса, или когда с использованием клеток, как Nanog-GFP/rtTA MEF, контролировать морфологию и флуоресценции GFP для выявления перепрограммировать колоний. Каждый эксперимент будет отличаться, но колониях, как правило, достаточно большой для изоляции от 16 до 22 дней. Колонии, выявленные в ходе этого срока могут быть выделены и вручную трипсинизировали для расширения и анализа.
3. За день до выделения и trypsinizing перепрограммировать колоний, подготовить 24-луночного планшета путем посева с гамма-облучении фидерного слоя MEFs при плотности 5 х 10 ⁴ Клеток на лунку. Выдержите в течение ночи при 37 ° С и 5% CO ₂.
4. Вручную подобрать каждой колонии КП и trypsinize отделить клеточных агрегатов. Re пластины плюрипотентных клеток в ES / IPS среды в отдельных скважинах 24-луночного планшета предварительно отобранный с гамма-облучении фидерного слоя MEFs. Уэллс должны быть посеяны при плотности 2 х 10 ⁵ Клеток / лунку. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO ₂. Изменение средств массовой информации каждые 24 часа.
5. Монитор плюрипотентных колоний в день в течение роста и GFP флуоресценции. Мы инкубировать наших культур в течение 6 дней до пассажей.
6. Определите, какие скважины 24-луночного планшета равномерно выражения GFP. Уэллс, которые имеют хорошее выражение GFP может быть трипсином и пассировать 1:08 на 4-луночных планшетах, которые были предварительно отобранный с гамма-облучении фидерного слоя MEFs. Эти плиты могут быть использованы для анализа плюрипотентных маркеров МТП А. П. окрашивания.

5. Иммуноцитохимическая Анализ плюрипотентности

Наша МТП Тестирование проводилось на клетках расширен в 4 и пластин. Все тома, перечисленные в следующий протокол должен быть скорректирован в зависимости от размера пластины культуре клеток.

1. Мойте клетки мягко два раза PBS (без Mg ^{2 +} + Или Са ^{2 +}).
2. Инкубируйте в 0,5 мл ледяной 0,2% Твин-20 в PBS на скважину в течение 10 минут.
3. Мойте клетки мягко три раза PBS.
4. Блок неспецифического связывания с 200 мкл блокирующего буфера в течение одного часа при комнатной температуре.
5. Инкубируйте клетки с 200 мкл конкретных первичных антител в течение ночи при 4 ° С (мы использовали SSEA-1, Nanog и Oct4).
6. Мойте клетки мягко два раза с PBS.
7. Инкубируйте клетки с 200 мкл вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре, держась подальше от света (мы использовали Donkey анти-Mouse родамина сопряженной и Осел анти-кролик родамина сопряжены).
8. Мойте клетки мягко два раза с PBS.
9. Добавить DAPI (конечная концентрация 2 мкг / мл в PBS) и инкубировать 10 минут для визуализации ядер.
10. Мойте клетки осторожно PBS
11. Добавить анти-Fade Аква-гора до визуализации с использованием перевернутой флуоресцентного микроскопа.

6. Щелочной фосфатазы (AP) Окрашивание колоний плюрипотентных сотовый

1. Плюрипотентных колонии из раздела 4 также могут быть проанализированы для AP деятельности с использованием коммерчески доступных наборов и следующий протокол производителя.

Часть 7. Представитель Результаты

Stemgent индуцибельной DOX Мышь TF лентивирус набор может быть использован для перепрограммирования MEFs для плюрипотентных клеток. После трансдукции MEFs, экспрессия транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и с-Myc могут быть обнаружены в клетках, обработанных доксициклин (DOX +), но мало или совсем не выражение может быть обнаружена в необработанном (DOX-) клеток (рисунок 1) . Морфологические изменения будут прогрессировать с течением времени (12 дней DOX лечения в данном примере) для создания более крупных и ЭСК-подобных колоний с определенными колонии края и трехмерного роста (рис. 2а). Когда DOX удаляется, есть заметные возврат клеточной морфологии для некоторых ЭСК-подобных колоний, однако, многие из колонии сохранили свои плюрипотентных морфологии (рис. 2а). Эти плюрипотентных колоний, при поднятии и пассировать, показ типичных плюрипотентности выражение маркером щелочной фосфатазы (AP), Nanog, Oct4 и SSEA-1 (рис. 3). Тип MEF клетки, используемые в данном эксперименте (MEF Nanog-GFP/rtTA клеток) выразить GFP из эндогенных локус Nanog когда перенесена на плюрипотентности государства. GFP выражение может быть использован в качестве предварительных индикаторов для успешного перепрограммирования (рис. 3).

Рисунок 1: Иммуноцитохимическая (МУС) анализ 48 часов после DOX индукции. Крайней левой панели (-DOX) является представителем отрицательного контроля для выражения четырех факторов трансдукции без DOX индукции. Правильно выразил транскрипционных факторов были подтверждены соответствующими антителами (показаны красным), окрашивали DAPI визуализировать ядра.

Рисунок 2: Морфологические преобразования Nanog-GFP/rtTA MEFs государству ячейки IPS. ) 100x изображений фазового контраста клеток демонстрируя уплотнения и преобразования MEFs в колонии плюрипотентных в течение долгого времени изо дня 3 (D3 + DOX) в день 22 (D22). DOX был снят на 12 день. Верхняя левая панель: 20x негативный образ управления из-DOX пластины. В) 200x фазового контраста и флуоресценции GFP изображения выделены 18 день после DOX индукции плюрипотентных колонии. С) 200x фазового контраста и флуоресценции GFP изображений дополнительных 18 день после DOX индукции плюрипотентных колонии.

Рисунок 3: Анализ колонии IPS. () Этап микроскопии контрастность и А. П. окрашивание колонии IPS (200x). (B) плюрипотентности анализа маркера: Левая панель показывает фазового контраста наложения с GFP перепрограммирования репортер выражения. GFP выражение отражает эндогенной экспрессии Nanog уровне. Ближний панель показывает МТП окрашивание на маркеры плюрипотентности. Правая панель показывает DAPI окрашивания для визуализации ядер (100x).

Обсуждение

Эти результаты показывают, что Stemgent DOX индуцибельной Мышь TF лентивирус Установить может использоваться для эффективной генерации плюрипотентных колонии, вызывая внематочной выражение трансдуцированных факторов транскрипции в мышиных эмбриональных фибробластов. При проектировании перепрограммирования экспериментов, несколько переменных следует рассматривать оптимизировать эффективность перепрограммирования. Во-первых, можно изменить активный вирус к клетке-мишени отношение (т.е. МВД) во время первичной инфекции шаг для увеличения или уменьшения эффективности трансдукции, влияя тем самым ряд комплексных вирусов в популяции клеток-мишеней. Во-вторых, регулируя длину времени клетки подвергаются воздействию DOX может повлиять на эффективность работы ОЭС поколения колонии клеток. В-третьих, способность к пролиферации клеток-мишеней может повлиять перепрограммирования, так как клетки, которые активно растут и деления более поддаются перепрограммированию. И наконец, при изменении протокола для разных номеров клетки или различные блюда ткани размером культуры, рекомендуется, что числа клеток-мишеней быть скорректирована пропорционально площади поверхности культуры блюдо.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set	Stemgent	00-0003